一种可逆转肿瘤耐药的肿瘤主动靶向纳米递药系统的利记博彩app
【专利摘要】本发明提供了一种可逆转肿瘤耐药的肿瘤主动靶向纳米递药系统。此递药系统为脂质混合PLGA纳米粒，该纳米粒内核为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)，表面插入AA-聚乙二醇-胆固醇连接物和三苯基膦-胆固醇连接物，并将阿霉素(DOX)包裹于脂质混合PLGA纳米粒中得到载药纳米粒。此递药系统具有酸敏特性，能够主动识别肿瘤细胞，可将阿霉素同时定位释放于肿瘤细胞线粒体和细胞核，增强抗肿瘤活性，并逆转肿瘤耐药，为提高阿霉素疗效提供新策略。
【专利说明】一种可逆转肿瘤耐药的肿瘤主动靶向纳米递药系统
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种可逆转肿瘤耐药的肿瘤主动靶向纳米递药系统的处方组成及应 用方案，递药系统为包裹阿霉素（DOX)的新型脂质混合聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA)纳 米粒。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是严重威胁人类健康的一类疾病。阿霉素（DOX)是肿瘤化疗的一线药物，疗 效确切、价格低廉，但阿霉素对正常组织的毒副作用和易耐药的特点限制了其临床应用。因 此，以阿霉素为研究对象，构建兼具肿瘤靶向和酸敏特性的新型递药系统，增加阿霉素在肿 瘤组织的含量，降低其在正常组织的分布，并逆转耐药，得到高效低毒的新型肿瘤靶向递药 系统。
[0003]纳米递药系统因其被动靶向特性广泛应用于肿瘤靶向递药系统中。常用的纳米递 药系统包括纳米粒、聚合物胶束等。聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA)具有无免疫原性、可 生物降解等特性，已被美国食品与药品监督管理局和欧洲医药管理局批准用于静脉注射。 PLGA可包裹小分子化疗药物、基因、蛋白等形成纳米粒，但PLGA纳米粒的载药量低、亲水性 差、在血液循环中易被免疫系统清除，且进入细胞内易被溶酶体捕获，降低了药物的传递效 率和疗效。脂质混合PLGA纳米粒是近年的研究热点，通过在PLGA纳米粒表面嵌入功能化 的混合脂质，使纳米粒兼具肿瘤靶向、长效稳定、溶酶体逃逸等多种功能。
[0004] 肿瘤产生多药耐药是化疗失败的首要原因。化疗代表药物阿霉素的主要作用靶点 为细胞核，肿瘤细胞产生耐药性时，阿霉素在到达作用靶点前被泵出细胞外而失活。因此， 找寻其它作用靶点，提高阿霉素在胞内的有效浓度是逆转耐药的手段之一。研究发现阿霉 素可分布于线粒体，通过增加活性氧自由基生成，损伤线粒体呼吸链等途径导致线粒体损 伤，诱导细胞凋亡。因此，设计线粒体靶向的阿霉素复合物或递药系统可逆转耐药。阳离子 脂质化合物（3-丙羧基）三苯基溴化膦（TPP)对线粒体具有很高的亲和力，若将TPP与载 体材料连接可得到线粒体靶向的递药系统，从而改变DOX的胞内分布，并逆转耐药。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种可逆转肿瘤耐药的肿瘤主动靶向纳米递药系统。通过递 药系统的设计，可提高阿霉素的在肿瘤细胞的有效浓度，降低药物在正常组织的分布，逆转 耐药，从而得到高效、低毒、逆转耐药的递药系统，为抗肿瘤药物开发提供新思路。
[0006]本发明的技术方案是：一种可逆转肿瘤耐药的肿瘤主动靶向纳米递药系统，其特 征是递药系统是脂质混合PLGA纳米粒，纳米粒的核为聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA)，表 面嵌入对甲氧基苯甲酰胺-聚乙二醇-胆固醇连接物（AA-PEG-hyd-CHEMS)和三苯基膦-胆 固醇连接物，其中
[0007] (1)对甲氧基苯甲酰胺-聚乙二醇-胆固醇连接物（AA-PEG-hyd-CHEMS)的制备方 法是：
[0008] 称取氨基己酸溶解于无水二氯甲烷中；另称取对甲氧基苯甲酰氯溶于无水二氯甲 烧中，缓慢加入到上述反应液中，搅拌反应12小时后停止反应，真空旋转蒸干反应液；用适 量乙酸乙酯溶解反应物，加入0. 5M的盐酸溶液洗涤，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥，过 滤除去硫酸钠，蒸干有机相，硅胶色谱柱纯化得到对甲氧基苯甲酰胺基己酸；将N，N-二环 己基碳二亚胺和4-二甲胺基吡啶（DCC/DMAP)溶于二氯甲烷中，加入对甲氧基苯甲酰胺基 己酸，活化6小时后加入末端经氨基修饰的聚乙二醇（NH2-PEG-NH2)，同时加入适量三乙胺， 继续反应12小时后停止反应，过滤，蒸干反应液。向反应物中加入适量甲醇，透析，冻干得 到AA-PEG-NH2 ;另称取适量乙酰基苯甲酸，溶于二氯甲烷，加入DCC/DMAP，反应液活化6小 时后加入AA-PEG-NH2，同时加入适量三乙胺，反应结束后，过滤，蒸干反应液，用适量甲醇重 新溶解产物，透析，冻干，得到AA-PEG-对乙酰基苯甲酸；
[0009] 称取胆固醇溶解于二氯甲烷中，依次加入丁二酸酐、DMAP、三乙胺，室温搅拌反应； 反应结束后，硅胶色谱柱纯化得到胆固醇-琥珀酸单酯（Chol-suc);将Ch〇l-Suc、DCC、DMAP 溶解于二氯甲烷中，活化6小时后加入肼基甲酸叔丁酯（BOC-NH-NH2)和三乙胺，反应结束 后用硅胶色谱柱纯化得到胆固醇-琥珀酸-NHNHB0C;将上述产物溶于二氯甲烷，加入三氟 乙酸，常温反应2小时，反应结束后加入水相洗去三氟乙酸，再用二氯甲烷萃取反应液，收 集有机相，干燥、蒸干得到胆固醇-琥珀酰肼（Chol-NHNH2);
[0010] 称取AA-PEG-对乙酰基苯甲酸以及Chol-NH-NH2溶于二氯甲烷中，加入少量三氟 乙酸，搅拌反应，反应结束后，蒸干反应液，用少量甲醇溶解，透析冻干得到具有酸敏特性的 终产物对甲氧基苯甲酰胺-聚乙二醇-胆固醇连接物（AA-PEG-hyd-CHEMS);
[0011] (2)三苯基膦-胆固醇连接物（TPP-CHEMS)的制备方法是：
[0012] 将（3-丙羧基）三苯基溴化膦与DCC/DMAP溶于二氯甲烷中，活化6小时后加入 己二胺，反应24小时后停止反应，过滤，蒸干反应液，硅胶柱层析纯化得到中间体；另取胆 固醇-琥珀酸单酯溶于二氯甲烷中，加入DCC/DMAP活化6小时后加入上述中间体，反应 24小时后停止反应，过滤，蒸干反应液，硅胶柱层析纯化得到三苯基膦-胆固醇琥珀酸酯 (TPP-CHEMS)；
[0013] (3)脂质混合PLGA纳米粒的制备方法是：
[0014]称取一定量的PLGA、TPP-CHEMS与AA-PEG-hyd-CHEMS溶于二氯甲烷中（V1)，另将 盐酸阿霉素溶于蒸馏水中（v2,V1SV2)，混合上述液体，超声，再加入3%的聚乙烯醇（PVA， V3，V3彡V1)，超声，转移到烧杯中，室温搅拌3h，离心（15000rpm, 15min)，得到的沉淀用蒸馈 水冲洗三次，用蒸馏水重新分散，即得纳米粒。
[0015] 本发明设计一种新型纳米递药系统，此递药系统是脂质混合PLGA纳米粒，纳米粒 结构包括PLGA、AA-聚乙二醇-胆固醇连接物（AA-PEG-hyd-CHEMS)以及TPP-CHEMS。该纳 米粒具有主动祀向特性，可增加sigma受体高表达肿瘤细胞对阿霉素的摄取，进入耐药肿 瘤细胞后，在溶酶体中纳米粒表面具有酸敏特性的AA-PEG-hyd-CHEMS发生水解，纳米粒表 面电荷发生反转，表面暴露出具有线粒体定位功能的TPP-CHEMS，从而将递药系统送至线粒 体和细胞核，释放阿霉素发挥逆转耐药活性。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1是脂质混合PLGA纳米粒在不同pH介质中的Zeta电位。η= 3,、〈0·01，vs ρΗ7· 4。
[0017] 图2是D0X、负载DOX的脂质混合PLGA纳米粒（LNPs-I)及负载DOX的PLGA纳米 粒（NNPs)对A549细胞⑷和！fepG2细胞⑶的细胞毒性评价。η= 6广ρ〈0· 0?/ρ〈0· 05， vs等剂量DOX;##ρ〈0· 01，#ρ〈0· 05,vs等剂量LNPs-1。
[0018] 图3是D0X、负载DOX的脂质混合PLGA纳米粒（LNPs-I)及负载DOX的PLGA纳米 粒（NNPs)对耐药细胞MDA-MB-231/ADR细胞的细胞毒性。η= 6,、〈0. 0l/p〈0. 05,vs等 剂量DOX;##ρ〈0· 01，#ρ〈0· 05,vs等剂量LNPs-I。
[0019] 图4是DOX(C)和负载DOX的脂质混合PLGA纳米粒⑶在MDA-MB-231/ADR细胞 中的摄取和亚定位示意图。
[0020] 图5是D0X、负载DOX的脂质混合PLGA纳米粒（LNPs-I)对荷瘤裸鼠（移植耐药细 胞MDA-MB-231/ADR)肿瘤生长的抑制作用。
【具体实施方式】
[0021] 阿霉素肿瘤靶向递药系统的制备及抗肿瘤活性研究
[0022] 1目的：评价负载DOX脂质混合PLGA纳米粒的抗肿瘤活性。
[0023] 2研究方法：
[0024] 2· 1包封率及载药量测定
[0025] 将纳米粒溶于DMSO中，破坏纳米粒结构，HPLC-MS/MS法检测包封率和载药量。
[0026] 载药量=(递药系统中包裹的药物量/载药递药系统重量）X100%
[0027] 包封率=(实际载药量/投药量）Χ100%
[0028]2. 2酸敏特性评价
[0029] 称取脂质混合PLGA纳米粒，激光粒度仪分析在不同pH(pH5. 0,pH6. 5和pH7. 4) 介质中脂质混合PLGA纳米粒的Zeta电位。
[0030] 2. 3细胞毒性评价
[0031] 分别培养人肺癌A549细胞、肝癌H印G2细胞、耐阿霉素乳腺癌MDA-MB-231/ADR细 胞。取对数生长期细胞接种于96孔板中，密度为IX104,培养24h后分别加入阿霉素、负载 阿霉素脂质混合PLGA纳米粒、负载阿霉素的PLGA纳米粒，不含血清的培养液设为空白对照 组，48h后加入20μLMTT继续孵育4h，弃去培养液，用150μLDMSO溶解紫色结晶，酶标仪 于490nm下读取OD值，绘制细胞存活率曲线图，按公式计算细胞存活率。
[0032] 细胞存活率（％ )=(试验组OD值/空白对照组OD值）X100%
[0033] 2. 4药物在肿瘤细胞内亚定位评价
[0034] 取对数生长的MDA-MB-231/ADR细胞接种至载有载玻片的细胞培养板中，24h后加 入阿霉素、载有阿霉素的脂质混合PLGA纳米粒，继续孵育4h后，除去培养液，加入细胞核染 料DAPI染色lOmin，PBS冲洗3遍，线粒体染料MitoTrackergreen染色30min，除去染料， PBS冲洗3遍，多聚甲醛固定，激光共聚焦显微镜观察药物在耐药肿瘤细胞内的亚定位。
[0035] 2. 5药物的体内抗肿瘤活性评价
[0036] 20只Balb/c雄性裸鼠（4周龄）随机分成4组，每组4只。收集MDA-MB-231/ADR 细胞，悬浮于培养液中，细胞密度为3XIOVml，每只小鼠背部皮下注射0. 2ml。待肿瘤体积 为20mm3时开始给药，以生理盐水为阴性对照，DOX为阳性对照，给药剂量为10μmol/kg，载 DOX脂质混合PLGA纳米粒（LNPs-I)为两个剂量组，分别为2、10μmolDOX/kg。每5天给 药一次，共给药3次。给药后，每三天记录一次体重与肿瘤大小，肿瘤体积=(肿瘤长度X 宽度2)/2。
[0037] 3实验结果：
[0038] 3. 1包封率及载药量
[0039] 脂质混合PLGA纳米粒的包封率及载药量如表1所示。结果提示本专利设计的递 药系统具有较高的载药量及包封效率。
[0040] 表1递药系统的载药量及包封率
[0041]
[0042] 3. 2酸敏特性评价
【权利要求】
1. 一种可逆转肿瘤耐药的肿瘤主动靶向纳米递药系统，其特征是递药系统是脂质混 合PLGA纳米粒，纳米粒的核为聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA)，表面嵌入对甲氧基苯甲酰 胺-聚乙二醇-胆固醇连接物（AA-PEG-hyd-CHEMS)和三苯基膦-胆固醇连接物，其中 ⑴对甲氧基苯甲酰胺-聚乙二醇-胆固醇连接物（AA-PEG-hyd-CHEMS)的制备方法 是： 称取氨基己酸溶解于无水二氯甲烷中；另称取对甲氧基苯甲酰氯溶于无水二氯甲烷 中，缓慢加入到上述反应液中，搅拌反应12小时后停止反应，真空旋转蒸干反应液；用适量 乙酸乙酯溶解反应物，加入0. 5M的盐酸溶液洗涤，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤 除去硫酸钠，蒸干有机相，硅胶色谱柱纯化得到对甲氧基苯甲酰胺基己酸；将N，N-二环己 基碳二亚胺和4-二甲胺基吡啶（DCC/DMAP)溶于二氯甲烷中，加入对甲氧基苯甲酰胺基己 酸，活化6小时后加入末端经氨基修饰的聚乙二醇（NH2-PEG-NH2)，同时加入适量三乙胺，继 续反应12小时后停止反应，过滤，蒸干反应液。向反应物中加入适量甲醇，透析，冻干得到 AA-PEG-NH2 ;另称取适量乙酰基苯甲酸，溶于二氯甲烷，加入DCC/DMAP，反应液活化6小时 后加入AA-PEG-NH2，同时加入适量三乙胺，反应结束后，过滤，蒸干反应液，用适量甲醇重新 溶解产物，透析，冻干，得到AA-PEG-对乙酰基苯甲酸； 称取胆固醇溶解于二氯甲烷中，依次加入丁二酸酐、DMAP、三乙胺，室温搅拌反应；反应 结束后，硅胶色谱柱纯化得到胆固醇-琥珀酸单酯（Chol-suc);将Chol-suc、DCC、DMAP溶 解于二氯甲烷中，活化6小时后加入肼基甲酸叔丁酯（B0C-NH-NH2)和三乙胺，反应结束后 用硅胶色谱柱纯化得到胆固醇-琥珀酸-NHNHB0C ;将上述产物溶于二氯甲烷，加入三氟乙 酸，常温反应2小时，反应结束后加入水相洗去三氟乙酸，再用二氯甲烷萃取反应液，收集 有机相，干燥、蒸干得到胆固醇-琥珀酰肼（Chol-NHNH2); 称取AA-PEG-对乙酰基苯甲酸以及〇1〇1-见1-见12溶于二氯甲烷中，加入少量三氟乙酸， 搅拌反应，反应结束后，蒸干反应液，用少量甲醇溶解，透析冻干得到具有酸敏特性的终产 物对甲氧基苯甲酰胺-聚乙二醇-胆固醇连接物（AA-PEG-hyd-CHEMS); (2) 三苯基膦-胆固醇连接物（TPP-CHEMS)的制备方法是： 将（3-丙羧基）三苯基溴化膦与DCC/DMAP溶于二氯甲烷中，活化6小时后加入己二胺， 反应24小时后停止反应，过滤，蒸干反应液，硅胶柱层析纯化得到中间体；另取胆固醇-琥 珀酸单酯溶于二氯甲烷中，加入DCC/DMAP活化6小时后加入上述中间体，反应24小时后停 止反应，过滤，蒸干反应液，硅胶柱层析纯化得到三苯基膦-胆固醇琥珀酸酯（TPP-CHEMS); (3) 脂质混合PLGA纳米粒的制备方法是： 称取一定量的PLGA、TPP-CHEMS与AA-PEG-hyd-CHEMS溶于二氯甲烷中（VJ，另将盐酸 阿霉素溶于蒸馏水中（V2, ％彡V2)，混合上述液体，超声，再加入3%的聚乙烯醇（PVA，V3， 彡vi)，超声，转移到烧杯中，室温搅拌3h，离心（15000rpm, 15min)，得到的沉淀用蒸馈水 冲洗三次，用蒸馏水重新分散，即得纳米粒。
【文档编号】A61P35/00GK104398493SQ201410750956
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月8日 优先权日:2014年12月8日
【发明者】周四元, 成颖, 宋彦峰, 宦梦蕾, 崔晗, 腾增辉, 刘道洲, 刘苗, 叶威良, 张邦乐 申请人:中国人民解放军第四军医大学