microRNA-101抑制剂在制备预防或治疗骨关节炎药物中的应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种microRNA-101抑制剂在制备预防或治疗骨关节炎药物中的应用，属于生物医学领域。在骨关节炎动物模型中，给予膝关节腔注射microRNA-101的模拟物能引起关节软骨损伤加重，引起软骨特异性的外基质基因II型胶原和蛋白聚糖的表达水平下降。而给予膝关节腔注射microRNA-101的抑制剂，则能显著改善其软骨损伤，延缓骨关节炎动物模型的软骨损伤过程，起到软骨保护的作用。所以，通过抑制microRNA-101的表达，即通过microRNA-101的抑制剂能够减缓软骨组织的降解，起到稳定软骨细胞表型的作用，从而控制关节软骨破坏并促进软骨修复。这表明microRNA-101的抑制剂可用于制备控制骨关节破坏并促进软骨修复的药物。
【专利说明】microRNA-101抑制剂在制备预防或治疗骨关节炎药物中 的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种microRNA-101抑制剂在制备预防或治 疗骨关节炎的药物中的应用。
【背景技术】
[0002] microRNA (简称miRNA)是一类内源性非编码单链RNA，长度为21-25个核苷酸，在 进化上具有高度保守性、时序性和组织特异性，几乎存在于所有多细胞生物体中。到目前为 止，专门收录miRNA序列的数据库miRBase涵盖了包括植物、动物和病毒在内的超过8000 种miRNA，其中，有超过800个人类miRNA存在于miRBase数据库中。据推测miRNA调节着 人类三分之一的基因，参与机体诸多生理病理过程。miRNA主要作用于靶基因的3'非翻译 区直接引起靶基因 mRNA的降解或者抑制靶基因 mRNA的翻译。
[0003] miRNA能够参与调节细胞功能，在人类疾病的调控过程中具有重要的作用。目前初 步研究了与骨关节炎软骨损伤相关的miRNA。Miyaki报道，白细胞介素（以下简称IL-1 β ) 刺激后的人软骨细胞中，miRNA-140的表达下降，过表达miRNA-140可以抑制由IL-Ιβ引 起的软骨细胞外基质降解酶表达的上调，使由IL-Ιβ引起的软骨细胞外基质基因蛋白聚 糖表达的下降（参见 Miyaki S 等，MicroRNA_140is expressed in differentiated human articular chondrocytes and modulates interleukin-lresponses. Arthritis and rheumatism2009, 60(9) :2723-2730)。在 IL-1 β 刺激后的软骨细胞中，miRNA-34a得到高表 达，抑制miRNA-34a的表达后能够抵消IL-1 β引起的C〇12al蛋白和诱导型一氧化氮合酶 Nos2(iN0S)表达的下降，通过抑制miRNA_34a可以预防软骨破坏（参见Abouheif MM等， Silencing microRNA_34a inhibits chondrocyte apoptosis in a rat osteoarthritis model in vitro. Rheumatology (Oxford) 2010, 49 (11) :2054-2060)。与之相反，IL-Ιβ 抑制 软骨细胞中miRNA-27b的表达引起microRNA-27b的直接靶基因 MMP13 (软骨细胞外基质降 解的另一种酶）表达的增加，导致软骨细胞外基质降解（参见Akhtar N等，Micr〇RNA-27b regulates the expression of matrix metalloproteinasel3in human osteoarthritis chondrocytes.Arthritis and rheumatism2010,62(5):1361-1371)。还有研究表明， miRNA-675可以促进引起软骨特异性的外基质基因 II型胶原的表达（Dudek KA等，Type II collagen expression is regulated by tissue-specific miR_675in human articular chondrocytes. J Biol Chem2010, 285(32):24381-24387)〇
[0004] 可见，在骨关节炎软骨损伤治疗方面，寻求一种新的用于治疗骨关节炎软骨损伤 的miRNA具有重要的意义。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种microRNA-ΙΟ?的抑制剂在 制备预防或治疗骨关节炎的药物中的应用。所述技术方案如下：
[0006] 第一方面，本发明实施例提供了一种microRNA-101的抑制剂在制备预防或治疗 骨关节炎的药物中的应用。
[0007] 具体地，所述 microRNA-101 的核苷酸序列为 5' -UACAGUACUGUGAUAACUGAA-3'。
[0008] 具体地，作为优选，所述microRNA-101进一步被修饰，修饰后的microRNA-101保 持所述microRNA-101的活性。
[0009] 具体地，所述修饰选自核糖修饰、碱基修饰、磷酸骨架修饰中的至少一种。
[0010] 具体地，作为优选，所述microRNA-101中的核苷酸进一步被部分替换或增减，核 苷酸进一步被部分替换或增减后的microRNA-101保持所述microRNA-101的活性。
[0011] 第二方面，本发明实施例提供了一种用于预防或治疗骨关节炎的药物组合物，所 述药物组合物包括有效量的microRNA-101的抑制剂。
[0012] 具体地，作为优选，所述药物组合物还包括与所述microRNA-101的抑制剂配伍的 其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。
[0013] 具体地，作为优选，所述药物组合物的剂型选自溶液剂、悬液剂、乳剂、控制释放剂 或持续释放制剂。
[0014] 具体地，作为优选，所述药物组合物的给药方式选自注射给药或经口给药。
[0015] 本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：
[0016] 本发明实施例提供了一种microRNA-101的抑制剂在制备预防或治疗骨关节 炎的药物中的应用，在碘乙酸诱导的大鼠骨关节炎动物模型中，给予大鼠膝关节腔注射 microRNA-101的模拟物能引起大鼠骨关节炎软骨损伤加重，引起软骨特异性的外基质基 因 II型胶原和蛋白聚糖的表达水平下降。给予大鼠膝关节腔注射microRNA-101的抑制 剂则能显著改善其软骨损伤，延缓骨关节炎动物模型的软骨损伤进程，起到软骨的保护作 用。所以通过抑制microRNA-101的表达，即通过microRNA-101的抑制剂能够减缓软骨 组织的降解，起到稳定软骨细胞表型的作用，从而控制骨关节破坏并促进软骨修复。上述 microRNA-101的抑制剂对稳定软骨细胞表型，预防软骨细胞外基质降解的作用通过调控 软骨细胞中与软骨细胞分化，表型稳定相关的关键转录因子Sox9基因得以实现。这表明 microRNA-101的抑制剂可用于制备控制骨关节破坏并促进软骨修复的药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于 本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他 的附图。
[0018] 图la是本发明实施例1提供的碘乙酸诱导的骨关节炎软骨损伤模型中， microRNA-101表达水平示意图；
[0019] 图lb是本发明实施例1提供的碘乙酸诱导的骨关节炎软骨损伤模型中，Sox9mRNA 的表达水平示意图；
[0020] 图lc是本发明实施例1提供的碘乙酸诱导的骨关节炎软骨损伤模型中，Sox9蛋 白的表达水平不意图；
[0021] 图2a是本发明实施例1提供的各动物模型组的大鼠膝关节软骨冷冻切片的共聚 焦显微镜观察结果示意图；
[0022] 图2b是本发明实施例1提供的各动物模型组的miR-101a的表达水平示意图；
[0023] 图2c是本发明实施例1提供的各动物模型组的Sox9mRNA表达水平示意图；
[0024] 图2d是本发明实施例1提供的各动物模型组的Sox9蛋白的表达水平示意图；
[0025] 图3a是本发明实施例1提供的各动物模型组的软骨组织的观察结果示意图；
[0026] 图3b是本发明实施例1提供的各动物模型组7天后的组织学评分结果示意图；
[0027] 图3c是本发明实施例1提供的各动物模型组14天后的组织学评分结果示意图；
[0028] 图4是本发明实施例1提供的各动物模型组的软骨组织的HE染色结果示意图（放 大倍数10倍，标尺=400微米）；
[0029] 图5是本发明实施例1提供的各动物模型组的软骨组织的蛋白聚糖染色结果示意 图（放大倍数10倍，标尺=400微米）；
[0030] 图6是本发明实施例1提供的各动物模型组的II型胶原免疫组化染色结果示意 图（放大倍数10倍，标尺=400微米）。
【具体实施方式】
[0031] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方 式作进一步地详细描述。
[0032] 骨关节炎（osteoarthritis，简称0A)又称骨关节病，退行性关节病，是由创伤、关 节畸形等多种原因引起的关节软骨退行性变。临床可产生关节疼痛、活动受限和关节畸形 甚至功能障碍。由于0A不易治愈，严重妨碍工作、影响生活质量，成为50岁以后丧失劳动 力的第二位常见原因，仅次于心脏病。对0A的临床治疗的主要是通过减轻疼痛、缓解症状、 延缓疾病为目的。举例来说，药物治疗：使用缓解疼痛症状的药物（如镇痛药、非留体抗炎 药等）、激素、软骨保护剂（如关节腔注射透明质酸钠、口服氨基葡萄糖等）。手术治疗：使 用关节镜下关节冲洗、钻孔术、微骨折术、骨软骨移植、软骨细胞或间充质干细胞移植。而对 于关节畸形严重者，需行截骨矫形术；关节破坏、功能障碍严重者需行人工关节置换术。上 述这些治疗方法只能减轻骨关节已出现的病变症状，而无法逆转或中止其病变症状。
[0033] 研究发现：0A的发生和发展包括几个重要病理改变：关节软骨退变、软骨下骨硬 化、滑膜炎症和骨赘形成。其中，关节软骨退变是骨关节炎中最初产生，目前治疗手段无 法逆转的，也是最重要的病理改变。关节软骨由软骨细胞和细胞外基质（extracellular matrix，ECM)组成。软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞类型，能够合成及分解细胞外基质。 软骨的细胞外基质主要由Π 型胶原（Collagen type II，C0L2A1)和蛋白聚糖（Aggrecan) 组成。软骨细胞和细胞外基质共同维持关节软骨的结构以及其细胞外环境的稳态。当发生 0A时，这种稳态被打破，表现为软骨细胞外基质的降解、软骨细胞的退变等。在0A过程中软 骨细胞的退变及细胞外基质降解主要分两个阶段：生物合成阶段和降解阶段。在生物合成 阶段，软骨细胞尝试去修复损伤的软骨细胞外基质。但是，由于合成细胞外基质的基因表达 水平很低，不能有效地合成足够的细胞外基质。在降解阶段，在炎性因子的作用下，软骨细 胞产生细胞外基质降解的相关酶类将消化细胞外基质，引起细胞外基质降解。同时，炎性因 子还可以引起合成细胞外基质的基因表达进一步下降，细胞外基质的合成更加不足，导致 恶性循环，引起软骨的急剧破坏。因此，软骨细胞外基质合成的不足以及软骨细胞外基质的 降解是0A软骨损伤中主要的病理变化。
[0034] 根据对0A病理过程的研究，为了减缓骨关节炎症状，并有效地逆转或中止骨关节 炎，本发明进一步研究了在0A的病理过程中起重要作用的基因、基因调节网络、表观遗传 学改变以及相关miRNA，提供了一种microRNA-101的抑制剂在制备预防或治疗骨关节炎的 药物中的应用。
[0035] 本发明研究发现，在碘乙酸诱导的骨关节炎软骨破坏的大鼠模型中，大鼠软 骨组织中microRNA-101 (即microRNA-lOla)水平显著升高。给予大鼠膝关节腔注射 microRNA-101的模拟物，能引起大鼠骨关节炎软骨损伤加重。给予大鼠膝关节腔注射 microRNA-101的抑制剂则能显著改善其软骨损伤，起到软骨的保护作用。所以通过抑制 microRNA-101的表达，即通过microRNA-101的抑制剂能够减缓软骨组织的降解，起到稳定 软骨细胞表型的作用，从而控制骨关节破坏并促进软骨修复。上述microRNA-101的抑制剂 对稳定软骨细胞表型，预防软骨细胞外基质降解的作用通过调控软骨细胞中与软骨细胞分 化，表型稳定相关的关键转录因子Sox9基因得以实现。可见，microRNA-101的抑制剂能够 用于制备预防或治疗骨关节炎的药物。
[0036] 可以理解的是，microRNA-101的抑制剂具有本领域公知含义。microRNA-101的抑 制剂的设计和制备方法也为本领域所公知。举例来说，本领域技术人员根据microRNA-101 设计其反义RNA，或者将microRNA-101与特定的物质接触，检测microRNA-101的表达，并选 择特异抑制microRNA-101表达的候选物质，以得到microRNA-101的抑制剂。可以理解的 是，microRNA-101的抑制剂可以是能够特异抑制microRNA-101对靶基因的调控作用的任 何物质，也可以是在细胞中特异抑制microRNA-101表达的物质，还可以是与microRNA-101 具有特异性相互作用的物质，例如与microRNA-101特异性结合的物质，或者特异抑制 microRNA-101与DICER相互作用的物质。具体地，microRNA-101的抑制剂可以为一种小分 子核酸，其能够有效抑制microRNA-101的表达。
[0037] 具体地，microRNA-101 的核苷酸序列为 5' -UACAGUACU⑶GAUAACUGAA-3'。
[0038] 由于microRNA-101核苷酸序列在各物种间（如小鼠、大鼠、猪等）十分保守，所 以本发明实施例中，microRNA-101选自人的microRNA-101，其在miRbase中的序列号为： MI0000103,核苷酸序列为5' -UACAGUACUGUGAUAACUGAA-3'，其具有加重骨关节炎症状的特 异性生物活性。
[0039] 本发明实施例中，microRNA-101既指含有5' -UACAGUACU⑶GAUAACUGAA-3'序列的 内生的、非编码的微小RNA，也可以指能行使microRNA-101功能的核心序列的microRNA分 子，还可以指体外合成的具有5' -UACAGUACUGUGAUAACUGAA-3'序列的微小RNA分子（也可 称之为microRNA-ΙΟ?的模拟物）。其中上述微小RNA分子的体外合成方法为本领域公知。 因此，microRNA-ΙΟ?的抑制剂可以为根据上述microRNA-ΙΟ?得到的microRNA-ΙΟ?的抑制 剂。
[0040] 具体地，作为优选，microRNA-ΙΟ?进一步被修饰，修饰后的microRNA-ΙΟ?保持该 microRNA-ΙΟ? 的活性。
[0041] 本发明实施例中，为了保持microRNA-101在体外操作时的稳定性，可以对其进行 进一步地修饰，但是，修饰后的microRNA-101保持该microRNA-101的活性。可以理解的是， microRNA-101的抑制剂可以为根据上述的、修饰后的microRNA-101得到的抑制剂。
[0042] 其中，"microRNA-101的活性"指的是microRNA-101能够引起软骨特异性的外基 质基因 II型胶原（Col2Al)和蛋白聚糖（Aggrecan)的表达水平下降、引起软骨损伤加重的 特异性生物活性。具体地，上述修饰选自核糖修饰、碱基修饰、磷酸骨架修饰中的至少一种。
[0043] 具体地，作为优选，microRNA-101中的核苷酸进一步被部分替换或增减，核苷酸进 一步被部分替换或增减后的microRNA-101保持microRNA-101的活性。
[0044] 其中，"microRNA-101的活性"同样指的是microRNA-101能够引起软骨特异性的 外基质基因 II型胶原（Col2Al)和蛋白聚糖（Aggrecan)的表达水平下降、引起软骨损伤加 重的特异性生物活性。
[0045] 第二方面，本发明实施例提供了一种用于预防或治疗骨关节炎的药物组合物，该 药物组合物包括有效量的microRNA-101的抑制剂。
[0046] 含有有效量的microRNA-101的抑制剂的药物组合物，其同样具有microRNA-101 的抑制剂的特异性作用，即稳定软骨细胞表型，预防软骨细胞外基质降解。
[0047] 其中，"有效量"是指对人或动物体产生功能或活性，且可被人或动物所接受的量。
[0048] 当microRNA-101的抑制剂为一种小分子核酸时，其能够有效抑制microRNA-101 的表达。进一步地，该microRNA-101抑制剂中的核苷酸进一步被部分替换或增减，核苷酸 进一步被部分替换或增减后的microRNA-101的抑制剂保持抑制microRNA-101表达的活 性。
[0049] 具体地，作为优选，该药物组合物还包括与microRNA-101的抑制剂配伍的其他药 类以及药学上可接受的载体和/或辅料。
[0050] 当microRNA-101的抑制剂用于预防或治疗骨关节炎时，其可以单独使用，也可以 与其他可配伍的药类以及药学上可接受的载体和/或辅料配合使用。其中，"药学上可接受 的载体和/或辅料"指的是适用于人活动物而无过度不良副反应（如毒性、刺激和变态反 应）的，即具有合理的效益/风险比的载体和/或辅料。
[0051] 具体地，该载体可以为纳米颗粒、脂质体、胆固醇、壳聚糖及病毒等。
[0052] 具体地，作为优选，该药物组合物的剂型选自溶液剂、悬液剂、干粉剂、乳剂、控制 释放剂或持续释放制剂。该药物组合物的给药方式选自注射给药（例如，静脉注射、关节腔 局部注射或肌肉注射等）或经口给药。
[0053] 以下将通过具体的实施例进一步地说明本发明。
[0054] 在以下具体实施例未注明条件者，均按照常规条件或者制造商建议的条件进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者均为可以通过市购获得的常规产品。
[0055] 其中，microRNA-101的模拟物合成自上海吉凯公司，产品编号：G⑶950817。
[0056] microRNA-101的抑制剂合成自上海吉凯公司，产品编号：G⑶950818。
[0057] 实施例1
[0058] 1)碘乙酸诱导骨关节炎动物模型建立
[0059] 将SD大鼠仰卧位固定在助手手中，术者左手触摸大鼠的关节间隙，髌韧带。然后 用26号针头穿过大鼠的髌韧带，感觉到有一种破空感，证明针头进入关节腔，用微量进样 器注射碘乙酸（2mg的碘乙酸溶解至50μ1 PBS(磷酸盐缓冲溶液）中）。正常饮食，让大鼠 在笼中自由活动。
[0060] 2)动物分组
[0061] 将32只（共64膝）体质量150g的SD大鼠平均分为4组，分别包括：第一组（只 注射碘乙酸不进行miRNA干预）；第二组（注射碘乙酸，并利用对照miRNA进行干预；第三 组（注射碘乙酸，进行microRNA-101的模拟物干预，即过表达microRNA-101组）；第四组 (注射碘乙酸，进行microRNA-101的抑制剂干预，即抑制microRNA-101表达组）。同一只 大鼠的两个膝关节分别造成不同的处理组。
[0062] 3)实验动物进行miRNA干预治疗
[0063] 在注射碘乙酸3天后，对SD大鼠开始进行miRNA干预，每3天一次，直至实验中止。
[0064] 4)动物处死、取材
[0065] 分别在注射碘乙酸后的第7天及第14天，过量麻醉法处死SD大鼠，取其膝关节， 经修整后放入固定液中。
[0066] 5)组织学评价
[0067] SD大鼠处死后，股骨（每个组中有8个样品）的前端部被切断，然后在4%多聚甲 醛（PH7. 4)中固定48小时，4°C下然后将样品在快速脱钙液中脱钙2天。脱钙标本进行修 整，梯度乙醇脱水，包埋在石蜡中。切成5 μ m厚矢状切片并进行苏木精-伊红染色（简称HE 染色）和甲苯胺蓝染色，II型胶原抗体进行免疫组化分析。组织学评分采用改良的mankin 评分方法° (参见 Mankin, H. J.，Dorfman，H.，Lippiello, L. &Zarins，A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. The Journal of bone and joint surgery. American volume53, 523-537 (1971).)
[0068] 6)免疫荧光法分析大鼠膝关节软骨中microRNA-lOl的表达
[0069] 大鼠的膝关节软骨（第1天注射后）在PBS中漂洗，并包埋在0CT化合物。利用 冰冻切片机切成8微米厚的冷冻切片于载玻片上。然后，将切片用H 〇echst33342染液染色 5分钟。PBS洗涤3次，将载玻片于共聚焦显微镜下观察。
[0070] 7) RNA 抽提以及 Real-time PCR 分析
[0071] 用TRIzol试剂在抽提MIA大鼠膝关节软骨中提取总RNA。分离的RNA进行反转 录，和实时使用ABI步骤一加 QPCR系统进行PCR分析仪（ABI，福斯特城，加利福尼亚州，美 国）用SYBR选择主混合物（ABI)。Real-time PCR的条件如下：50°C 2分钟，95°C下进行2 分钟，随后95°C 15秒，进行40个循环的，60°C 30秒。添加溶解曲线以确定没有非特异性扩 增。Real-time PCR的引物如下：
[0072] Sox9 (FW)，5' - AGGAAGCTGGCAGACCAGTA-3' 和（RV)， 5'-ACGAAGGGTCTCTTCTCGCT-3' ；
[0073] 1 8 S RNA FW，5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT_3'，和 RV， 5'-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3' 。
[0074] 对于microRNA-101的逆转录、表达分析，采用Bulge-loop?miRNA试剂盒根据说明 书进行操作（购于广州锐博生物）。使用2- Λ Λ CT方法测定Sox9和miR-101的表达。
[0075] 8)蛋白质分离和免疫印迹
[0076] 用裂解缓冲液提取蛋白质（50mM的Tris-盐酸，pH为7.4，150mM氯化钠，1%ΝΡ-40 和0. 1 %十二烷基硫酸钠），浓度测定使用BCA蛋白测定试剂盒（Pierce公司），使用牛血清 白蛋白作为标准品。蛋白质在SDS-PAGE凝胶（10% )中1. 5小时，然后在4°C下电转移至硝 酸纤维素膜2小时。一抗（II型胶原）1 :4000稀释后4°C过夜；辣根过氧化物酶标记的二 抗1 :1000稀释室温下孵育1小时。通过化学发光法检测蛋白表达水平。β-actin(Sigma 公司，1:10000稀释）用作内参。
[0077] 统计分析
[0078] 组间差异的显着性用方差分析（AN0VA)分析计算。同一组的结果采用Student-t 检验进行评价。P值小于0.05被认为具有显著统计学差异。所有数据以均数土标准差表 /_J、1 〇
[0079] 研究结果
[0080] microRNA-101和Sox9基因在第一组大鼠膝关节软骨中的表达
[0081] 为了检查microRNA-101是否参与第一组大鼠软骨退化的进程，大鼠膝关节软骨 在注射碘醋酸一天后取材作进一步分析。如图la所示，与正常大鼠（即未经碘醋酸处理的 大鼠）相比，对第一组的Real-time PCR结果显示，microRNA-101表达水平在注射碘乙酸 后显著上升。然而，Sox9的RNA及蛋白水平显著下降（参见图lb和图lc)。可见,Sox9的 是microRNA-101的一个靶标，并在软骨细胞外基质降解过程中Sox9受microRNA-101的调 控。综上所述，microRNA-101参与MIA大鼠的软骨退化过程，其功能通过调控Sox9的表达 来实现。
[0082] microRNA-101的模拟物及microRNA-101的抑制剂表达载体对关节软骨的作用
[0083] 为了测试腺病毒介导的microRNA-101的载体是否能渗透到软骨并发挥作用，首 先，将注射microRNA-101的模拟物（第三组）及microRNA-101的抑制剂（第四组）的 大鼠膝关节软骨的冷冻切片在共聚焦显微镜下进行免疫荧光法分析并观察。对待检测 的软骨细胞的细胞核进行荧光标记（参见图2a)，在microRNA-101的模拟物的载体及 microRNA-101的抑制剂的载体中设有绿色荧光蛋白标记，则绿色荧光蛋白的表达与否可以 表明microRNA-101的模拟物及microRNA-101的抑制剂是否表达。
[0084] 共聚焦显微镜结果显示，绿色荧光蛋白可在软骨、半月板、甚至滑膜中表达（参见 图2a)。这表明microRNA-101、及其模拟物或抑制剂的载体能够渗入软骨。其次，为了检测 表达载体能否在软骨中发挥作用，大鼠膝关节软骨组织的RNA，通过Real-time PCR方法检 测注射过表达载体的软骨组织中microRNA-101的表达水平，结果表明，注射microRNA-101 的模拟物的样品（第三组）及microRNA-101的抑制剂的样品（第四组）中，microRNA-101 的表达水平相对于第二组显著增加（参见图2b)。而注射microRNA-101的模拟物的样品 (第三组）中，Sox9的mRNA表达水平下降（参见图2c和2d);而注射microRNA-101的抑 制剂的样品（第四组）中，Sox9的mRNA的表达水平得到明显提高（参见图2c和2d)。可 见，腺病毒介导的microRNA-101的模拟物和microRNA-101的抑制剂能渗透到软骨，并能发 挥作用，调节其祀点Sox9的表达。
[0085] 各组膝关节滑车软骨观察
[0086] 大鼠关节腔注射后及治疗过程中无一例死亡，无一例感染，上述四组大鼠分别在 注射碘乙酸后7天和14天取材。观察表明，7天时，上述四组大鼠中，膝关节滑车部分软骨破 坏比较明显，有轻微的软骨下骨暴露的表现。但是四个组的软骨退变的程度差别不大（参 见图3a)。14天时，四个组中，膝关节滑车部位的软骨退变出现了不同，具体来说第一组和 第二组软骨退变情况类似，有轻微的软骨下骨暴露的现象（参见图3a);而第三组滑车面的 软骨退变比较明显，软骨下骨暴露明显（参见图3a);第四组，软骨退变很轻微，软骨退变的 程度比第一组和第二组小，软骨面比较光滑，没有出现软骨下骨暴露（参见图3a)。
[0087] 各组膝关节滑车软骨组织学评分
[0088] 各组的膝关节评分主要根据改良的mankin评分系统来评估的，主要从三大方面 来评估软骨退变程度：软骨的结构（包括软骨表面不规整、裂缝至放射层、血管翳、表层消 失、轻微组织破坏、裂隙至软骨下骨、组织破坏等）、软骨细胞的异常（包括软骨细胞增多、 肥大、簇集）、基质染色（包括表层染色减少、胞内基质染色减少、仅仅细胞外基质染色、无 染色）。分数低说明软骨退变较轻，而分数高说明软骨退变重。
[0089] 从组织评分来看，7天时，各组评分差异不明显。但是，与其他组相比，第四组评分 低，与其他组的组织学评分之间比较有统计学差异，说明第四组软骨损伤小（参见图3b)。 14天时，各组的总体的组织学评分之间差异明显，主要表现在第四组的评分与第一组和第 二组相比有统计学意义；第三组的评分与第一组和第二组相比也有统计学意义（参见图 3c)。可见，第三组的评分低，说明软骨退变少；而第四组的评分高，说明软骨退变多，说明 microRNA-101的模拟物加重骨关炎，microRNA-101的抑制剂改善骨关炎。
[0090] 各组动物膝关节滑车软骨组织HE染色结果
[0091] 如附图4所示，从HE染色来看，具体的动物模型软骨退变包括：软骨表面的凹凸 不平和裂隙，软骨钙化层变薄，潮线不清晰。7天时，各组的总体的HE染色之间比较没有明 显差异。14天时，各组软骨的厚度与7天相比均变薄，但是，第四组变薄的程度比较轻。第 一组、第二组和第三组的关节软骨与软骨下骨的连接不甚紧密，同时软骨面有裂隙深达软 骨下骨，而第四组没有软骨面光滑，没有裂隙。可见，关节腔注射microRNA-101的模拟物后 软骨损伤加重，结构紊乱，软骨层变薄；而注射microRNA-101的抑制剂后，软骨结构较为正 堂 巾。
[0092] 各组动物膝关节滑车软骨细胞外基质的甲苯胺蓝染色和II型胶原免疫组化染色 结果
[0093] II型胶原和蛋白聚糖是软骨组织细胞外基质的主要组成成分，也是软骨的特异性 标志物。在软骨组织退变时软骨组织细胞外基质逐渐降解，II型胶原和蛋白聚糖的量逐渐 减少；甲苯胺蓝染色可以反映软骨细胞外的蛋白聚糖含量，而II型胶原免疫组化染色主要 反映 II型胶原量的变化。因此，II型胶原和蛋白聚糖也是软骨退变的主要检测指标。
[0094] 如附图5及附图6所示，甲苯胺蓝染色和II型胶原免疫组化染色结果显示，各组 在蛋白聚糖和II型胶原的表达量上面没有明显差异。
[0095] 14天时，各组在甲苯胺蓝染色和II型胶原免疫组化染色结果方面出现差异，具体 表现在：第四组的甲苯胺蓝染色和II型胶原免疫组化染色与其他三组相比，染色深，说明 第四组的软骨组织细胞外基质退变的少（参见图5及图6)。同时，其他三组在甲苯胺蓝染 色和II型胶原免疫组化染色方面相比，没有明显差异。
[0096] 综上所述，关节腔注射microRNA-101的模拟物后，软骨细胞外基质：蛋白聚糖染 色变淡，说明软骨细胞外基质降解；注射microRNA-101的抑制剂后，软骨组织甲苯胺蓝染 色相比其他组染色深，说明注射microRNA-101的抑制剂能够预防软骨细胞外基质降解。 [0097] 关节腔注射microRNA-101的模拟物后，软骨的另外一种细胞外基质：11型胶原的 染色变淡，说明软骨细胞外基质降解；注射microRNA-101的抑制剂后，软骨组织II型胶原 免疫组化染色相比其他组染色深，说明注射microRNA-101的抑制剂能够预防软骨细胞外 基质降解。
[0098] 实施例2
[0099] 制备microRNA-101的抑制剂药物：
[0100] l)microRNA_101的抑制剂的设计：根据microRNA-101的序列，根据互补 原则设计microRNA-101的反义寡核苷酸，microRNA-101的反义寡核苷酸序列为： 5' ATGTCATGACACTATTGACTT3'。
[0101] 2)利用锁核酸技术修饰microRNA-101抑制剂：将microRNA-101的反义寡核苷 酸序列中 5' ATGTCATGACACTATTGACTT3'，自 5'端起第 1-21 位中的 1、2、3、4、5、6、7 或更 多个核苷酸被锁核苷酸（LNA)修饰。该锁核苷酸选自β-D-氧-锁核苷酸，（还可以用 β -D-硫-锁核苷酸、β -D-氨基-锁核苷酸和/或a -L-氧-锁核苷酸进行替代）。该锁核 苷酸根据如下方法（参见国际专利：W099/14226，W000/56746，W000/56748，W000/66604 等） 来制备。从而制备得到修饰后的microRNA-101的抑制剂药物。该制备得到的microRNA-101 的抑制剂药物的稳定性提高，能够特异地结合抑制细胞内源成熟的microRNA分子
[0102] IL-Ιβ和TNF-α作用于人软骨组织后能够引起软骨细胞退变，细胞外基质降 解，造成软骨损伤。将有效量的所制备的microRNA-ΙΟ?的抑制剂药物加入人软骨细胞的 培养液中，再进行IL-1 β和TNF- a的刺激后，发现microRNA-101的抑制剂药物能够逆转 IL-Ιβ和TNF-a引起的人软骨细胞退变，细胞外基质降解，起到保护软骨细胞，使其免受 炎性因子引起的软骨损伤。可见，本发明实施例提供的microRNA-ΙΟ?的抑制剂药物具有保 护关节软骨细胞，利于软骨修复的作用。
[0103] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0001] 序列表 <110>北京大学第三医院 <120> microRNA-101的抑制剂在制备预防或治疗骨关节炎药物中的应用 <130> 14SG1F0691 <160> 1 <170> Palcntln version 3.4 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 uacaguacug ugauaacuga a 21
【权利要求】
1. microRNA-101的抑制剂在制备预防或治疗骨关节炎药物中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述microRNA-101的核苷酸序列为 5'-UACAGUACU⑶GAUAACUGAA-3' 。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述microRNA-101进一步被修饰，修饰后 的 microRNA-101 保持所述 microRNA-101 的活性。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述修饰选自核糖修饰、碱基修饰、磷酸 骨架修饰中的至少一种。
5. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述microRNA-101中的核苷酸进一 步被部分替换或增减，核苷酸进一步被部分替换或增减后的microRNA-101保持所述 microRNA-101 的活性。
6. -种用于预防或治疗骨关节炎的药物组合物，所述药物组合物包括有效量的 microRNA-101 的抑制剂。
7. 根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括与所述 microRNA-101的抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。
8. 根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型选自溶液 齐?、悬液剂、干粉剂、乳剂、控制释放剂或持续释放制剂。
9. 根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的给药方式选自 注射给药或经口给药。
【文档编号】A61P19/02GK104083761SQ201410290697
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年6月25日 优先权日:2014年6月25日
【发明者】敖英芳, 代岭辉, 周春燕, 张辛, 胡晓青 申请人:北京大学第三医院