一种家鸽Cathelicidin—Cl-CATH2肽及其基因、应用的利记博彩app
【专利摘要】一种家鸽Cathelicidin—C1-CATH2肽及其基因、应用，属于生物医学【技术领域】。该肽全序列为：見-异見-谷氨酰胺-精-甘-精-苯丙-甘-精-苯丙-:?-甘-精-异;^-精-精-苯丙-精-脯-精-异見-天冬酰胺-苯丙-天冬-异亮-精-丙-精-甘-丝-异亮-精-亮-甘。其基因由471个核苷酸组成，其中编码成熟肽部分的为第367-468位核苷酸。RT-PCR显示C1-CATH2对细菌脂多糖（LPS)诱导的关键致炎因子及诱导型N0合酶基因的表达均具有明显的抑制作用。蛋白水平上，C1-CATH2对LPS诱导的致炎因子也具有显著的负调控作用。另外，C1-CATH2结构简单，不含有二硫键及环状结构，方便化学合成及基因工程制备，并且它对正常细胞的细胞毒性和溶血活性都很低，能够在制备抗炎症药物中应用。
【专利说明】-种家鸽Cathe I i c i d i η- C卜CATH2肽及其基因、应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种家鸽Cathelicidin - C1-CATH2肽及其基因、在制备抗炎症药物 中的应用，属于生物医学【技术领域】。
【背景技术】
[0002] Cathelicidin在几乎所有种类的脊椎动物体内均有发现，在动物先天免疫系统 中发挥极其重要的作用。Cathelicidin具有广谱的抗菌性，不仅对革兰氏阳性菌、革兰氏 阴性菌、某些真菌以及病毒具有非常强的杀菌活性，而且对许多临床耐药菌也具有同样的 作用。此外，cathelicidin还对多种免疫细胞具有趋化作用、刺激肥大细胞释放组织胺、 调节巨噬细胞转录、抑制致炎因子分泌，刺激抑炎因子分泌、诱导血管生成、促进伤口愈合、 诱导肿瘤细胞凋亡等多种生物学功能。由于cathelicidin具有如此众多的生物学功能， 且对高等动物正常细胞几乎没有毒害能力，因此cathelicidin -直是我们研究的热点。 Cathelicidin在生物制药领域具有很广阔的应用前景。
[0003] 此外，cathelicidin与某些疾病的发病密切相关。最近研究表明，人源 cathelicidin，LL-37在人类自身免疫性皮肤病-牛皮癣的发病过程中发挥了重要的作 用。LL-37能够与人自身DNA结合形成DNA-LL-37复合物，该复合物不会被正常人的免疫 系统所识别，但是却能够被牛皮癣患者免疫系统识别并诱导浆细胞样树突状细胞产生大量 IFN-α，而IFN-α的产生加重了牛皮癣的症状。除此之外，类风湿性关节炎和系统性红斑 狼疮患者体内也检测到LL-37表达量异常升高，提示LL-37与这些疾病的发生也存在某种 关系。随着cathelicidin与疾病发病机制相互关系的研究的深入，我们将对许多疾病有全 新的认识，从而为疾病的治疗提供全新的思路和方法。
[0004] 目前cathelicidin家族小肽在医学上的应用取得了一些令人满意的成果，已 经有一些相关药物进入临床研究。例如，MX-226 (CPI-226)是一个从牛体内克隆得到的 cathelicidin一indolicidin的衍生物，已完成IIIb期临床试验，可用于局部阻止或降低 中心静脉导管相关的血液感染，显示了良好的应用前景。来源与猪的Iseganan (IB-367)， 是猪cathelicidin -protegrin_l的改造体，由17个氨基酸残基组成，分子内含有2对二 硫键。化疗患者口腔黏膜炎，已进入临床III期。此外，一些用于伤口愈合，抑制内毒素感 染，抑制肿瘤等的抗菌肽也进入临床试验阶段。
【发明内容】
[0005] 为了能更好的拓展cathelicidin在制药领域的应用，本发明提供一种家会鸟 cathelicidin - C1-CATH2肽及其基因，以利用cathelicidin对机体或正常细胞的溶血活 性和细胞毒性小；结构简单，没有二硫键和环状结构，易于化学合成的特点，将其应用于制 备抗炎症药物中。
[0006] 本发明的技术方案是：一种家鴻Fia ) cathelicidin -C1-CATH2 肽，所述C1-CATH2肽是由家鸽cathelicidin基因编码的一种直链多肽，富含碱性氨基酸， C1-CATH2肽的全序列为：亮氨酸-异亮氨酸-谷氨酰胺-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-苯丙 氨酸-甘氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸-精氨酸-异亮氨酸-精氨酸-精氨 酸-苯丙氨酸-精氨酸-脯氨酸-精氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-天冬氨酸-异 亮氨酸-精氨酸-丙氨酸-精氨酸-甘氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-精氨酸-亮氨酸-甘氨 酸。
[0007] 编码C1-CATH2肽的基因由471个核苷酸组成，自5'端至3'端序列为： I ATGGCGGGGT GCTGGGTGCT GGTGCTGGCG CTGCTGGGGG GGGCCTGCGC CCTCCCGGCC 61 CCCCTGGCCT ACACCCAGGC GCTGGCTCAG GCCGTCGACT CCTACAACCA GCGCCCCGAG 121 GTGCCCAACG CCTTCCGGCT GCTCAGCGCC GACCCCGAGC CCGCCCCGGG CGTCGAGCTG 181 AGCTCCCTGC GGCTCCTCAA CTTCACCATG ATGGAGACCG AGTGCACCCC GAGCGCCCGC 241 GTGAACCCCG ATGACTGCGA CTTCAAGGAG AACGGGGTCA TCAAGGAGTG CTCGGGCCCG 301 GTGCAGTTTG GGCAGAGCTC CCCCGAGATC GACCTGCACT GCACCGACGC CTCCTCTGAT 361 CCGGTTCTCA TCCAGCGTGG CCGGTTCGGG CGCTTCCTGG GCAGAATCCG GCGCTTTCGG 421 CCCCGAATCA ACTTCGACAT CCGCGCCCGG GGCTCCATTC GCCTGGGCTG A 编码C1-CATH2肽的成熟肽位于第367-468位核苷酸，编码34个氨基酸残基，其成熟 肤氛基酸序列为：Leu1Ile2Gln3Arg4 Gly5 Arg6 Phe7 Gly8 Arg9 Phe1。Leu11Gly12 Arg13 Ile14 Arg15 Arg16 Phe17 Arg18 Pro19 Arg20 He21 Gln22 Phe23 Glu24 He25 Arg26 Ala27 Arg28Gly29 Ser30 He31 Arg32 Leu33Gly340
[0008] 所述家鴻（CbJrWffiAa ) cathelicidin -C1-CATH2肽应用于制备抗炎症的治 疗药物。
[0009] 所述C1-CATH2肽应用于制备抗炎症的治疗药物。
[0010] 据所述编码C1-CATH2肽的基因编码合成的C1-CATH2肽溶于灭菌超纯水，用于药 理活性检测。
[0011] I. C1-CATH2肽的基因克隆： 家鸽脾脏总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，根据已报道的鸟类 Cathelicidin序列设计特异引物，利用半巢式PCR的方法筛选C1-CATH2基因。cDNA第一 链合成引物为 Clontech 公司 In_FusionR SMARTer? PCR cDNA synthesis Kit 中提供的 SMARTtmIV Oligonucleotide 引物（5, -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGG CCGGG-3'）和 CDS 111/3' PCR 引物（5, -ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGA CATGT(30) N- IN-3'）;cDNA第二链合成引物为（5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3,）和CDS III 3'PCR 引物。半巢式PCR两步的5'引物分别为：Pl (5' -ATGGCGAGCTGCTG GGCTGCT-3'） 和P2 (5 ' -AACGCCTTCCAGGCTGCTCAG-3 '），另一端引物均为建库试剂盒里提供的CDS HI 3'PCR引物。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定，测序结果表明C1-CATH2的 基因序列由471个核苷酸组成，自5'端到3'端序列为： I ATGGCGGGGT GCTGGGTGCT GGTGCTGGCG CTGCTGGGGG GGGCCTGCGC CCTCCCGGCC 61 CCCCTGGCCT ACACCCAGGC GCTGGCTCAG GCCGTCGACT CCTACAACCA GCGCCCCGAG 121 GTGCCCAACG CCTTCCGGCT GCTCAGCGCC GACCCCGAGC CCGCCCCGGG CGTCGAGCTG 181 AGCTCCCTGC GGCTCCTCAA CTTCACCATG ATGGAGACCG AGTGCACCCC GAGCGCCCGC 241 GTGAACCCCG ATGACTGCGA CTTCAAGGAG AACGGGGTCA TCAAGGAGTG CTCGGGCCCG 301 GTGCAGTTTG GGCAGAGCTC CCCCGAGATC GACCTGCACT GCACCGACGC CTCCTCTGAT 361 CCGGTTCTCA TCCAGCGTGG CCGGTTCGGG CGCTTCCTGG GCAGAATCCG GCGCTTTCGG 421 CCCCGAATCA ACTTCGACAT CCGCGCCCGG GGCTCCATTC GCCTGGGCTG A 编码C1-CATH2的成熟肽位于第367-468位核苷酸，其成熟肽氨基酸序列为： Leu1Ile2Gln3Arg4Gly 5 Arg6 Phe7 Gly8 Arg9 Phe10 Leu11Gly12 Arg13 He14 Arg15 Arg16 Phe17 Arg18 Pro19 Arg20 He21 Gln22 Phe23 Glu24 He25 Arg26 Ala27 Arg28Gly29 Ser30 He31 Arg32 Leu33 Gly34 (LIQRGRFGRFLGRIRRFRPRINFDIRARGSIRLG) 〇
[0012] 2、C1_CATH2抑制细菌脂多糖（LPS)诱导的致炎因子的表达 小鼠巨噬细胞RAW264. 7用含有10%胎牛血清的DMEM培养基在37T的CO2培养箱中 培养，待细胞长到状态良好的对数生长期时，用〇. 25%的胰酶消化，弃去胰酶，用10%胎牛血 清的DMEM培养基吹下贴壁细胞。吹打均匀后细胞计数，将细胞浓度调整到IxlO 6/ml。将 吹打均匀的细胞加入到24孔板中，每孔lml，在37°C的CO2培养箱中培养过夜使细胞贴壁， 然后吸出上层清液弃去，加入960ul新鲜的含有10%胎牛血清的DMEM培养基，向阳性对照 组和加药组加入20ul -定浓度的LPS，再加入20ul用DMEM稀释的且经过过滤除菌的不同 浓度的C1-CATH2 (终浓度为5，10，20 ug/ml) -起孵育6h，空白对照加入40ul无血清 DMEM培养基处理6h，然后用RNA提取试剂盒提取总RNA，用单链cDNA合成试剂盒来合成 cDNA，并通过实时定量PCR (RT-PCR)来确定细胞因子肿瘤坏死因子（TNF-α )、白介素-1β (IL-Ιβ )和诱导型NO合酶（INOS)的表达量，每次实验设置5个重复。RNA提取试剂盒和 cDNA合成试剂盒都购自TaKaRa公司，操作按说明书进行。
[0013] 各细胞因子的上下游引物序列如下： TNF-α 的 5' 端引物：5' -CGGTGCCTATGTCTCAGC CT-3' 3 ' 端引物：5' -GAGGGTCTGGGCCATAGAAC-3' IL-I β 的 5' 端引物：5' -AT GGCAACTGTTCCTGAACTC-3' 3 ' 端引物：5' -GCCCATACTTTAGGAAGACA -3' INOS 的 5' 端引物为：5' -CTGCAGCACTTGGATCAGGAACCTG-3' 3 ' 端引物：5' -GGAGTAGCCTGTGTGCACCTGGAA-3' 内参 GAPDH 的 5 ' 端引物：5' -AAGCCCATCACCATCTTCCA-3' 3 ' 端引物：5, -CCTGCTTCACCACCTTCT TG -3，。 3、C1-CATH2负调节LPS诱导的NO和致炎因子的释放 小鼠巨噬细胞RAW264. 7用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养至生长对数期，胰酶 消化后，接种于24孔板中，每孔IxlO6个。在37°C的CO2培养箱中过夜培养使细胞贴壁。细 胞贴壁后，弃去上层清液，每孔加入960ul新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养基，再向各孔 中加入20ul不同浓度的C1-CATH2和20ul -定浓度的LPS，空白加入40ul无血清DMEM培 养基，处理24h。收集上清分别用Griess试剂盒和ELISA试剂盒检测NO和炎症因子的释放 量，每个实验组设置5个重复。Griess试剂盒购自碧云天生物试剂公司，ELISA试剂盒购自 欣博盛生物技术公司，所有的操作按照试剂盒说明书操作。
[0014] 4、Western blot方法检测C1-CATH2对炎症信号通路的影响 小鼠巨噬细胞RAW264. 7用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养至生长对数期，用胰 酶消化后，以IxlO6个/ml接种于6孔板中，每孔2ml。在37°C的CO2培养箱中过夜培养使 细胞贴壁，然后弃去细胞上层培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS :0. 8g NaCl ; 0.2g KCl; 2. 9g Na2HPO4. 12H20; 0· 27g KH2PO4溶于800ml去离子水，搅拌溶解，定容至1L，用浓Hcl调节PH 至7. 4,高压灭菌。）洗涤细胞2-3次，换为无血清DMEM培养基饥饿处理16h。每孔中加入 不同浓度的样品20ul (使每孔的终浓度为5,10,20ug/ml)，空白加入20ul无血清DMEM，处 理Ih后，向空白孔以外的各孔中加入20ul LPS(终浓度为100ng/ml)处理3h。IOOOg离心 5min收集细胞，用预冷的PBS洗涤细胞两次。每孔细胞内加入250ulRIPA细胞裂解液[50Mm Tris-HCl (PH7.4)，l%NonidetP-40, 0.25% 脱氧胆酸钠，150mM NaCl, lmMEDTA, IMm PMSF, IMm NaF，ImM Na3VO4,各 lug/ml 的 aprotinin, Ieupeptin 和 pepstatin]，冰上 裂解30min。4°C，12000g离心20min,小心吸取上清，并将上清分装至新的eppendorf管，吸 取2ul用Bradford法测定蛋白浓度。40ug裂解产物在12%的SDS-PAGE电泳后转移至PVDF 膜上，5%牛血清白蛋白封闭Ih;加特异一抗，一抗（ERK、p-ERK、p38、p-p38、JNK、p-JNK) (1:2000)购自 Cell Signaling Technology 公司，GAPDH (1:3000)购自 ComWin Biotech 公 司，按说明书操作，4°C孵育过夜；TBST(39gTris，89gNaCl，0.29gKCl，0.5%Tween，定 容至1000ml，用浓HCl调节PH至7. 4)洗涤3次，每次5min;然后加辣根过氧化酶（HRP) 标记羊抗兔抗体常温孵育Ih,二抗购自Cell Signaling Technology公司，TBST洗漆3次， 每次5min; ECL反应，暗室中曝光显影。
[0015] 本发明的有益效果在于：一种家鴻（CbJrWffiAa ) cathelicidin -C1-CATH2 肽及其基因、应用，属于生物医学【技术领域】。C1-CATH2肽全序列为：亮氨酸-异亮氨酸-谷 氨酰胺_精氨酸_甘氨酸_精氨酸_苯丙氨酸 -甘氨酸_精氨酸_苯丙氨酸_壳氨酸-甘 氨酸-精氨酸-异亮氨酸-精氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-脯氨酸-精氨酸-异 亮氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-天冬氨酸-异亮氨酸-精氨酸-丙氨酸-精氨酸-甘氨 酸-丝氨酸-异亮氨酸-精氨酸-亮氨酸-甘氨酸。C1-CATH2的基因由471个核苷酸组 成，其中编码成熟肽部分的为第367-468位核苷酸。化学合成C1-CATH2, i/? Wiro对细菌 脂多糖（LPS)诱导的炎症因子分泌及诱导型NO合酶的表达均具有明显的抑制作用。研究 表明，C1-CATH2是通过抑制MPK信号通路来抑制炎症因子的分泌。C1-CATH2结构简单，不 含有二硫键及环状结构，方便化学合成及基因工程制备，并且它对正常细胞的细胞毒性和 溶血活性都很低，能够在制备抗炎症药物中应用。C1-CATH2在体外对细菌脂多糖（LPS)诱 导的致炎因子表达和分泌，以及诱导型NO合酶表达(从而降低NO的释放水平)，都具有很明 显的抑制作用，并且它是通过抑制MAPK信号通路中的ERK和JNK的激活来抑制炎症因子的 分泌。MTT实验也显示了 C1-CATH2对正常细胞一RAW264. 7小鼠巨噬细胞的细胞毒性很弱， 溶血实验显示其对人红血球溶解性也很弱。
[0016]
【专利附图】
【附图说明】： 图1是RT-PCR检测C1-CATH2抑制LPS诱导的IL-I β的表达。
[0017] 图2是RT-PCR检测C1-CATH2抑制LPS诱导的TNF-α的表达。
[0018] 图3是RT-PCR检测C1-CATH2抑制LPS诱导的诱导型NO的表达。
[0019] 图4是Griess试剂盒检测C1-CATH2抑制LPS诱导的NO的释放。
[0020] 图5是ELISA试剂盒检测C1-CATH2抑制LPS诱导的TNF-α的释放。
[0021] 图6是ELISA试剂盒检测C1-CATH2抑制LPS诱导的IL-I β的释放。
[0022] 图7是ELISA试剂盒检测C1-CATH2抑制LPS诱导的IL-6的释放。
[0023] 图8是Western blot检测LPS抑制ERK1/2的磷酸化水平。
[0024] 图9是Western blot检测LPS抑制JNK1/2的磷酸化水平。
[0025] 图10是Western blot检测LPS抑制p-38的磷酸化水平。
[0026]
【具体实施方式】： 下面用实例来说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
[0027] 实施例I C1-CATH2肽前体序列的基因克隆及测序 (1)米用 RNeasy AxyPrep? Multisource Total RNA Miniprep Kit (Qiagen, union city，CA, USA)提取家鸽脾脏总RNA，所有操作按照试剂盒说明书进行。
[0028] (2) mRNA 分离纯化米用美国 PR0MEGA 公司的 PolyATtract? mRNA Isolation Systems试剂盒。
[0029] (3)利用 In-Fusion? SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 建 库试剂盒构建家鴻脾脏cDNA文库。PowerScript Reverse Transcriptase反转录合成cDNA 第一链。
[0030] 正向 SMARTer V Oligonucleot 引物：5, -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTG GCCATTACGGCCGGG-3， 反向 In-Fusion SMARTer CDSIII 弓丨物：5' -ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGA CATGT(30) N-1N-3,（N=A，G，C，orT;N-l= A, G，or C) 利用 Advantage DNA Polymerase 合成第二链，引物为：正向：5 ' -AAGCAGTGG TATCAACGCAGAGT-3'，反向引物同为In-Fusion SMRTer CDS III。按试剂盒提供的说明书 来构建cDNA文库。
[0031] (4)设计两条特异性正向引物（Pl、P2)和一条反向非特异性通用引物（⑶S IID，以 家鸽脾脏cDNA为模板，采用半巢式PCR的方法进行家鸽Cathelicidin-Cl-CATH2肽的基因 克隆筛选。
[0032] 正向 Pl :5, -ATGGCGAGCTGCTGGGCTGCT-3,； 正向 P2 :5' -AACGCCTTCCAGGCTGCTCAG-3' ； 反向非特异性通用引物为In-Fusion SMRTer CDS III，其序列为：5'-ATTCTAGAGGCCGA GGCGGCCGACATGT(30)N - IN-3，（N=A，G，C，orT;N - 1= A, G，orC)。
[0033] 具体操作是：以构建的cDNA文库为模板，以Pl和反向非特异性通用引物 In-Fusion SMARTer⑶S III作为上下游引物进行第一步PCR，反应条件为：94 T预变性5 min; 26个循环：94 T 变性 30 s, 57. 9 T 退火 30 s, 72 T 延伸 36 s; 72 T延伸 10 min; 4 °C保存。然后以第一步PCR产物为模板，以P2和反向非特异性通用引物In-Fusion SMARTer⑶S III为上下游引物来进行半巢式PCR第二步，反应条件设置为：94 °C预变性 5min; 26个循环：94 T变性30s, 56. 8 T退火30 s, 72 T延伸30 s;72 T进一步延 伸7min; 4 °C保存。扩增完成后用胶回收试剂盒(天根生物）进行目的片段回收。
[0034] (5)将回收的目的DNA片段与测序载体pMD19-T Vecter连接，转化进CaCl2-MgCl2 法制备好的DH5 α感受态细胞。取100 μ 1转化菌液均匀涂布在含有100 μ lg/ml氨苄青 霉素（Amp)的LB琼脂培养基平板上；表面瞭干后，放在37°C恒温培养箱中倒置培养12-16 h。挑取单菌落用M13引物进行菌落PCR检测插入片段大小。挑取阳性菌落，摇菌提取质粒， 使用 Applied Biosystems DNA sequencer, model ABI PRISM 377 进行核苷酸测序。
[0035] pMD19_T Vecter 测序通用引物： 正向 M13F :5, -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3，； 反向 M13R :5' -GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'。
[0036] (6)测序结果 获得的家鸽cathelicidin的基因序列，由471个核苷酸序列组成，从5'端到3'端为： I ATGGCGGGGT GCTGGGTGCT GGTGCTGGCG CTGCTGGGGG GGGCCTGCGC CCTCCCGGCC 61 CCCCTGGCCT ACACCCAGGC GCTGGCTCAG GCCGTCGACT CCTACAACCA GCGCCCCGAG 121 GTGCCCAACG CCTTCCGGCT GCTCAGCGCC GACCCCGAGC CCGCCCCGGG CGTCGAGCTG 181 AGCTCCCTGC GGCTCCTCAA CTTCACCATG ATGGAGACCG AGTGCACCCC GAGCGCCCGC 241 GTGAACCCCG ATGACTGCGA CTTCAAGGAG AACGGGGTCA TCAAGGAGTG CTCGGGCCCG 301 GTGCAGTTTG GGCAGAGCTC CCCCGAGATC GACCTGCACT GCACCGACGC CTCCTCTGAT 361 CCGGTTCTCA TCCAGCGTGG CCGGTTCGGG CGCTTCCTGG GCAGAATCCG GCGCTTTCGG 421 CCCCGAATCA ACTTCGACAT CCGCGCCCGG GGCTCCATTC GCCTGGGCTG A 编码C1-CATH2肽的成熟肽位于第367-468位核苷酸，其成熟肽氨基酸序列为： Leu1Ile2Gln3Arg4Gly 5 Arg6 Phe7 Gly8 Arg9 Phe10 Leu11Gly12 Arg13 He14 Arg15 Arg16 Phe17 Arg18 Pro19 Arg20 He21 Gln22 Phe23 Glu24 He25 Arg26 Ala27 Arg28Gly29 Ser30 He31 Arg32 Leu33 Gly34 (LIQRGRFGRFLGRIRRFRPRINFDIRARGSIRLG) 实施例2 C1-CATH2肽抑制LPS诱导的致炎细胞因子及NO合酶（INOS)基因的表达 小鼠巨噬细胞RAW264. 7用含有10%胎牛血清的DMEM培养基在37T的CO2培养箱中培 养，待细胞长到状态良好的对数生长期时，用〇. 25%的胰酶消化，弃去胰酶，用10%胎牛血清 的DMEM培养基吹下贴壁细胞。吹打均匀后细胞计数，将细胞浓度调整到IxlO 6/ml。将吹 打均匀的细胞加入到24孔板中，每孔lml，在37°C的CO2培养箱中培养过夜使细胞贴壁，然 后吸出上层清液弃去，加入960ul新鲜的含有10%胎牛血清的DMEM培养基，向阳性对照组 和加药组加入20ul -定浓度的LPS，再加入20ul用DMEM稀释的且经过过滤除菌的不同浓 度的C1-CATH2 -起孵育6h，空白对照加入40ul无血清DMEM培养基处理6h，然后用RNA提 取试剂盒提取总RNA，用单链cDNA合成试剂盒来合成cDNA，并通过实时定量PCR (RT-PCR) 来确定细胞因子：TNF-a、IL-I β和诱导型NO合酶（INOS)的表达量，每次实验设置5个重 复。RNA提取试剂盒和cDNA合成试剂盒都购自TaKaRa公司。各细胞因子的上下游引物请 参见上文。
[0037] 实验结果表明，C1-CATH2在体外以剂量依赖的方式抑制LPS诱导的致炎因子， TNF-a、IL-6和诱导型NO合酶的基因表达。在20ug/ml的C1-CATH2存在下，几乎完全抑制 了 100ng/ml LPS诱导的上述蛋白基因的表达。
[0038] 实施例3 C1-CATH2肽在体外抑制LPS诱导的致炎细胞因子及NO的分泌 小鼠巨噬细胞RAW264. 7用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养至生长对数期，胰酶 消化后，接种于24孔板中，每孔1x106个。在37 °C的C02培养箱中过夜培养使细胞贴壁。 细胞贴壁后，弃去上层清液，每孔加入960ul新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养基，再向各 孔中加入20ul不同浓度的C1-CATH2和20ul -定浓度的LPS，空白加入40ul无血清DMEM 培养基，处理24h。加药处理24h的样品用于收集上清分别用Griess试剂盒和ELISA试剂 盒检测NO和炎症因子的释放量，每个实验组设置5个重复。Griess试剂盒购自碧云天生物 试剂公司，ELISA试剂盒购自欣博盛生物技术公司，所有的操作按照试剂盒说明书操作。结 果如图4-7所示。图4-7显示：20ug/ml的C1-CATH2存在下，LPS诱导的NO和重要的致炎 因子（TNF-a、IL-I β、IL-6)的释放被明显的抑制。
[0039] 实施例4 Western blot方法检测C1-CATH2对MAPK炎症信号通路的影响 小鼠巨噬细胞RAW264. 7用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养至生长对数期，用胰 酶消化后，以IxlO6个/ml接种于6孔板中，每孔2ml。在37°C的CO2培养箱中过夜培养使 细胞贴壁，然后弃去细胞上层培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS:0.8gNaCl ; 0. 2gKCl; 2.9g Na2HPO4. 12H20; 0· 27g KH2PO4溶于800ml去离子水，搅拌溶解，定容至1L，用浓HCl调节pH 至7. 4,高压灭菌。）洗涤细胞2-3次，换为无血清DMEM培养基饥饿处理16h。每孔中加入 不同浓度的样品20ul (使每孔的终浓度为5,10,20ug/ml)，空白加入20ul无血清DMEM，处 理Ih后，向空白孔以外的各孔中加入20ul LPS(终浓度为100ng/ml)处理3h。IOOOg离心 5min收集细胞，用预冷的PBS洗涤细胞两次。每孔细胞内加入250ulRIPA细胞裂解液[50Mm Tris-HCl (PH7. 4)，l%Nonidet P-40, 0.25% 脱氧胆酸钠，150mM NaCl, ImM EDTA, IMm PMSF, IMm NaF，ImM Na3VO4,各 lug/ml 的 aprotinin, Ieupeptin 和 pepstatin]，冰上 裂解30min。4°C，12000g离心20min,小心吸取上清，并将上清分装至新的eppendorf管，吸 取2ul用Bradford法测定蛋白浓度。40ug裂解产物在12%的SDS-PAGE电泳后转移至PVDF 膜上，5%牛血清白蛋白封闭Ih;加特异一抗，一抗（ERK、p-ERK、p38、p-p38、JNK、p-JNK) (1:2000)购自 Cell Signaling Technology 公司，GAPDH (1:3000)购自 ComWin Biotech 公 司，按说明书操作，4°C孵育过夜；TBST(39gTris，89gNaCl，0.29gKCl，0.5%Tween，定 容至1000ml，用浓HCl调节PH至7. 4)洗涤3次，每次5min ;然后加辣根过氧化酶（HRP) 标记羊抗兔抗体常温孵育Ih,二抗购自Cell Signaling Technology公司，TBST洗漆3次， 每次5min; ECL反应，暗室中曝光显影。结果如图8-10所示。图8-10显示C1-CATH2以剂 量依赖的方式抑制由LPS诱导引起的ERK，p38和JNK的磷酸化。由Western blot结果可 知，在C1-CATH2浓度为10ug/ml时，100ng/ml的LPS诱导的ERK和JNK的磷酸化几乎被完 全抑制，而P38的磷酸化也部分被抑制。由此可知，C1-CATH2抑制LPS诱导的MPK信号激 活主要是通过抑制ERK和JNK信号，从而调节下致炎症因子的分泌。
【权利要求】
1. 一 种家鴻/iFia ) Cathelicidin -C1-CATH2 肤，其特征在于：所述 C1-CATH2肽是由家鸽Cathelicidin基因编码的一种直链多肽，富含碱性氨基酸，C1-CATH2 肽的全序列为：亮氨酸-异亮氨酸-谷氨酰胺-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-甘 氨酸-精氨酸_苯丙氨酸 _壳氨酸-甘氨酸_精氨酸_异壳氨酸-精氨酸 _精氨酸_苯丙 氨酸-精氨酸-脯氨酸-精氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-天冬氨酸-异亮氨 酸-精氨酸-丙氨酸-精氨酸-甘氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-精氨酸-亮氨酸-甘氨酸。
2. 根据权利要求1所述的一种家鴻（Cb/膽b /iria ) Cathelicidin -C1-CATH2肽， 其特征在于：编码C1-CATH2肽的基因由471个核苷酸组成，自5'端至3'端序列为： I ATGGCGGGGT GCTGGGTGCT GGTGCTGGCG CTGCTGGGGG GGGCCTGCGC CCTCCCGGCC 61 CCCCTGGCCT ACACCCAGGC GCTGGCTCAG GCCGTCGACT CCTACAACCA GCGCCCCGAG 121 GTGCCCAACG CCTTCCGGCT GCTCAGCGCC GACCCCGAGC CCGCCCCGGG CGTCGAGCTG 181 AGCTCCCTGC GGCTCCTCAA CTTCACCATG ATGGAGACCG AGTGCACCCC GAGCGCCCGC 241 GTGAACCCCG ATGACTGCGA CTTCAAGGAG AACGGGGTCA TCAAGGAGTG CTCGGGCCCG 301 GTGCAGTTTG GGCAGAGCTC CCCCGAGATC GACCTGCACT GCACCGACGC CTCCTCTGAT 361 CCGGTTCTCA TCCAGCGTGG CCGGTTCGGG CGCTTCCTGG GCAGAATCCG GCGCTTTCGG 421 CCCCGAATCA ACTTCGACAT CCGCGCCCGG GGCTCCATTC GCCTGGGCTG A 编码C1-CATH2肽的成熟肽位于第367-468位核苷酸，编码34个氨基酸残基，其成熟 肤氛基酸序列为：Leu1Ile2Gln3Arg4 Gly5 Arg6 Phe7 Gly8 Arg9 Phe1。Leu11Gly12 Arg13 Ile14 Arg15 Arg16 Phe17 Arg18 Pro19 Arg20 He21 Gln22 Phe23 Glu24 He25 Arg26 Ala27 Arg28Gly29 Ser30 He31 Arg32 Leu33Gly340
3. 根据权利要求 1 所述的一种家鴻/iria ) Cathelicidin -C1-CATH2 肽， 其特征在于：所述C1-CATH2肽应用于制备抗炎症的治疗药物。
4. 根据权利要求2所述的一种家鴻（Cb/腫知 /iria )Cathelicidin -C1-CATH2肽的 编码基因的应用，其特征在于：据所述编码C1-CATH2肽的基因编码合成的C1-CATH2肽溶于 灭菌超纯水，用于药理活性检测。
【文档编号】A61P31/00GK104211794SQ201410412302
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年8月21日 优先权日:2014年8月21日
【发明者】于海宁, 王义鹏, 鲁一灵, 卫林 申请人:大连理工大学