一种诱导多能干细胞的培养基及其用途

一种诱导多能干细胞的培养基及其用途
【专利摘要】本发明提供了一种培养诱导多能干细胞的培养基，所述培养基中含有人参皂苷单体Rb1、人参皂苷单体Rb3和/或人参皂苷单体Rd。本发明还提供一种诱导多能干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：1)将多能性相关基因导入供体细胞；2)将已导入多能性相关基因的供体细胞制备为单细胞悬液，使用本发明的培养基培养步骤1)中导入多能性相关基因的供体细胞；3)鉴定诱导多能干细胞克隆。鉴于目前ips应用于临床的瓶颈，本发明发现了人参皂苷单体Rb1、人参皂苷单体Rb3、人参皂苷单体Rd能显著提高ips诱导效率，并可以显著延缓细胞的衰老和促进细胞的增殖，将对整个干细胞研究及新药研发领域产生深远影响。
【专利说明】一种诱导多能干细胞的培养基及其用途

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及人参皂苷的用途，具体涉及含有人参皂苷单体的 多能干细胞培养基在提高细胞重编程效率、延缓细胞衰老、促进细胞增殖方面的用途。 技术背景
[0002] 中草药为药物提供广阔的来源，在传统医学中起重要作用。一些中药对脑部发育、 免疫性等有显著疗效，但具体的分子机制还不清楚，包括比如作用靶标、信号通路等。中国 传统医学中，中药人参能增强记忆力，明目定神。分析发现人参含有特定活性物质-人参 皂苷（gins en〇Side，GS)。人参皂苷具有类似基本化学结构，大致可分类为达玛烷型和齐墩 果烷型。由于对单体进行生物活性研究，易于阐明其确切的药理作用，发现活性较强的化 合物，随着现代分离和分析技术的进步，人参化学成分得到了进一步的阐明，人参皂苷是人 参主要的生物活性物质，现已确证人参皂苷单体约40种；根据人参皂苷的皂甙元，可以将 他们分为两组：人参二醇（例如Rgl，Rbl，Re，Rf，RC，RB2, Rb3等）和原人参三醇型（例如 RS3，RK1，RG5，RS4，RS5等）。其中，Rd、Rgl已用于研究神经细胞增殖的。但是人参皂苷在 正常细胞中尤其是在干细胞中固定功能和作用机制并不清楚。
[0003] 其中，现有技术表明，人参皂苷Rbl在西洋参（花旗参）中含量最多，可影响动物 睾丸的潜力，小鼠的胚胎发育等。协调胆碱系统的功能，增加乙酰胆碱合成、释放，改善记忆 力。人参皂苷Rb3可增强心肌功能，保护人体自身免疫系统。可以用于各种不同原因引起 的心肌收缩性衰竭的治疗。人参皂苷Rd可减少乙酰胆碱诱发的豚鼠离体子宫收缩。对大 鼠有减慢心率和双相性血压（先升后降）作用。可抑制猫的行为和脑电图。此外有抗疲劳 作用。
[0004] 2006年，Yamanaka等人建立了一种新的重编程技术，建立了诱导多能性干细胞 (induced pluripotent stem cell，iPS cell)系。2007 年，Yamanaka 和 Thomson 研究组 分别建立了人的iPS细胞系。这一重大科学进展使体细胞重编程研究具体到了基因层面， 为研究和应用提供宝贵的细胞资源。由于iPS细胞来自于体细胞而非胚胎，可避免伦理争 议，具有广阔的应用前景。
[0005] 细胞重编程是组织修复、器官重建和个体化的再生医疗的基石。如果能掌握细胞 重编程技术，将为组织器官重建等重大科学问题扫除屏障。利用自身体细胞重编程为iPS 细胞，通过体内外诱导技术获得目标组织和器官，既解决了免疫排斥问题，也解决供型不足 的问题，将会成为人类医疗历史上重要里程碑。细胞重编程建立疾病模型ips细胞系可作 为疾病机制机理的研究材料，为采取相应的治疗手段提供最可靠的医学依据。肿瘤、糖尿病 和神经系统疾病等疑难疾病的发生、发展受表观遗传修饰调控，相对应的，细胞重编程对基 因定向编辑的研究将对这些疑难疾病的预防、治疗提供新的思路。
[0006] 在开展人类ESC、iPSC治疗疾病进程中，需要解决很多科学问题。比如高效获得 非病毒非整合完全重编程iPSC，高效诱导iPSC分化为目的细胞、高效去除未分化的残留细 胞，快速准确的将多能性干细胞进行胚胎干细胞与iPSC的多能性研究，确认分化获得的目 的细胞功能、表观遗传修饰等与体内细胞完全一致性，大规模培养非动物源性（xeno-free) 干细胞及分化细胞等问题。目前在某些领域取得一些进展，比如Warren等通过mRNA诱导 iPSC，能高效获得非病毒非整合iPSC。但要将iPSC应用于临床治疗，还有很长一段路需要 摸索。早期iPSC诱导效率仅为0. 01-0. 5%，与体细胞核移植为技术基础重编程效率存在很 大差距，因此，如何提高iPSC诱导效率是iPSC研究领域的热点研究内容之一。筛选新供体 细胞、添加活性小分子诱导是有效提高iPSC重编程效率方法之一，特别是候选小分子能大 幅度提高ips诱导效率，现在急需解决的问题是临床前安全性确认。
[0007] 因此，筛选安全有效的重编程活性小分子具有重要实用价值。


【发明内容】

[0008] 如本文中所使用地，术语"iPS"与"诱导多功能干细胞"可互换地使用，二者具有 相同的含义。
[0009] 本发明涉及的人参皂苷单体为人参皂苷单体Rbl、人参皂苷单体Rb3、人参皂苷单 体Rd。
[0010] 本发明的一个目的在于，提供一种诱导多能干细胞培养基，所述培养基含有Rbl、 人参皂苷单体Rb3和/或人参皂苷单体Rd，并提供了所述培养基在制备诱导多能干细胞中 的用途。
[0011] 本发明的又一个目的在于，提供人参皂苷单体Rbl、人参皂苷单体Rb3和/或人参 皂苷单体Rd在制备用于防治衰老的药物组合物或者在制备用于延缓衰老的保健品或生活 产品中的用途。
[0012] 本发明的目的还在于，提供人参皂苷单体Rb3和/或人参皂苷单体Rd在制备用于 促进细胞增殖的组合物中的用途。
[0013] 本发明的目的还在于提供采用人参皂苷单体Rb3和/或人参皂苷单体Rd促进细 胞增殖的方法。
[0014] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。
[0015] 在本发明的一个方面，本发明提供了一种培养诱导多能干细胞的培养基，其特征 在于，所述培养基由常规诱导多能干细胞培养基以及人参皂苷单体Rbl、人参皂苷单体Rb3 和/或人参皂苷单体Rd组成。
[0016] 优选地，所述培养基为含有人参皂苷单体Rbl、人参皂苷单体Rb3和/或人参皂苷 单体Rd的K0SR培养基。
[0017] 优选地，所述培养基中人参皂苷单体Rbl、人参皂苷单体Rb3和/或人参皂苷单体 Rd的工作浓度为1-100 μ M，优选地，浓度为5-100 μ M，进一步优选地，浓度为25-100 μ M，更 优选地，浓度为50-75 μ Μ。优选地，在制备所述培养基时，将所述人参皂苷单体Rbl、人参皂 苷单体Rb3和/或人参皂苷单体Rd溶解于微量的DMS0中，然后添加到培养基中。
[0018] 在本发明的另一个方面，本发明提供一种诱导多能干细胞的方法，所述方法包括 以下步骤：
[0019] 1)将多能性相关基因导入供体细胞；
[0020] 2)将已导入多能性相关基因的供体细胞制备为单细胞悬液，使用本发明的培养基 培养步骤1)中导入多能性相关基因的供体细胞，得到诱导多能干细胞
[0021] 优选地，所述方法还包括鉴定诱导多能干细胞的步骤。
[0022] 优选地，所述步骤1)中通过包括以下步骤的方法实现的：
[0023] a.将供体细胞接种到含有SP (青链霉素双抗溶液）的10 % DMEM培养液中；优选 地，所述细胞的接种密度为1. 5-2*104/cm2 ;
[0024] b. -天后，将所述含有SP的10% DMEM培养液换成不含SP的10% DMEM，并使用 含有多能性相关基因的病毒感染供体细胞；
[0025] 优选地，所述多能性相关基因为Klf4、Sox2、Nanoge和0ct4 ;
[0026] 优选地，在感染的同时，加入8 μ g/ml聚凝胺；
[0027] c.诱导24小时后，弃去含有病毒的培养液，换上含有SP的10% DMEM，隔天再换液 一次；
[0028] d.感染后第六天得到感染好的供体细胞。
[0029] 优选地，所述步骤2)中通过包括以下步骤的方法实现的：
[0030] I )将已导入多能性相关基因的供体细胞制备为单细胞悬液，并接种到饲养层细 胞上；
[0031] 优选地，使用胰酶将供体细胞消化成单细胞，优选地，所述胰酶的浓度为 0.25g/100mL ；
[0032] 优选地，供体细胞与饲养层细胞的数量比优选为1 :6-1 :9,更优选为1 :8 ;
[0033] 优选地，所述饲养层细胞为经丝裂霉素 C处理过的无分化能力的小鼠成纤维细 胞；
[0034] II )将步骤1)中接种好的细胞使用10% DMEM的培养液培养1-2天；
[0035] III)弃去10% DMEM的培养液，使用本发明的培养基培养细胞；
[0036] IV )每隔一天更换一次培养基；
[0037] V )培养3-4天后，得到诱导多能干细胞；
[0038] 在本发明的再一个方面，本发明提供了人参皂苷单体Rbl、人参皂苷单体Rb3和/ 或人参皂苷单体Rd在制备用于防治衰老的药物组合物或者在制备用于延缓衰老的保健品 或生活产品中的用途。
[0039] 在本发明的再另一个方面，本发明提供了人参皂苷单体Rb 1、人参皂苷单体Rb3和 /或人参皂苷单体Rd在制备用于促进细胞增殖的药物中的用途。
[0040] 本发明具有以下的意义：
[0041] 鉴于目前ips应用于临床的瓶颈，本发明发现了人参皂苷单体Rbl、人参皂苷单体 Rb3、人参皂苷单体Rd能显著提高ips诱导效率，并可以显著延缓细胞的衰老和促进细胞的 增殖，由于包括人参皂苷在内的中草药提取物通过临床实践证明安全性较高。因此，本申请 的发现可以加速其在临床上的应用并开发出基于干细胞调控的药物，将对整个干细胞研究 及新药研发领域产生深远影响。

【专利附图】

【附图说明】
[0042] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0043] 图1显示了在ips诱导过程中，加入不同人参皂苷单体处理后的克隆数统计结果。 结果表明相对于对照组（DMS0组），经Rd、Rbl、Rb3处理后的iPSC克隆数显著增多，提示 Rd、Rbl、Rb3对ips诱导有显著的促进作用，柱状图是一个统计的结果。
[0044] 图2是流式细胞仪分析的结果，对诱导第10天的MEF细胞进行0CT4-GFP阳性细 胞数的统计，结果表明经人参皂苷单体Rd，Rb3处理过的实验组中GFP阳性细胞数目远远多 于对照组（DMS0组），其中Vc是作为阳性对照组，Vc在促进细胞重编程中的作用已经被报 道过。
[0045] 图3显示的是MEF细胞的细胞周期分析，Hoechst核定位，EdUS对S期细胞进行 标记染色，PHH3对Μ期细胞进行标记染色，对不同细胞周期包括M，S和细胞总数进行了标 记，以验证药物对细胞的增殖影响，结果表明人参皂苷单体（Rbl，Rb3, Rd)可以部分提高细 胞增殖。
[0046] 图4显示的是MEF细胞中Μ期细胞所占的比例，经人参皂苷单体处理后的MEF细 胞处于Μ期的细胞比例高于对照组。
[0047] 图5显示的是MEF细胞的状态，传到第7代时状态变得不好，有很多细胞开始凋 亡，如对照中所示。在培养过程中加入了人参皂苷单体的MEF却能保持很好的生长状态。
[0048] 图6为不同培养液培养的MEF细胞中衰老基因的表达情况，在加入人参皂苷培养 液中生长的MEF细胞表达衰老基因明显低于对照组。当细胞传代至第七代时，正常培养液 中的细胞出现明显的凋亡现象，而在加入人参皂苷单体的培养液中生长的MEF细胞状态良 好，极少出现凋亡
[0049] 图7为衰老基因（P21、btg2、gadd45b)的表达水平比较，在加入人参皂苷培养液中 生长的MEF细胞表达衰老基因明显低于对照组（DMS0)，图中将对照组的基因表达水平设置 为1，人参皂苷培养液中培养的细胞的衰老基因表达水平明显低于对照组。

【具体实施方式】
[0050] 丰要材料和试剂
[0051] 低温保存箱购自中国，海尔；制冰机购自中国，唯利安；液氮罐购自中国，东亚；四 度离心机购自美国，Beckman ;生物安全柜、二氧化碳培养箱和Nanodrop购自美国，Thermo ; 体式显微镜、石錯切片机购自德国，Leica;细胞计数仪、纯水仪、病毒超滤离心管（Amicon ultra-15 centrifugal filter unit)购自美国，Millipore;电子天平购自德国，赛多利斯； 移液枪、多聚酶链式反应（PCR)仪购自德国，Eppendorf ;激光共聚焦显微镜购自德国，Carl Zeiss ;实时荧光定量PCR仪购自美国，Talent ;灭菌锅购自日本，Sanyo ;正置显微镜购自日 本，Olympus ;
[0052] 电泳仪套装，GelDoc XR凝胶成像系统购自美国，BI0-RAD ;圆形玻片（Coverslip) 购自美国Bellco Glass。除非特别指明，本文中的试剂来源如下：0pti-MEM培养液， Invitrogen 公司；Knock0ut?DMEM 培养液，Invitrogen 公司；KnockOut? 血清（K0SR), Invitrogen 公司；胎牛血清（Fetal bovine serum, FBS), Invitrogen 公司；0.05 % 及 0.25%胰蛋白酶，Invitrogen公司；100X链霉素-青霉素（S-P), Invitrogen公司；二甲基 亚砜（DMS0)，Invitrogen公司；人参皂苷单体（Rd，Rbl，Rb3)，上海智化医药科技有限公司； ΙΟΟχ 非必需氨基酸（Non essential amino acids，NEAA)，Invitrogen 公司；100 X 谷氨醜 胺，Invitrogen 公司；N_2 supplement, Invitrogen 公司；B_27Supplements, Invitrogen 公司；i3-mercaptoethanol(i3-疏基乙醇，100M)，Invitrogen 公司；lOOx 链霉素 / 青霉 素（Streptomycin/Penicillin, SP), Invitrogen 公司；TrypLE?, Invitrogen 公司；明胶， Sigma 公司；丝裂霉素 C，Sigma;SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus-，Real_Time 试剂盒，日本 Τ0Υ0Β0 公司；TRIzol，Invitrogen 公司；pMX_0ct4，pMX_Sox2，pMX-c-Myc 和 pMX-Klf4质粒，Addgene公司；RNA Reverse试剂盒，Invitrogen公司；AP试剂盒，碧云天； 感受态DH5a菌株，TransGen公司；Triton X-100,北京索莱宝科技有限公司；多聚甲醛 (PFA), Sigma ；Hoechst 33342, Invitrogen。
[0053] 除非特别指明，本文中所用到的细胞，购自中国科学院动物研究所。
[0054] 除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商 购获得。
[0055] 实施例1培养某的制各
[0056] K0SR培养基为一种用于培养干细胞的常规培养基，本实施例中的K0SR培养基购 自Invitrogen公司。配方如表1所示
[0057] 表1 K0SR培养基的配方
[0058]

【权利要求】
1. 一种用于培养诱导多能干细胞的培养基，其特征在于，所述培养基由常规诱导多能 干细胞培养基以及人参皂苷单体Rbl、人参皂苷单体Rb3和/或人参皂苷单体Rd组成。
2. 根据权利要求1所述的培养基，其中，所述培养基为含有人参皂苷单体Rbl、人参皂 苷单体Rb3和/或人参皂苷单体Rd的KOSR培养基。
3. 根据权利要求1或2所述的培养基，其中，所述培养基中人参皂苷单体Rbl、人参皂 苷单体Rb3和/或人参皂苷单体Rd的浓度为1-100 μ M，优选地，浓度为5-100 μ M，进一步 优选地，浓度为25-100 μ Μ，更优选为50-75 μ Μ。
4. 一种制备如权利要求1-3中任一项所述的培养基的方法，包括将人参阜苷单体Rbl、 人参皂苷单体Rb3和/或人参皂苷单体Rd溶解于微量的DMSO中得到溶液，然后将上述溶液 加入到常规培养基中，使所述培养基中人参皂苷单体Rbl、人参皂苷单体Rb3和/或人参皂 苷单体Rd的浓度为1-100 μ M，优选地，浓度为5-100 μ M，进一步优选地，浓度为25-100 μ M， 更优选为50-75 μ Μ。
5. -种诱导多能干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： 1) 将多能性相关基因导入供体细胞； 2) 将已导入多能性相关基因的供体细胞制备为单细胞悬液，使用权利要求1-3中任一 项所述的培养基培养步骤1)中导入多能性相关基因的供体细胞，得到诱导多能干细胞； 优选地，所述方法还包括鉴定诱导多能干细胞的步骤。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤1)是通过包括以下步骤的方法 实现的： a. 将供体细胞接种到含有SP的10% DMEM培养液中； 优选地，所述细胞的接种密度为1. 5-2*104/cm2 ; b. -天后，将所述含有SP的10% DMEM培养液换成不含SP的10% DMEM，并使用含有 多能性相关基因的病毒感染供体细胞； 优选地，所述多能性相关基因为Klf4、Sox2、Nanoge和0ct4 ; 优选地，在感染的同时，加入8 μ g/ml聚凝胺； c. 诱导24小时后，弃去含有病毒的培养液，换上含有SP的10% DMEM，隔天再换液一 次； d. 感染后第六天得到感染好的供体细胞。
7. 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述步骤2)是通过包括以下步骤的 方法实现的： I )将已导入多能性相关基因的供体细胞制备为单细胞悬液，并接种到饲养层细胞 上； 优选地，使用胰酶将供体细胞消化成单细胞，优选地，所述胰酶的浓度为 0.25g/100mL ； 优选地，供体细胞与饲养层细胞的数量比优选为1 :6-1 :9,更优选为1 :8 ; 优选地，所述饲养层细胞为经丝裂霉素 C处理过的无分化能力的小鼠成纤维细胞； II )将步骤1)中接种好的细胞使用10% DMEM的培养液培养1-2天； III)弃去10% DMEM的培养液，使用如权利要求1-3中任一项所述培养基培养细胞； IV )每隔一天更换一次培养基； V )培养3-4天后，得到诱导多能性干细胞克隆。
8. 人参皂苷单体Rbl、人参皂苷单体Rb3和/或人参皂苷单体Rd在制备用于防治衰老 的药物组合物或者在制备用于延缓衰老的保健品或生活产品中的用途。
9. 人参皂苷单体Rbl、人参皂苷单体Rb3和/或人参皂苷单体Rd在制备用于促进细胞 增殖的药物中的用途。
【文档编号】A61P39/06GK104195103SQ201410394740
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月12日 优先权日:2014年8月12日
【发明者】周琪, 王秀杰, 顾奇, 郝捷, 韩伟方, 刘鑫, 王磊, 王柳 申请人:中国科学院动物研究所, 中国科学院遗传与发育生物学研究所