一种冠状动脉微血管痉挛猪模型的建立方法
【专利摘要】本发明提供的一种冠状动脉微血管痉挛猪模型的建立方法，属于医疗模型【技术领域】，实验猪双侧股动脉游离后，穿线结扎该股动脉远端，左侧鞘管送入猪尾导管，测定血流动力学指标；右侧动脉鞘管中，对冠状动脉造影显示前降支中段，冠脉内注射神经肽Y，得冠状动脉微血管痉挛猪模型。通过本发明方法建立的动物模型，特异性好，更好地拟合了临床发病实际，符合临床心理应激特点，操作简单、科学合理、建模时间短、创伤性小、动物死亡率低，能够实现在载体上评价冠脉微血管的功能，定性定量评价微血管痉挛的状态和程度，并且能够实时观测，为基础临床研究提供了新的研究手段，适合推广应用。
【专利说明】一种冠状动脉微血管痙挛猪模型的建立方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医疗模型【技术领域】，涉及一种冠状动脉微血管痉挛猪模型的建立方法。
【背景技术】
[0002]冠脉痉挛一斑块破裂一血栓形成一急性冠脉事件，是目前冠心病发病的主要机理。冠状动脉痉挛(CAS)是指各种原因引起冠脉平滑肌节段或弥漫性痉挛性收缩，引起心肌缺血，甚至心肌坏死。在临床上，CAS不仅是变异性心绞痛的主要发病原因，而且与急性心肌梗死，恶性心律失常和心源性猝死的发病密切相关。近期研究表明，CAS不仅可以发生在冠状动脉有损害者，也可发生在冠状动脉正常者。即使大血管无明显狭窄，反复发生的微血管、小血管痉挛也可使近期和远期的心血管事件发生率和死亡率增加。因此，对冠脉系统中小血管和微血管痉挛的研究是非常必要的。
[0003]目前关于冠状动脉微血管的研究与外周微循环研究相比，冠脉微循环研究明显滞后，与基础研究比，临床研究存在着很大差距(Circulat1n，1997，95: 522)。因人体实验有许多局限性和不安全性，所以建立合适的CAS动物模型进行实验研究更有实际意义。目前应用于CAS研究的动物模型建模方法，包括药物刺激法(麦角新碱、乙酰胆碱、五羟色胺等)、内皮损伤法和外膜缠绕法等。目前临床应用较多的一类痉挛模型是内皮损伤法，这些模型大多是在不同种类动物如猴、猪、大鼠的血管中用机械性(主要为球囊内皮剥脱法)、化学性方法来造成血管局部炎症和非增生性损伤，并通过高胆固醇饮食等辅助手段造成局部血管收缩反应增强，使得血管造影中呈现出对诱导刺激剂的反应性收缩增强。但是，上述的这些模型作用部位多位于心外膜大血管，并不能特异性造成小、微血管痉挛，与临床心理应激等特点有一定差距，而且操作复杂、创伤性大、建模周期长，因此这些模型很难广泛应用于实验研究中。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对上述现有技术存在的不足，提供一种符合临床心理应激特点的，特异性好、操作简单、科学合理、建模时间短，能够定性定量观察的冠状动脉微血管痉挛的动物模型建立方法。
[0005]神经肽Y (NPY)在人体许多系统和器官中起着调节作用，尤其是在心血管系统中的作用已经得到公认。临床上，神经肽Y的大量释放可以引起特定的冠脉痉挛，从而引发一系列的心血管疾病，且神经肽Y对微循环血流减少的影响具有时效关系和量效关系。
[0006]本发明即是在此理论基础上，采用药物刺激法，提供一种通过在小型猪冠脉内注射神经肽Y药物，造成微血管收缩痉挛，来建立用于此类疾病的动物模型的方法。本建模方法形成的时间快，1min内即可出现病发症状，通过控制NPC注射量可改变发病时间及症状表现，符合血管痉挛患者临床发病特点。
[0007]本发明一种冠状动脉微血管痉挛猪模型的建立方法，技术方案为: 实验猪双侧股动脉游离后，穿线结扎该股动脉远端，左侧鞘管送入猪尾导管，测定血流动力学指标；右侧动脉鞘管中，对冠状动脉造影显示前降支中段，冠脉内注射神经肽Y，得冠状动脉微血管痉挛猪模型。
[0008]I本发明模型建立方法，其步骤为:
O建模前动物处理
猪禁食8h，备皮，测体重，肌肉注射氯胺酮10 mg/kg诱导麻醉，气管插管，呼吸机辅助呼吸，连接心电图，在猪耳后大静脉处建立静脉通路，缓慢静脉推注3%戊巴比妥钠5 ml,以
3L/min流量给氧，术中可追加戊巴比妥钠保持麻醉状态。
[0009]2)冠脉内注射生理盐水-神经肽Y注射剂建立模型
猪双侧腹股沟部位，局部麻醉，钝性分离暴露双侧股动脉，穿线结扎该股动脉远端，将穿刺针刺入股动脉，迅速送入导丝，沿导丝送入动脉鞘管，随即弹丸式静脉注入肝素8000U，手术过程中每隔Ih追加2000U ;沿左侧股动脉动脉鞘管，送入猪尾导管至左心室；经右侧动脉鞘管将微导管定位在前降支中段，对冠状动脉造影显示前降支中段，3min内匀速注射含I?6nmol神经肽Y的生理盐水-神经肽Y注射剂10ml。
[0010]所述的生理盐水-神经肽Y注射剂，神经肽Y剂量优选6nmol。
[0011]上述步骤2)中，采用1%利多卡因局部麻醉。
[0012]上述步骤2)中，所述的血流动力学指标为:左心室舒张末压(LVEDP)、左室最大压力(LVPmax)、左室最低压力(LVPmin),左室压力最大变化速率(dp/dtmax)等血流动力学指标。
[0013]上述步骤2)中，分别在注射前、注射10分钟，注射30分钟采用静脉心肌声学造影测定α (微血管容积)、β (充填速率)和MBF (微循环血流量)，同时记录心电图变化及血流动力学指标。
[0014]所述的生理盐水-神经肽Y注射剂注射方法，采用Maverick整体交换球囊(overthe wire)对前降支行经皮冠状动脉内成形术送入微导管，再连接微量注射泵。
[0015]2模型评价方法
I)血流动力学监测:左侧微导管连接压力换能器，记录血压、心率。连续测定左心室舒张末压(LVEDP)、左室最大压力(LVPmax)、左室压力最大变化速率(dp/dtmax)等血流动力学指标，分别在注射前、注射10分钟、30分钟时记录血压、心率、LVEDP, LVPmax, dp/dtmax。
[0016]2)静脉心肌声学造影(MCE):在猪的上肢静脉内注射声学造影剂，选取神经肽Y作用的冠脉相对应的供血的室壁为ROI (感兴趣区)。整个过程中，仪器操作和神经肽Y注射保持一致，分别在注射前、注射10分钟、30分钟，采用MCE测定α、β和MBF，观察相应节段感兴趣区室壁的血流量变化。
[0017]手术完成后，对实验图像脱机分析，计算出ROI (感兴趣区)心肌造影剂的再灌注曲线:Y=a (l-e-et)，其中a为平台期强度，表示局部所有毛细血管横截面积之和，反映的是心肌局部微血管容积；β为曲线上升斜率，反映心肌局部血流速度，两者乘积即代表心肌微循环血流量(MBF)。
[0018]3)统计学处理:对所有数据由SPSS统计软件包进行统计处理。各组样本含量〈50，采用Shapiro-Wilk法进行正态性检验，数据符合正态性，各组参数以x±s表示。组内的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)分析不同剂量和时间下各观察值的变化，如果组内方差分析有意义，则进一步采用LSD法进行组间比较，采用10min、30min与注射前指标的差值对各组间同一观察值进行比较，检验方法采用单因素方差分析。
[0019]本发明提供的一种冠状动脉微血管痉挛猪模型的建立方法，其有益效果是:
I)本发明的模型建立方法，符合临床心理应激特点，操作简单、科学合理、建模时间短、创伤性小、动物死亡率低。
[0020]2)冠脉注射神经肽Y，可明显降低微血管容积和微循环血流量，冠状动脉微血管痉挛发生率高，神经肽Y对微循环血流减少的影响具有时效关系和量效关系，形成的时间快，1min内即可出现病发症状，30min后症状减弱，符合血管痉挛患者临床发病特点。
[0021]3)通过本发明方法建立的动物模型，特异性好，更好地拟合了临床发病实际，能够实现在载体上评价冠脉微血管的功能，定性定量评价微血管痉挛的状态和程度，并且能够实时观测，为基础临床研究提供了新的研究手段，适合推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1:冠状动脉造影显示前降支。
[0023]图2:微导管定位在前降支中段图3:神经肽注射前基础心肌声学造影
图4:神经肽注射后10分钟心肌声学造影
图中:图1猪尾导管在左心室，图2微导管尖端MARK在前降支中段。
【具体实施方式】
[0024]下面结合附图和实施例对本发明方法进行具体说明。
[0025]材料与方法
1、动物:小型猪16头，月龄6月，体重28-37Kg，由中国农业科学院畜牧兽医研究所提供，动物合格证:中国医学科学院阜外心血管病医院SYXK (京)2008-0016。
[0026]2、药品试剂与器材:声诺维声学造影剂(六氟化硫微泡,Sulphur HexafluorideMicrobubbles for Inject1n, BraccoImagingB.V公司生产，上海博莱科信谊药业有限责任公司分包装)，用自带溶剂，稀释5ml。
[0027]神经妝Y (Sigma 公司，美国，Product number N3266, Lot:037K4788)。
[0028]心脏超声诊断仪，Philips 7500，S3探头(美国，菲利普公司)；声学造影分析软件(QLAB6.0分析软件，菲利普公司)；美国b1pic MP 150生理信号记录系统，血流动力学分析软件(cqknowledge 3.8.1版本)；血管数字减影仪(DSA，OEC 9800，美国GE公司)；。
[0029]3、实施方式
每组选取4头进行实验，为了消除手术操作熟练程度导致的误差，三个模型组同步进行。
[0030]实施例1:1nmo I 组
选取上述小型猪4头，月龄6月，体重28-37Kg，含Inmol神经肽Y的生理盐水-神经肽Y注射剂1ml,具体步骤如下I)动物处理
猪禁食8h，试验前前胸部及两侧股动脉处脱毛备皮，测量体重，肌肉注射氯胺酮10 mg/kg诱导麻醉，气管插管，呼吸机辅助呼吸，连接心电图；在猪耳后大静脉处建立静脉通路，缓慢静脉推注3%戍巴比妥钠5 ml,以3 L/min流量给氧。术中保持麻醉状态,每隔Ih追加戊巴比妥钠2ml或视肢体运动情况给药。
[0031]2)冠脉内注射生理盐水与神经肽Y:
常规消毒铺巾，猪双侧腹股沟部位，用1%利多卡因局部麻醉，钝性分离暴露双侧股动脉。穿线结扎该股动脉远端，将穿刺针刺入股动脉，迅速送入导丝，沿导丝送入动脉鞘管，随即弹丸式静脉注入肝素8000U，手术过程中每隔Ih追加2000U ;沿左侧股动脉动脉鞘管，送入猪尾导管至左心室，测定左心室舒张末压(LVEDP)、左室最大压力(LVPmax)、左室最低压力(LVPmin),左室压力最大变化速率(dp/dtmax)等血流动力学指标；经右侧股动脉鞘管，对冠状动脉造影显示前降支中段，采用Maverick整体交换球囊(over the wire)对前降支行经皮冠状动脉内成形术送入微导管，再连接微量注射泵，3 min内匀速注射含Inmol神经肽Y的生理盐水-神经肽Y注射剂10ml，分别在注射前、注射10分钟，注射30分钟采用静脉心肌声学造影测定α (微血管容积)、β (充填速率)和MBF(微循环血流量)，同时记录心电图变化及血流动力学指标。
[0032]实施例2:3nmol 组
选取上述小型猪4头，月龄6月，体重28-37Kg，含3nmol神经肽Y的生理盐水-神经肽Y注射剂10ml，步骤同实施例1。
[0033]实施例3:6nmol 组
选取上述小型猪4头，月龄6月，体重28-37Kg，含6nmol神经肽Y的生理盐水-神经肽Y注射剂10ml，步骤同实施例1。
[0034]对比例:生理盐水组
选取上述小型猪4头，月龄6月，体重28-37Kg，生理盐水注射剂1ml，步骤同实施例1。
[0035]2本发明模型评价方法及结果分析评价方法
I)血流动力学监测
左侧猪尾导管连接压力换能器，记录血压、心率。采用美国b1pic MP 150生理信号记录系统，cqknowledge 3.8.1版本分析软件,连续测定左心室舒张末压(LVEDP)、左室最大压力(LVPmax)、左室压力最大变化速率(dp/dtmax)等血流动力学指标,分别在注射前、注射10分钟、30分钟时记录血压、心率、LVEDP> LVPmax、dp/dtmax。
[0036]2)静脉心肌声学造影(MCE):
采用Philips 7500心脏超声诊断仪，探头频率为S3，采用实时灌注成像软件进行实时心肌声学造影(MCE)。在猪的上肢静脉内注射声诺维声学造影剂，每次注射2ml，先以弹丸式(Bolus)快速推注1ml，再慢速推注lml/min。选取神经肽Y作用的冠脉相对应的供血的室壁为ROI (感兴趣区)。整个过程中，仪器操作和神经肽Y注射保持一致，仪器设置保持不变，分别在注射前、注射10分钟、30分钟，采用MCE测定α、β和MBF，观察相应节段感兴趣区室壁的血流量变化。所有实验图像存储在MO磁光盘与S-VHS高清晰度录像带中，采用菲利普公司的QLAB6.0分析软件以供脱机分析，该软件可计算出ROI (感兴趣区)心肌造影剂的再灌注曲线:Y=a (l-e-0t),其中α表示平台期强度，表示局部所有毛细血管横截面积之和，反映的是心肌局部微血管容积，β为曲线上升斜率，反映心肌局部血流速度，两者乘积即代表心肌微循环血流量(MBF)。
[0037]3)统计学处理
由SPSS统计软件包对所有数据进行统计处理。各组样本含量〈50，采用Shapiro-Wilk法进行正态性检验，数据符合正态性，各组参数以x±s表示。组内比较采用单因素方差分析(One-Way AN0VA),分析不同剂量和时间下各观察值的变化,方差分析有意义进一步采用LSD法进行组间比较。采用10min、30min与注射前指标的差值对各组间同一观察值进行比较，检验方法采用单因素方差分析。
[0038]结果分析 I)心电图
完成实验的动物心电图无明显变化。
[0039]2)血流动力学指标
图1显示微导管定位于左心室，冠脉造影显示前降支的情况。图2中将微导管定位于前降支中段，在前降支注入生理盐水-神经肽Y注射剂后，分别于注射前、注射10分钟，注射30分钟即刻计算血流动力学指标,如表I所示。
[0040]表I冠脉注射神经肽Y前后血流动力学变化(X 土s)
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与注射前比较:aP <0.05
由表I可见，实施例和对比例在注射10分钟，收缩压、舒张压、心率均有升高，30分钟后有所恢复。实施例3nmol、6nmol组的收缩压与对比例比较在1min有显著性差异(P
<0.05),6nmol组在注射30min后仍有差异。LVEDP、LVPmax没有明显变化(P > 0.05)，3nmol、6nmol组10分钟左室压力最大变化速率(dp/dtmax)下降(P < 0.05), 30分钟后恢复正常，说明神经肽对心室收缩压力有轻度短暂影响。神经肽Y对猪的收缩压、舒张压和心率的影响较明显，而对LVEDP和LVPmax几乎没有影响,可使dp/dtmax有轻度短暂的下降，以上分析表明，通过本发明方法建立的模型，可有效模拟发病时的血流动力学指标，符合血管痉挛患者临床发病特点。其中，以实施例3神经肽Y注射量6nmol组效果最佳。
[0041]3)声学造影
图3和图4分别显示了注射前的基础心肌声学造影和注射后1min的心肌声学造影。在注射前、注射10分钟，注射30分钟，MCE方法测定α (代表微血管容积)、β (代表充填速率)和MBF (反映微循环血流量),如表2所示。
[0042]表2冠脉注射神经肽Y前后声学造影(置± s)
【权利要求】
1.一种冠状动脉微血管痉挛猪模型的建立方法，其特征在于，实验猪双侧股动脉游离后，穿线结扎该股动脉远端，左侧鞘管送入猪尾导管，测定血流动力学指标；右侧动脉鞘管中，对冠状动脉造影显示前降支中段，冠脉内注射神经肽Y，得冠状动脉微血管痉挛猪模型。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤包括:猪双侧腹股沟部位，局部麻醉，钝性分离暴露双侧股动脉，穿线结扎该股动脉远端，将穿刺针刺入股动脉，迅速送入导丝，沿导丝送入动脉鞘管，随即弹丸式静脉注入肝素8000U，手术过程中每隔Ih追加2000U ；沿左侧股动脉动脉鞘管，送入猪尾导管至左心室；经右侧动脉鞘管将微导管定位在前降支中段，对冠状动脉造影显示前降支中段，3min内匀速注射含I?6nmol神经肽Y的生理盐水-神经肽Y注射剂10ml。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的生理盐水-神经肽Y注射剂，神经肽Y剂量优选6nmol。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用1%利多卡因局部麻醉。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，上述步骤中，分别在注射前、注射10分钟、注射30分钟采用静脉心肌声学造影测定微血管容积、充填速率和微循环血流量，同时记录心电图变化及血流动力学指标。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的生理盐水-神经肽Y注射剂注射方法，采用Maverick整体交换球囊对前降支行经皮冠状动脉内成形术送入PTCA导丝，再连接微量注射泵。
7.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述的血流动力学指标为左心室舒张末压、左室最大压力、左室最低压力和左室压力最大变化速率。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，模型评价方法为血流动力学监测和静脉心肌声学造影，数据分析采用SPSS统计软件包进行统计处理。
【文档编号】A61K38/17GK104127860SQ201410359606
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月28日 优先权日:2014年7月28日
【发明者】李晓, 姜萍, 林海青 申请人:山东中医药大学附属医院