xCT抑制剂的用途
【专利摘要】一种xCT抑制剂的用途，它属于生物工程【技术领域】，特别涉及xCT抑制剂的用途，用于制备治疗活动性结核的药物；所述xCT抑制剂优选为柳氮磺胺吡啶。本发明xCT基因在结核病人中的表达水平明显高于潜伏感染以及健康人群的表达水平，因此xCT基因可作为诊断结核的特异标志基因，使结核诊断更加准确、快速；同时试验证明，xCT基因的特异抑制剂可以显著减轻结核菌感染的小鼠体内的细菌含量，因此其可作为治疗活动性结核的新靶点。
【专利说明】xCT抑制剂的用途
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及生物工程【技术领域】，特别涉及xCT抑制剂的用途。
【背景技术】：
[0002] 结核病是由结核分枝杆菌（结核菌）感染引起的慢性传染病。由于缺乏有效疫 苗，当前的结核病防治策略主要是早期发现，早期治疗。药物治疗不仅是降低结核病病死率 的关键，而且是减少结核病播散的关键，因而是当前结核病防治实践中最有效的手段。我 国目前使用世界卫生组织推荐的短程化疗方案，包括由一线抗痨药物异烟肼（INH)，利福平 (RFP)，吡嗪酰胺（PZA)，链霉素（SM)，乙胺丁醇（EMB)等不同组合治疗。近年来，奎诺酮类被 越来越多的应用在结核患者的治疗。尽管这些药物的应用挽救了超过2千万结核患者的生 命，但当前结核病治疗药物显然不能满足患者和结核病防治的要求。由于结核菌耐药的发 生，尤其是耐多药和广泛耐药的发生，使结核病防治面临着严峻的挑战。据统计，在我国结 核病人中，耐多药发病率为8. 32%，总计约为12万人，总数量仅次于印度位居世界第二位， 广泛耐药发病率则为0. 68 %，总计大约为1万人，其危害远远超过艾滋病。因此，控制结核 病亟需高效新型抗结核药物的研发。
[0003] xCT是一种具有12个跨膜结构域的转运蛋白质，通过形成二硫键与4Fhc相结合， 共同组成谷氨酸/胱氨酸转运体（glutamate/cystineantiporter)又称为XC-系统，是 1980年由Bannai和Kitamura在人成纤维细胞中首先发现的转运L-胱氨酸和L-谷氨酸的 Na+非依赖性的转运系统。Xc-转运体是一种专一性、电中性的阴离子转运体。生理状态下 细胞外的胱氨酸以阴离子形式被转运至细胞内，同时细胞内的谷氨酸被释放到细胞外，二 者的比例为1:1。胱氨酸在细胞内迅速被还原成半胱氨酸，一部分参与胞内重要自由基清 除剂谷胱甘肽的合成，另一部分则出胞氧化成胱氨酸，重新参与XC-系统循环。因此，细 胞内的胱氨酸水平远远低于细胞外。XC-的活性可通过使用L-胱氨酸和L-谷氨酸作为底 物来进行定量分析，并且这种转运过程是Cl-依赖性的和Na+非依赖性的[。由于谷氨酸、 胱氨酸和XC-的亲和性相似，因此胱氨酸的摄取可被谷氨酸抑制，反过来也一样。
[0004] XC-转运体有两个主要功能。一方面它介导细胞摄取胱氨酸，这对维持细胞内GSH 水平尤为重要，因为GSH是保护细胞免受氧化应激和其他化学物质损伤所必需的。另一方 面，它可以维持细胞胱氨酸和半胱氨酸的氧化还原平衡。在细胞外的环境中，半胱氨酸迅 速被氧化成胱氨酸，因此胱氨酸在循环中尤其在培养基中是主要的氨基酸形式，而细胞内 则以半胱氨酸为主。进入细胞内的胱氨酸（cystine，CySS)被还原为半胱氨酸（cysteine， Cys)，参与蛋白质、假黑色素（pheomelanin)和还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH)的合 成。在细胞内，GSH可被氧化为氧化型谷胱甘肽（oxidizedglutathione.GSSG)。GSH/ GSSG偶联体与CySS/Cys偶联体组成体内主要的氧化还原势（redoxstate)，参与活性氧素 (reactiveoxygenspecies，R0S)生成、基因表达、细胞增殖、和细胞凋亡等的调节。
[0005] XCT在多种肿瘤中高表达，通过促进肿瘤生长和转移在肿瘤的发生发展中起着重 要作用，临床上，靶向xCT的示踪剂在肝癌等肿瘤的PET-CT检查被证明具有很好的应用 前景。相比之下，有关xCT在感染性疾病发生中的作用知之甚少，目前还没有关于xCT与结 核病发生关系的文献报道。
【发明内容】
：
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供利用xCT作为活动性治疗的新靶点，可用于治疗 干预活动性结核。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
[0008] 本发明提供了一种XCT抑制剂的用途，用于制备治疗活动性结核的药物。
[0009] 所述xCT抑制剂优选为柳氮磺胺吡啶。
[0010] 本发明XCT基因在结核病人中的表达水平明显高于潜伏感染以及健康人群的表 达水平，因此xCT基因可作为诊断结核的特异标志基因，使结核诊断更加准确、快速；同时 试验证明，xCT基因的特异抑制剂可以显著减轻结核菌感染的小鼠体内的细菌含量，因此其 可作为治疗活动性结核的新靶点。
【专利附图】
【附图说明】：
[0011] 图1是本发明实施例1的XCT基因在人外周血中差异表达的定量RT-PCR结果图。
[0012] 图2是本发明实施例2的xCT敲除小鼠在感染结核菌后，与野生型小鼠肺部菌量 的比较结果。
[0013] 图3是本发明实施例2的XCT敲除小鼠在感染结核菌后，与野生型小鼠肺部病理 情况的结果。
[0014] 图4是本发明实施例2的利用SASP治疗结核小鼠后，与野生型小鼠肺部菌量的 比较结果。
【具体实施方式】：
[0015] 下面结合实施例和附图对本发明进行进一步描述：
[0016] 实施例1
[0017] 本实施例将人群分为三组：结核病患者、潜伏感染人群和健康人群（各20例），通 过检测每例外周血单个核细胞（PBMC)中xCT基因mRNA变化，发现其在结核病患者中呈明 显的上调表达趋势。
[0018] 本实施例用定量RT-PCR方法检测每例xCT基因的表达变化。具体步骤如下：
[0019] 步骤一：外周血单个核细胞（PBMC)悬液的制备
[0020] 在离心管中加入淋巴细胞分离液（FreseniusKabiNOrgeAs:LYS3773) 5ml;取 上述确诊的结核病患者，潜伏感染病人以及健康人群的肝素抗凝静脉血各2ml与等量IM 的磷酸缓冲液（PBS)充分混匀得到混合液，用移液器将混合液沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞 分离液液面上，保持清晰的界面，2000转/分离心20分钟；用吸管吸取中间云雾层置入另 一离心管后接着加入5倍体积的IMPBS，1500转/分离心10分钟洗涤细胞，弃上清，相同 条件重复洗涤细胞一次，接着加入含小牛血清体积百分比为10 %的的RPMI1640(Thermo scientific:SH30807. 01b)lml，重悬细胞，得到三组人群的各20例PBMC悬液；每例取 20y1的PBMC悬液于血球计数板上，计数细胞浓度。
[0021] 步骤二：RNA抽提
[0022] 采用Qiagene公司的RNeasyMiniKit(货号74106)对上述得到的三组人群的各 20例PBMC悬液进行RNA抽提。具体操作是：取上述含IXIO6个细胞的PBMC悬液于去DNA酶 和RNA酶的离心管中，3000转/分离心10分钟，弃上清；在细胞沉淀中加入350yIBuffer RLT，充分混匀裂解；加入250yl无水乙醇，混匀，把液体转移到RNeasy柱子中，8,OOOg离 心30秒，弃废液；加入350ylBufferRWl以8,OOOg离心30秒，弃废液；加入80ylDNase 溶液（10UIDNase+70yIBufferRDD)，柱上消化 15min，8,OOOg离心 30 秒，弃废液；加 入 350ylBufferRWl，8,OOOg离心 30 秒，弃废液；加入 500ylBufferRPE，8,OOOg离心 30秒，弃废液；空甩，8,OOOg离心1分钟；把柱子转移到一个去DNA酶和RNA酶的I. 5ml离 心管，加入40y1无RNase的ddH20,10,OOOg离心1分钟，收集三组人群的各20例的RNA 于-80 °C保存、待用。
[0023] 步骤三：反转录
[0024] 采用TAKARA公司的反转录试剂盒（DRR047)，取步骤二得到的RNA0. 5yg进行反 转录，该试剂盒较传统反转录试剂盒增加了去除基因组DNA的步骤，可在最大程度上保证 RNA的纯度和扩增的特异性。
[0025] 分步如下：
[0026] (1)基因组DNA的去除反应 [0027]表 1
[0028]
【权利要求】
1. 一种xCT抑制剂的用途，其特征在于，用于制备治疗活动性结核的药物。
2. 根据权利要求1所述的xCT抑制剂的用途，其特征在于，所述xCT抑制剂为柳氮磺胺 吡啶。
【文档编号】A61K31/635GK104473939SQ201410736443
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月5日 优先权日:2014年12月5日
【发明者】陈心春, 蔡毅, 杨倩婷, 周伯平 申请人:深圳市第三人民医院