经由β-丙内酯处理的残留细胞DNA水平降低的细胞衍生病毒疫苗的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及用于治疗或预防病毒感染的疫苗产品。本发明还提供减少与细胞培养物疫苗制备有关的污染物的方法。用DNA烷基化剂，例如β-丙内酯(BPL)处理使残留的功能细胞培养物DNA降解，从而提供了含有免疫原性蛋白并且基本上不含残留的功能细胞培养物DNA的疫苗，所述蛋白衍生自用细胞培养物繁殖的病毒。
【专利说明】经由（3-丙内酯处理的残留细胞DNA水平降低的细胞衍生 病毒疫苗
[0001] 本申请是2006. 11.01提交的CN 200680046034. 8,题为"经由0-丙内酯处理的 残留细胞DNA水平降低的细胞衍生病毒疫苗"的分案申请。
[0002] 本文引用的所有文件和在线信息通过引用方式全文纳入。
【技术领域】
[0003] 本发明提供杂质减少的改良细胞培养产物和方法。具体地说，本发明提供一种改 良方法以使会与细胞培养物产生的产物维持结合的任何残留功能细胞培养物DNA降解。按 照本发明，用DNA烷基化剂，例如0 -丙内酯（BPL)处理以使残留的功能细胞培养物DNA降 解。可采用该方法处理包括疫苗和重组蛋白在内的各种细胞培养产物。
【背景技术】
[0004] 商业生产病毒疫苗通常需要大量病毒作为抗原来源。可以在细胞培养系统中培养 和复制种子病毒（seed virus)以获得疫苗生产所用的商业数量的病毒。适用于病毒复制 的细胞培养系统包括哺乳动物细胞、鸟类细胞或昆虫细胞，但对于病毒疫苗特别优选哺乳 动物细胞培养系统，从而确保病毒抗原蛋白质能正确糖基化和折叠。出于相似的原因，重组 蛋白质表达也同样优选哺乳动物细胞培养系统。
[0005] 如果未修饰细胞培养物的天然状态，其复制能力有限，因而对产生商业疫苗或重 组蛋白质所需数量的材料而言行不通且无效。因此，出于生产目的，优选将细胞修饰成"连 续"或"无限增殖"的细胞系，从而增加它们能分裂的次数。许多这种修饰所用的机制类似 于致癌细胞所涉及的那些机制。因此，关注的是应该除去在这些系统中产生的疫苗或重组 蛋白产物的最终制剂中细胞培养过程的任何残留物质，例如宿主细胞DNA。
[0006] 除去残留宿主细胞DNA的标准方法是采用DNA酶处理。欧洲专利0870508和 美国专利5948410披露了这种类型的常规方法，其涉及两步处理，首先用DNA酶（例如， Benzonase)，然后用阳离子洗绦剂（例如，CTAB)。
[0007] 目前降低该风险的努力集中在减少残留宿主细胞DNA的总浓度。本发明的目的是 通过消除任何残留宿主细胞DNA的功能而进一步降低风险。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明提供杂质减少的改良细胞培养产物和方法。具体地说，本发明提供一种改 良方法以使能与细胞培养物产生的产物维持结合的任何残留功能细胞培养物DNA降解。按 照本发明，用DNA烷基化剂，例如0 -丙内酯（BPL)处理以使残留的功能细胞培养物DNA降 解。可采用该方法处理包括疫苗和重组蛋白在内的各种细胞培养产物。
[0010] 本发明包括一种疫苗，其包含衍生自用细胞培养物增殖的病毒的免疫原性蛋白， 其中所述疫苗基本上不含残留的功能细胞培养物DNA。此外，本发明涉及在细胞培养物中表 达的重组蛋白，最终重组蛋白制剂基本上不含残留的功能细胞培养物DNA。
[0011] 可用烷基化剂处理来消除任何残留宿主细胞DNA的功能，所述烷基化剂能将要转 移入人受者染色体中，或者为受者DNA复制机制所识别的DNA切割成足够小的部分，因而其 不能编码功能蛋白。降解的残留细胞培养物DNA的长度优选短于500个碱基对。降解的残 留细胞培养物DNA的长度更优选短于200个碱基对。
[0012] 发明详述
[0013] 本发明提供杂质减少的改良细胞培养产物和方法。具体地说，本发明提供一种改 良方法以使与细胞培养物产生的产物维持结合的任何残留功能细胞培养物DNA降解。按照 本发明，用DNA烷基化剂，例如0-丙内酯（BPL)处理以使残留的功能细胞培养物DNA降解。 可采用该方法处理包括疫苗和重组蛋白在内的各种细胞培养产物。
[0014] 本发明包括一种疫苗，其包含衍生自用细胞培养物增殖的病毒的免疫原性蛋白， 其中所述疫苗基本上不含残留的功能细胞培养物DNA。此外，本发明涉及在细胞培养物中表 达的重组蛋白，最终重组蛋白制剂基本上不含残留的功能细胞培养物DNA。
[0015] 可用烷基化剂处理来消除任何残留宿主细胞DNA的功能，所述烷基化剂能将要转 移入人受者染色体中，或者为受者DNA复制机制所识别的DNA切割成足够小的部分，因而其 不能编码功能蛋白。降解的（无功能的）残留细胞培养物DNA的长度优选短于1000个碱 基对（例如，短于 1000、800、700、600、500、400、300、200、150、100、75 或 50 个碱基对）。降 解的残留细胞培养物DNA的长度优选短于500个碱基对。降解的残留细胞培养物DNA的长 度更优选短于200个碱基对。
[0016] 本文所用的"功能DNA"或"功能RNA"表示能翻译成功能蛋白质或转移入哺乳动 物染色体中的核苷酸序列。通常，能翻译成功能蛋白质的核苷酸序列需要启动子区域、起始 密码子、终止密码子和功能蛋白质的内部编码序列。如果DNA发生损伤，例如加入烷基化剂 所致，许多这些区域发生改变或遭破坏，从而不再进行翻译或只进行到形成所需蛋白的寡 肽亚基。
[0017]"降解的残留功能细胞培养物DNA"指不能翻译成功能蛋白质或转移入哺乳动物染 色体的功能DNA。"降解的残留功能DNA"的长度优选短于1000个碱基对，更优选短于500 个碱基对，甚至更优选短于200个碱基对，最优选短于100个碱基对。可通过包括凝胶电泳 在内的标准技术测定降解的残留功能DNA的长度。
[0018] 本发明提供基本上不含残留的功能细胞培养物DNA的疫苗组合物和重组蛋白制 剂。本文所用的"基本上不含残留的功能细胞培养物DNA"指某种组合物或制剂，其中每 0. 5ml检测到短于200个碱基对的残留DNA片段少于10ng。可通过包括毛细管电泳与核酸 扩增技术在内的标准技术检测任何残留细胞培养物DNA的大小。
[0019] 本发明使用烷基化剂，例如BLP提供了减少凝聚作用和污染物的额外益处。凝聚 物减少的疫苗制剂的免疫原性也增强。疫苗的免疫原性依赖于针对特定病毒表位的特异 性。如果蛋白质的表面与有害的分子结合或为之掩盖或因凝聚作用而掩藏在大分子中，则 表位可能不易识别，因而在疫苗中的效率较低。此外，凝聚物减少的疫苗制剂可具有其它加 工益处。纯化过程依赖于分离所需蛋白质，例如流感疫苗中的血凝素和神经氨酸酶。如果 蛋白质因存在凝聚物或交联作用而在结构上得到修饰，它可能不能被识别，因此不能用柱 层析、过滤或离心除去。
[0020] 烷基化剂
[0021] 本发明所用的烷基化剂包括将烷基引入化合物的物质。烷基化剂优选单烷基化剂 (monoalkylating agent)，例如BPL。BPL是在许多疫苗的制备中广泛用于灭活病毒的单烧 基化剂。BPL与包括核酸在内的各种生物分子反应，其中BPL通过烷化和脱嘌呤作用来修饰 结构。BPL通常如以下结构所示：
[0022]
【权利要求】
1. 一种流感疫苗，其包含衍生自用细胞培养物繁殖的流感病毒的免疫原性蛋白，其中 所述疫苗中残留的细胞培养物DNA总量低于20ng/ml，降解的残留细胞培养物DNA的长度短 于200个碱基对。
2. 如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，用烷基化剂处理使任何残留的细胞培养物 DNA降解。
3. 如权利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述烷基化剂对疫苗中的病毒灭活。
4. 如权利要求2或3所述的疫苗，其特征在于，所述烷基化剂是0 -丙内酯（BPL)。
5. 如权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述0-丙内酯（BPL)低于0.1%。
6. 如权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗含有游离丙酸和BPL低于0. 01 %。
7. 如前任一权利要求所述的疫苗，其特征在于，所述细胞培养物选自下组:MDCK细胞、 Vero细胞和PER. C. 6细胞。
8. 如前任一所述的疫苗，其特征在于，还包含水包油乳液佐剂。
9. 如权利要求8所述的疫苗，其特征在于，所述乳液中油滴的直径是亚微米的。
10. 如权利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述水包油乳液佐剂包含角鲨烯、吐温80 和司盘85。
11. 如权利要求8或9所述的疫苗，其特征在于，所述水包油乳液佐剂包含角鲨烯、生育 酚和吐温80。
12. 如前任一权利要求所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含裂解病毒颗粒或纯化的 病毒蛋白形式。
13. 如前任一权利要求所述的疫苗，其特征在于，任何残留细胞培养物DNA的大小通过 毛细管电泳检测。
14. 如前任一权利要求所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗是三价疫苗。
15. 如权利要求1-13任一所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含来自一种流感病毒 株的抗原。
16. 如前任一权利要求所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗含有少于5 y g/ml汞物质。
17. -种流感疫苗，其包含衍生自用细胞培养物繁殖的流感病毒的免疫原性蛋白，其中 所述疫苗用包含以下步骤的方法制备： (i) 用0 -丙内酯纯化病毒颗粒，使残留的功能细胞培养物DNA降解，以灭活病毒； (ii) 利用破裂浓度的溴化十六烷基三甲铵使完整病毒破裂或破碎；和 (iii) 分离该免疫原性蛋白。
【文档编号】A61K39/145GK104474543SQ201410631136
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2006年11月1日 优先权日:2005年11月1日
【发明者】J·-P·格雷格森, H·科斯特 申请人:诺华疫苗和诊断有限两合公司