一种鱼肉抗氧化活性肽及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了属于水产食品加工领域的一种鱼肉抗氧化活性肽，其氨基酸序列为Asn-Trp-Asp-Asp-Met。该肽可以人工合成，也可以鱼肉为原料制备。其制备包括将鱼肉制成鱼肉浆液，然后用碱性蛋白酶进行酶解，离心，取上清液；利用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜对上清液超滤，Sephadex?G-25凝胶分离，收集第2个洗脱峰；再用高效液相色谱纯化；最后浓缩、冷冻干燥。本发明鱼肉抗氧化活性肽的抗氧化功能好，其清除DPPH自由基能力可达90％以上；其次，本发明是以天然产物为原料、经过食品级碱性蛋白酶酶解获得的产物，安全，无毒，本发明制备方法简单，有效地解决了目前抗氧化多肽难以实现产业化生产的问题。
【专利说明】一种鱼肉抗氧化活性肽及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于水产食品加工领域，具体涉及一种以鱼肉为原料生产的鱼肉抗氧化活性肽，以及该鱼肉抗氧化活性肽的制备方法。
【背景技术】
[0002]蛋白质经过水解得到多肽，使得蛋白质的结构被改变，疏水区的活性官能基团暴露，随着肽键的裂解，游离氨基酸增加，从而可以提供质子或电子源，保持较高的氧化还原电位，使其具有清除活性自由基的能力，清除过氧化亚硝酸盐能力和抑制脂质过氧化作用的发生，从而抗氧化肽的抗氧化活性得以提高。氧化对需氧生物特别是脊椎动物和人类是一个重要的代谢过程，但是它却导致了自由基的形成。活性氧自由基(ROS)被认为能引起氧化应激。在食品体系中，脂类或蛋白质可能会受到ROS的攻击经历氧化过程，从而导致食品产生不愉快味道，颜色发暗或不良质地，同时也可能产生潜在的毒性终产物。抗氧化多肽的应用能防止食品成分由于捐献电子给活性氧自由基以及中和活性氧自由基的负面作用而变质。抗氧化肽在医学、化妆品、生物、食品领域有广泛的应用价值。
[0003]有关抗氧化肽的国内外专利情况，国外专利方面:如(I)欧洲专利EP1188767 Al公开了一种来源于酪蛋白的抗氧化肽；(2)美国专利US8232243B2公开了含有色氨酸和酪氨酸的肽作为抗氧化的方法，这种抗氧化剂可以用于治疗和预防氧化过程带来的疾病和综合症。国内方面:已有从酪蛋白、蛙类、马面飩鱼头蛋白等中提取制备抗氧化肽的相关专利。如(I)专利CN103275180 A公开了一种马面飩鱼头蛋白抗氧化肽，该抗氧化肽的氨基酸序列为 Leu-Ser-His-G ly-Pro-Tyr(LSHGPY) ； (2)专利 CN 103103242 A 公开了一种以蓝圆鰺鱼肉蛋白为原料制备的抗氧化活性肽，其氨基酸序列分别为His-Asp-Hi s-P1-Val-Cys (组氨酸_天冬氨酸_组氨酸_脯氨酸_纟颜氨酸_半胱氨酸)和His-Glu-Lys-Val-Cys (组氨酸-谷氨酸-赖氨酸-缬氨酸-半胱氨酸)；(3)专利CN103431158A公开了一种鸭肉蛋白源抗氧化肽。
[0004]经检索，没有发现以鱼肉为原料，利用碱性蛋白酶制备氨基酸序列为Asn-Trp-Asp-Asp-Met的抗氧化肽的报道。
【发明内容】
[0005]本发明目的在于提供一种以鱼肉为原料制备的鱼肉抗氧化活性肽，该抗氧化活性肽具有较好的清除自由基作用。
[0006]本发明另一目的在于提供上述鱼肉抗氧化活性肽的制备方法。
[0007]本发明第三目的在于提供上述鱼肉抗氧化活性肽的用途。
[0008]实现本发明的技术方案如下:
[0009]本发明一种鱼肉抗氧化活性肽，其所述的鱼肉抗氧化活性肽的氨基酸序列为Asn-Trp-Asp-Asp-Met(SEQ ID No: I) ?
[0010]上述鱼肉抗氧化活性肽，所述的鱼肉抗氧化活性肽的分子量为679Da。
[0011]上述鱼肉抗氧化活性肽可以人工合成，也可以鱼肉为原料利用碱性蛋白酶制备。
[0012]上述鱼肉抗氧化活性肽，按照如下方法制备:
[0013](I)、洗净鱼肉，用打浆机将鱼肉打成浆，得鱼肉浆；然后向鱼肉浆中加入1.0~
3.0倍鱼肉重量的水，在80~90°C下保持15~20min，再用分散均质机在10000~13000rpm下匀衆I~3min,得鱼肉衆液；
[0014](2)、用lmol/L的NaOH或HCl调节步骤⑴所得的鱼肉浆液的pH为7.0~8.0，并调节鱼肉浆液的温度为50~60°C;然后按照碱性蛋白酶与鱼肉质量比为1:50~200的比例加入碱性蛋白酶，搅拌，在50~60°C下酶解0.5~3.0h，再在95~100°C下保温3~5min,冷却至室温；接着在4000~6000g下离心10~15min,收集上清液；
[0015](3)、利用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜对步骤(2)所得的上清液进行超滤，收集滤液；再经过Sephadex G-25凝胶分离,洗脱液为去离子水,流速为0.8mL/min,洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行I次分离，反相HPLC的分离条件是以5~90%乙腈溶液(体积比)作为洗脱液，流速为I~5mL/min，得到含抗氧化活性肽的溶液；
[0016](4)、将步骤(3)得到的含抗氧化活性肽的溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼肉抗氧化活性肽。
[0017]上述鱼肉抗氧化活性肽中所述的鱼是指鲢鱼、草鱼或鳕鱼等。
[0018]上述鱼肉抗氧化活性肽步骤(2)中所述的碱性蛋白酶是指Alcalase 2.4L。
[0019]上述制备方法步骤(3)中所述的装Sephadex G-25柱的规格为长100cm,直径
2.6cm。
[0020]上述鱼肉抗氧化活性肽步骤(3)中所述的5~90%乙腈溶液是指O~5min乙腈溶液为5 % (体积比)，5~40min乙腈溶液从5 %到40 % (体积比)，40~50min乙腈溶液从40%到90% (体积比)。
[0021]上述鱼肉抗氧化活性肽步骤(4)中所述的鱼肉抗氧化活性肽中氨基酸序列为Asn-Trp-Asp-Asp-Met (NWDDM)的肽的含量大于 80%。
[0022]上述鱼肉抗氧化活性肽的制备方法，包括如下步骤:
[0023](I)、洗净鱼肉，用打浆机将鱼肉打成浆，得鱼肉浆；然后向鱼肉浆中加入1.0~
3.0倍鱼肉重量的水，在80~90°C下水浴15~20min，再用分散均质机在10000~13000rpm下匀衆I~3min,得鱼肉衆液；
[0024](2)、用lmol/L的NaOH或HCl调节步骤⑴所得的鱼肉浆液的pH为7.0~8.0，并调节鱼肉浆液的温度为50~60°C;然后按照碱性蛋白酶与鱼肉质量比为1:50~200的比例加入碱性蛋白酶，搅拌，在50~60°C下酶解0.5~3.0h，再在95~100°C下保温3~5min,冷却至室温；接着在4000~6000g下离心10~15min,收集上清液；
[0025](3)、利用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜对步骤(2)所得的上清液进行超滤，收集滤液；再经过Sephadex G-25凝胶分离,洗脱液为去离子水,流速为0.8mL/min,洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行I次分离，反相HPLC的分离条件是以5~90%乙腈溶液(体积比)作为洗脱液，流速为I~5mL/min，得到含抗氧化活性肽的溶液；
[0026](4)、将步骤(3)得到的含抗氧化活性肽的溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼肉抗氧化活性肽。
[0027]上述制备方法中所述的鱼是指鲢鱼、草鱼或鳕鱼等。
[0028]上述制备方法步骤⑵中所述的碱性蛋白酶是指Alcalase 2.4L。
[0029]上述制备方法步骤(3)中所述的装S印hadex G-25柱的规格为长100cm，直径
2.6cm。
[0030]上述制备方法步骤(3)中所述的5~90%乙腈溶液是指O~5min乙腈溶液为5%(体积比)，5~40min乙腈溶液从5 %到40 % (体积比)，40~50min乙腈溶液从40 %到90% (体积比)。
[0031]上述鱼肉抗氧化活性肽作为添加剂在食品或化妆品上的应用。
[0032]本发明具有的优点和有益效果:(I)、本发明鱼肉抗氧化活性肽(Asn-Trp-Asp-Asp-Met)具有很好的抗氧化功能,其清除DPPH自由基能力可达90%以上；
(2)、本发明鱼肉抗氧化活性肽是以天然产物为原料、经过食品级碱性蛋白酶酶解获得的产物，将其作为食品、化妆品等添加剂安全，无毒；(3)、本发明鱼肉抗氧化活性肽制备方法简单，易实现产业化生产，有效地解决了目前抗氧化多肽难以实现产业化生产的问题。(4)、本发明开发的抗氧化肽，能广泛应用于功能食品。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1本发明鲢鱼鱼肉蛋白酶解产物超滤后组分SPP-1V (分子量=3000)的Sephadex G_25凝胶过滤层析图谱；其中组分I是指分子量相对较大的肽，组分2是指分子量相对较小的肽。
【具体实施方式】
[0034] 实施例1鲢鱼鱼肉抗氧化活性肽的制备
[0035]按照如下方法进行:
[0036](I)、将鲢鱼鱼肉100克洗净，用打浆机将鱼肉打成浆，得鱼肉浆；然后向鱼肉浆中加入2.0倍鱼肉重量的水200克，在90°C中水浴20min，再用分散均质机在12000rpm下匀浆2min，得到鱼肉浆液300克。
[0037](2)、用lmol/L的NaOH或HCl调节步骤⑴鱼肉浆液的pH为8.0，温度调节为50°C，然后按照碱性蛋白酶与鱼肉质量比为1:100的比例加入碱性蛋白酶Alcalase
2.4L(Novozymes) I克，在50°C下酶解2小时，然后在95°C下保温3min，冷却至室温；再在5000g条件下离心15min,收集上清液。
[0038](3)、利用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜对步骤(2)所得的上清液进行超滤，收集滤液，再经过S印hadex G-25 (长100cm，直径2.6cm)凝胶色谱分离，洗脱液为去离子水，流速为0.8mL/min,洗脱峰在280nm下进行测量，收集第2个洗脱峰(见图1);再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行I次分离，反相HPLC的分离条件是以5~90%乙腈溶液(体积比)作为洗脱液，流速为lmL/min，得到高纯度的抗氧化活性肽溶液；
[0039](4)、将步骤(3)得到的抗氧化活性肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼肉抗氧化活性肽。
[0040]通过LC-MS/MS对所得的鱼肉抗氧化活性肽的主要成分进行测定，该鱼肉抗氧化活性肽的氨基酸序列为Asn-Trp-Asp-Asp-Met，其分子量为679Da，该肽的含量为81 %。
[0041]实施例2鲢鱼鱼肉抗氧化活性肽的制备
[0042]按照如下方法进行:
[0043](I)、将鲢鱼鱼肉300克洗净，用打浆机将鱼肉打成浆，得鱼肉浆；然后向鱼肉浆中加入2.0倍鱼肉重量的水600克，在85°C中水浴20min，再用分散均质机在12000rpm下匀浆2min，得到鱼肉浆液900克。
[0044](2)、用lmol/L的NaOH或HCl调节步骤(1)鱼肉浆液的pH为7.0，温度调节为55°C，然后按照碱性蛋白酶与鱼肉质量比为1:150加入碱性蛋白酶Alcalase 2.4L 2克，在55°C下酶解I小时，然后在95°C下保温4min，冷却至室温；再在5000g条件下离心15min，
收集上清液。
[0045](3)、利用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜对步骤(2)所得的上清液进行超滤，收集滤液；再经过S印hadex G-25 (长100cm，直径2.6cm)凝胶色谱分离，洗脱液为去离子水，流速为0.8mL/min,洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；再用RP-HPLC反相高校液相色谱进行I次分离，反相HPLC的分离条件是为5~90%乙腈溶液(体积比)作为洗脱液，流速为lmL/min，得到高纯度的抗氧化活性肽溶液；
[0046](4)将步骤(3)得到的抗氧化活性肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得鱼肉抗氧化活性肽。
[0047]通过LC-MS/MS 对所得的鱼肉抗氧化活性肽的主要成分进行测定，该鱼肉抗氧化活性肽的氨基酸序列为Asn-Trp-Asp-Asp-Met，其分子量为679Da，该肽的含量为80.6%。
[0048]实施例3鲢鱼鱼肉抗氧化活性肽的制备
[0049]按照如下方法进行:
[0050](I)、将鱼肉1000克洗净，用打浆机将鱼肉打成浆，得鱼肉浆；然后向鱼肉浆中加入2.0倍鱼肉重量的水2000克，在90°C中水浴15min，用分散均质机在12000rpm匀浆2min，得到鱼肉浆液3000克。
[0051](2)、用lmol/L的NaOH或HCl来调节调节步骤(1)鱼肉浆液的pH为8.0，温度调节为57°C，然后按照碱性蛋白酶与鱼肉质量比为1:200加入碱性蛋白酶Alcalase 2.4L 5克，在57°C下酶解2小时，然后在95°C下保温5min，冷却至室温；再在5000g条件下离心15min，收集上清液。
[0052](3)、利用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜对步骤(2)所得的上清液进行超滤，收集滤液；再经过S印hadex G-25 (长100cm，直径2.6cm)凝胶色谱分离，洗脱液为去离子水，流速为0.8mL/min,洗脱峰在280nm下进行测量，收集第2个洗脱峰；再用RP-HPLC反相高校液相色谱进行I次分离，反相HPLC的分离条件是为5~90%乙腈溶液(体积比)作为洗脱液，流速为lmL/min，得到高纯度的抗氧化活性肽溶液。
[0053](4)将步骤(3)得到的抗氧化活性肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼肉抗氧化活性肽。
[0054]通过LC-MS/MS对所得的鱼肉抗氧化活性肽的主要成分进行测定，该鱼肉抗氧化活性肽的氨基酸序列为Asn-Trp-Asp-Asp-Met，其分子量为679Da，该肽的含量为80.9%,0
[0055]实施例4本发明鱼肉抗氧化活性肽的抗氧化活性的测定试验
[0056]试验样品:实施例1、实施例2、实施例3制备的鱼肉抗氧化活性肽；
[0057]人工合成肽Asn-Trp-Asp-Asp-Met (委托GenScript生物公司合成)
[0058]试验方法:
[0059](I).清除DPPH自由基能力测定:取20μ g/mL的抗氧化活性肽1.5mL，加入99.5%乙醇1.5mL和0.02% DPPH乙醇溶液0.675mL混合，振荡混匀，室温下避光水浴30min，然后在517nm下检测体系吸光值。吸光值越低，体系的清除DPPH自由基能力越强。空白对照即是将样品溶液1.5mL换成去离子水1.5mL。
[0060]DPPH自由基清除能力％=((空白吸光值-样品吸光值)/空白吸光值)X100
[0061](2).还原力测定:取20μ g/mL的抗氧化活性肽lmL，加入0.2M磷酸缓冲液(pH6.6)2.5mL和I % (质量分数)的铁氰化钾溶液2.5mL,混匀，然后在50°C水浴加热20min。取出迅速冷却，加入10% (质量分数)三氯乙酸(TCA)溶液2.5mL，混合均匀，然后在3000g下离心10min。取上清液2.5mL,加入去离子水2.5mL和1% (质量分数)三氯化铁溶液0.5mL，充分混匀，在室温下反应lOmin，用700nm波长测定吸光度。还原力即可用700nm波长处吸光值表示。
[0062](3).氧化自由基吸收能力(ORAC)测定:不同浓度的抗氧化活性肽溶液20 μ L与75mM磷酸盐缓冲液80 yL(pH7.4)及200nM的荧光试剂50 μ L充分混合，然后在37°C温育15min,再加入80mM的AAPH溶液50 μ L。用酶标仪每分钟读取荧光值共进行lOOmin。荧光的激发波长和发射波长分别是485nm和538nm。用磷酸缓冲溶液代替样品作为空白。以Trolox作为标准对照，使用的浓度为O，2，4，8，12，16 μ Μ,绘制荧光淬灭曲线，并计算荧光淬灭曲线下的积分面积(AUC)。AUC的计算公式如下:
【权利要求】
1.一种鱼肉抗氧化活性肽，其特征在于所述的鱼肉抗氧化活性肽的氨基酸序列为Asn-Trp-Asp-Asp-Met。
2.按照权利要求1所述的鱼肉抗氧化活性肽，其特征在于所述的鱼肉抗氧化活性肽的分子量为679Da。
3.权利要求1所述的鱼肉抗氧化活性肽，其特征在于按照如下方法制备: (1)、洗净鱼肉，用打浆机将鱼肉打成浆，得鱼肉浆；然后向鱼肉浆中加入1.0~3.0倍鱼肉重量的水，在80~90°C下保持15~20min，再用分散均质机在10000~13000rpm下匀浆I~3min，得鱼肉浆液； (2)、用lmol/L的NaOH或HCl调节步骤⑴所得的鱼肉浆液的pH为7.0~8.0,并调节鱼肉浆液的温度为50~60°C;然后按照碱性蛋白酶与鱼肉质量比为1:50~200的比例加入碱性蛋白酶，搅拌，在50~60°C下酶解0.5~3.0h,再在95~100°C下保温3~5min，冷却至室温；接着在4000~6000g下离心10~15min，收集上清液； (3)、利用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜对步骤(2)所得的上清液进行超滤，收集滤液；再经过Sephadex G-25凝胶分离,洗脱液为去离子水,流速为0.8mL/min,洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行I次分离，反相HPLC的分离条件是以5~90%乙腈溶液作为洗脱液，流速为I~5mL/min，得到含抗氧化活性肽的溶液； (4)、将步骤(3)所得的含抗氧化活性肽的溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼肉抗氧化活性肽。
4.按照权利要求3所述的鱼肉抗氧化活性肽，其特征在于所述的鱼是指鲢鱼、草鱼或鳕鱼。
5.按照权利要求3所述的鱼肉抗氧化活性肽，其特征在于其步骤(2)中所述的碱性蛋白酶是指 Alcalase 2.4L。
6.按照权利要求3所述的鱼肉抗氧化活性肽，其特征在于其步骤(3)中所述的5~90 %乙腈溶液是指O~5min乙腈溶液为5 %，5~40min乙腈溶液从5 %到40 %，40~50min乙腈溶液从40%到90%。
7.权利要求1所述的鱼肉抗氧化活性肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤: (1)、洗净鱼肉，用打浆机将鱼肉打成浆，得鱼肉浆；然后向鱼肉浆中加入1.0~3.0倍鱼肉重量的水，在80~90°C下水浴15~20min，再用分散均质机在10000~13000rpm下匀浆I~3min，得鱼肉浆液； (2)、用lmol/L的NaOH或HCl调节步骤⑴所得的鱼肉浆液的pH为7.0~8.0,并调节鱼肉浆液的温度为50~60°C;然后按照碱性蛋白酶与鱼肉质量比为1:50~200的比例加入碱性蛋白酶，搅拌，在50~60°C下酶解0.5~3.0h，再在95~100°C下保温3~5min，冷却至室温；接着在4000~6000g下离心10~15min，收集上清液； (3)、利用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜对步骤(2)所得的上清液进行超滤，收集滤液；再经过Sephadex G-25凝胶分离,洗脱液为去离子水,流速为0.8mL/min,洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行I次分离，反相HPLC的分离条件是以5~90%乙腈溶液作为洗脱液，流速为I~5mL/min，得到含抗氧化活性肽的溶液；(4)、将步骤(3)得到的含抗氧化活性肽的溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼肉抗氧化活性肽。
8.按照权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述的鱼是指鲢鱼、草鱼或鳕鱼。
9.按照权利要求7所述的制备方法，其特征在于其步骤(2)中所述的碱性蛋白酶是指Alcalase 2.4L。
10.权利要求1 所述的鱼肉抗氧化活性肽作为添加剂在食品或化妆品上的应用。
【文档编号】A61K8/64GK104177477SQ201410438939
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年8月28日 优先权日:2014年8月28日
【发明者】罗永康, 徐萍, 王智, 刘鹏 申请人:滨州万嘉生物科技有限公司