一种白喉疫苗的制备方法
【专利摘要】本发明提出了一种白喉疫苗的制备方法，解决了现有技术中白喉疫苗生产周期过长，生产过程中产生硫酸铵污染，终产品杂蛋白过多，产品副反应过大的问题，一种白喉疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)白喉杆菌菌种复苏、发酵培养，制备白喉菌液；2)将所述白喉菌液离心，三次过滤处理，然后进行超滤浓缩、透析洗换，从而得到白喉毒素；3)对所述白喉毒素脱毒，然后用切向流超滤系统进行超滤浓缩、透析洗换；4)对脱毒的白喉毒素进行纯化。高速离心去除菌体，超滤浓缩、洗换替代活性炭吸附和硫酸铵盐析，且整个实验步骤只需短短一天，简化了工艺步骤，缩短了生产周期，提高了生产效率，增加操作步骤的可控性。
【专利说明】一种白喉疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及疫苗领域，特别是指一种白喉疫苗的制备方法。
【背景技术】
[0002]白喉疫苗由白喉杆菌菌种制成，白喉杆菌菌体分泌出来的毒素是单一的多肽链，不含糖基和辅基，蛋白质由560个氨基酸组成，分子量为62kDa，是一种酶原，只有在蛋白酶的作用下，将其切成缺口毒素，才具有生物活性。白喉类毒素包括A、B两个片段，其中B片段是手提结合和穿膜片段，A片段是毒性片段，通过阻抑蛋白合成中的酶活性，最终引起细胞死亡，它对远端组织和器官也可产生毒性，尤其是心脏及外周和中枢神经系统。
[0003]我国目前的白喉疫苗简要生产过程为:菌种复苏传代，扩增至一定量，上发酵罐发酵培养，所采用的产毒培养基为Pope及Ling-good培养基,Pope及Ling-good培养基均是以蛋白酶(胰酶)消化牛肉液，加入生长因子制成。该培养基营养丰富，用于白喉杆菌培养都能达到较高的产毒水平。但缺点是胰酶消化牛肉蛋白的工艺复杂难以控制，且不适于大批量的生产，消化的牛肉蛋白各批之间差异较大，质量难于控制，不利于后处理工艺的优化。然后将发酵罐的培养物经甲苯处理过后，收集于一个大容器，加入活性炭、硫酸铵进行脱色，过滤收集上清液，此实验过程需I到2天，添加硫酸铵二次盐析3~4天，透析去除铵离子又耗费3~7天，然后用甲醛脱毒30~42天，透析去除甲醛3~7天，传统工艺用硫酸铵盐析沉淀蛋白的实验步骤较多，操作繁琐，后处理难度较大，且生产过程中会产生大量的硫酸铵废液，活性炭在后处理过程中有一定的残留。经硫酸铵沉淀获得的白喉毒素含有较多杂蛋白，纯度较差， 导致终产品的副作用较大，最主要的是生产一批白喉疫苗周期过长。
【发明内容】
[0004]本发明提出一种白喉疫苗的制备方法，解决了现有技术中白喉疫苗生产周期过长，生产过程中产生硫酸铵污染，终产品杂蛋白过多，产品副反应过大的问题。
[0005]本发明的技术方案是这样实现的:一种白喉疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0006]I)白喉杆菌菌种复苏、发酵培养，制备白喉菌液；
[0007]2)将所述白喉菌液离心，三次过滤处理，然后进行超滤浓缩、透析洗换，从而得到
白喉毒素；
[0008]3)对所述白喉毒素脱毒，然后用切向流超滤系统进行超滤浓缩、透析洗换；
[0009]4)对脱毒的白喉毒素进行纯化。
[0010]作为优选的技术方案，所述步骤2)的具体方法:将离心除菌后的白喉菌液经0.22 μ m — 0.1 μ m滤膜过滤，然后经300KD中空纤维柱过滤，再用10KD的中空纤维柱进行超滤浓缩，当超滤剩余体积为原体积的1/5时，进行透析洗换，洗换液为0.9% NaCl溶液，洗换3~5个体积。
[0011]作为优选的技术方案，所述步骤3)中脱毒是在保持pH值为7.4~7.6，添加80~150mM赖氨酸，0.4~0.6%甲醛，置35~37°C下进行，且脱毒时间为25~45天，透析洗换是用0.9% NaCl溶液洗滤3~5个体积。
[0012]作为优选的技术方案，所述步骤3)中切向流超滤系统是使用截留分子量为1KD的Quixstand中空纤维柱进行超滤。
[0013]作为优选的技术方案，所述步骤4)中纯化方法为分子筛层析法，其中分子筛填料为 S^hacryl S-300HR。
[0014]作为优选的技术方案，所述步骤I)中发酵培养采用合成培养基，所述合成培养基包括:20g/L酸水解酪蛋白、5g/L蛋白胨、2.5g/L麦芽糖、2.5ml/L乳酸，lml/L Mueller氏I号液、2ml/L Mueller氏II号液、浓度低于0.10mg/ml的铁离子。
[0015]高速离心去除菌体，超滤浓缩、洗换替代活性炭吸附和硫酸铵盐析，且整个实验步骤只需短短一天，缩短了生产周期，提高生产效率，增加操作步骤的可控性，且制品中无外源物质引入安全性增加；采用中空纤维柱方法去除脱毒剂甲醛，时间仅为I天，缩短工艺操作时间，在封闭条件下操作，减少产品在空气中暴露的时间，减少污染风险，增加了操作的安全性，纯化脱毒的白喉毒素采用分子筛层析法，其中分子筛填料为Sephacryl S-300HR,由于Sephacryl S-300HR采用了亲水的、刚性的烯丙基葡聚糖/双丙烯酰胺交联填料,具有最大回收率、最小非特异吸附，且有长期的化学和物理稳定性。经纯化后的白喉毒素纯度更高，杂蛋白含量更低，安全性更好。且合成培养基替代传统的牛肉消化液培养基，使培养基成分简单易控，不含有影响制品质量和安全性的物质；质量可控的培养基也使发酵产品的质量可控性更高。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0017]图1为本发明一种白喉疫苗的制备方法的工艺流程图；
[0018]图2为白喉杆菌的生长曲线图；
[0019]图3为白喉杆菌的产毒曲线图；
[0020]图4为纯化白喉毒素紫外监测图谱。
【具体实施方式】
[0021]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0022]如图1所示，一种白喉疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0023]I)白喉杆菌菌种复苏、发酵培养，制备白喉菌液；
[0024]2)将所述白喉菌液离心，三次过滤处理，然后进行超滤浓缩、透析洗换，从而得到
白喉毒素；[0025]3)对所述白喉毒素脱毒，然后用切向流超滤系统进行超滤浓缩、透析洗换；
[0026]4)对脱毒的白喉毒素进行纯化。
[0027]作为优选的技术方案，所述步骤2)的具体方法:将离心除菌后的白喉菌液经0.22 μ m — 0.1 μ m滤膜过滤，然后经300KD中空纤维柱过滤，再用1KD的中空纤维柱进行超滤浓缩，当超滤剩余体积为原体积的1/5时，进行透析洗换，洗换液为0.9% NaCl溶液，洗换3~5个体积。
[0028]作为优选的技术方案，所述步骤3)中脱毒是在保持pH值为7.4~7.6，添加80~150mM赖氨酸，0.4~0.6%甲醛，置35~37°C下进行，且脱毒时间为25~45天，透析洗换是用0.9% NaCl溶液洗滤3~5个体积。
[0029]作为优选的技术方案，所述步骤3)中切向流超滤系统是使用截留分子量为1KD的Quixstand中空纤维柱进行超滤。
[0030]作为优选的技术方案，所述步骤4)中纯化方法为分子筛层析法，其中分子筛填料为 S^hacryl S-300HR。
[0031]作为优选的技术方案，所述步骤I)中发酵培养采用合成培养基，所述合成培养基包括:20g/L酸水解酪蛋白、5g/L蛋白胨、2.5g/L麦芽糖、2.5ml/L乳酸，lml/L Mueller氏I号液、2ml/L Mueller氏II号液、浓度低于0.10mg/ml的铁离子。
[0032]具体实施例 [0033]实验I)白喉杆菌发酵培养
[0034]实验材料:
[0035]菌种:白喉杆菌PW8株(CMCC38007)
[0036]培养基:采用改良的合成培养基:酸水解酪蛋白20g/L、蛋白胨5g/L、麦芽糖2.5g/L、乳酸2.5ml/L,Mueller氏I号液lml/L、II号液2ml/L ;培养液的铁离子浓度低于0.1Omg/ml ο
[0037]补液:20%麦芽糖，Mueller氏1、II号液，I %谷氨酸溶液。
[0038]主要设备:50L发酵罐(上海万木青生物工程有限公司)
[0039]实验方法:
[0040]待白喉菌种复苏，在改良液体培养基上培养，370C，培养72小时后，刮取菌膜传液体培养基上摇瓶，37°C培养48小时。按酸水解酪蛋白20g/L、蛋白胨5g/L、麦芽糖2.5g/L、乳酸2.5ml/L配制液体培养基30L，调节pH值至7.6，铁离子含量0.10mg/mL.液体培养基灭菌后，加入Mueller氏I号液lml/L、II号液2ml/L，按10%的菌种浓度接种摇瓶菌种，设置发酵条件:转速250rpm、培养温度35°C、pH7.8，通气量10L/min发酵培养。发酵培养期间，控制DO维持在10%，通入氧气量4L/min，剩余为压缩空气。24小时后，当pH低于7.8时开始补液。补液速度维持在3~5ml/min。发酵过程中，每隔4个小时取样一次，检测菌浓度、毒素絮状单位。
[0041]实验结果:如图2所示，溶解氧维持在10%左右时，白喉杆菌随着培养时间的增加，菌浓度也逐渐上升(吸光度值逐渐增加)，产毒也逐渐增加；当发酵时间为40h时，细菌生长进入了稳定期，此时白喉菌的产毒能力也达到了最大值，可以进行收获。由结果可见，采用该工艺发酵培养白喉杆菌生长良好，产毒稳定，产毒达170Lf絮状单位以上，如图3。
[0042]实验2)白喉毒素的精制[0043]实验材料及样品:
[0044]过滤系统:Durapore0.22 μ m、0.1 μ m, Millipore ；
[0045]ΒΤ300，保定兰格恒流泵有限公司
[0046]中空纤维滤柱:UFP-500-E-4X2MA，GE;UFP-10-E_H22LA，GE
[0047]切向流处理系统:Quixstand中空纤维膜分离系统，GE
[0048]样品:离心处理后的收获液，样品量10L。
[0049]实验方法:
[0050]收获的白喉菌液，首先经离心(8000~1000rpm)去除菌体，再将收获液经
0.22μπι —0.Ιμπι的滤膜过滤，然后再经300KD中空纤维过滤。通过不同孔径的过滤处理，去除不同大小的杂蛋白及代谢产物。最后采用1KD的中空纤维柱进行超滤浓缩处理，设定蠕动泵转速为320rmp，过膜压力为1psi在25°C进行超滤，当超滤剩余体积为原体积的1/5时，进行透析洗换，洗换液为0.9% NaCl溶液，洗换3-5个体积。
[0051]实验结果:处理样品的回收率在90%以上，样品的纯度达2000Lf/mg，符合现行版《中国药典》不低于1 500Lf/mg的要求。
[0052]实验3)脱毒
[0053]实验材料及样品:
[0054]中空纤维滤柱:UFP-10-E-H22LA，GE
[0055]切向流处理系统:Quixstand中空纤维膜分离系统，GE
[0056]样品:精致白喉毒素样品量1L。
[0057]实验方法:
[0058]将精制白喉毒素稀释至300Lf/ml,然后加入赖氨酸使其终浓度为80~150mM,再加入38%的甲醛使其终浓度分别为0.4~0.6%，调节pH至7.4~7.6，然后放置在35~37°C条件下脱毒30天。脱毒过程中，监测pH变化，保持pH值在7.4~7.6。脱毒结束后，用1KD中空纤维超滤浓缩,然后用0.9% NaCl溶液洗滤3~5个体积,去除残余甲醒。
[0059]实验结果:通过检测脱毒样品，得脱毒实验合格，毒性逆转实验也合格，脱毒过程样品的损失率不超过5%。
[0060]实验4)白喉毒素纯化
[0061]实验材料及样品:
[0062]层析柱:XK16X70，GE
[0063]紫外检测仪:HD-9707，上海精科
[0064]蠕动泵:BT100_2J，保定兰格恒流泵有限公司
[0065]分子筛填料:SephacrylS-300HR, GE
[0066]样品:精致脱毒后的收获液30ml
[0067]实验方法:
[0068]使用0.9% NaCl缓冲液平衡层析柱2个柱体积，采用280nm紫外检测仪进行检测，校正基线零点，取精致脱毒后的白喉类毒素溶液，以10ml/min的速度上样。上样结束后，用
0.9% NaCl缓冲液以10ml/min的速度进行洗脱，收集A280处检测得到的蛋白峰，检测收集得到蛋白峰纯度及回收率。
[0069]实验结果:使用S-300分子筛分离脱毒后的白喉类毒溶液，可以有效去除杂蛋白，得到纯度更高的白喉类毒素，紫外监测结果见图4。蛋白峰纯度在2000Lf/mg蛋白氮，回收率90%以上。
[0070]实验5)吸附白喉疫苗配制
[0071]将纯化后的白喉类毒素调整吸附pH值至5.0~6.0，然后加入氢氧化铝吸附剂按白喉毒素30Lf/0.5ml (每I人次用量0.5ml)配方进行吸附，调整氢氧化铝含量至1.0~
1.5mg,最后调整pH值至5.8~7.2。
[0072]测定配制疫苗的效价为55IU/0.5ml，符合现行《中国药典》的要求。
[0073]以上所述仅为本发明的较佳实施例而 已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种白喉疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)白喉杆菌菌种复苏、发酵培养，制备白喉菌液； 2)将所述白喉菌液离心，三次过滤处理，然后进行超滤浓缩、透析洗换，从而得到白喉毒素； 3)对所述白喉毒素脱毒，然后用切向流超滤系统进行超滤浓缩、透析洗换； 4)对脱毒的白喉毒素进行纯化。
2.如权利要求1所述的一种白喉疫苗的制备方法，其特征在于: 所述步骤2)的具体方法:将离心除菌后的白喉菌液经0.22 μ m — 0.1 μ m滤膜过滤，然后经300KD中空纤维柱过滤，再用1KD的中空纤维柱进行超滤浓缩，当超滤剩余体积为原体积的1/5时，进行透析洗换，洗换液为0.9% NaCl溶液，洗换3~5个体积。
3.如权利要求1所述的一种白喉疫苗的制备方法，其特征在于: 所述步骤3)中脱毒是在保持pH值为7.4~7.6，添加80~150mM赖氨酸，0.4~0.6 %甲醛，置35~37°C下进行，且脱毒时间为25~45天，透析洗换是用0.9% NaCl溶液洗滤3~5个体积。
4.如权利要求1 所述的一种白喉疫苗的制备方法，其特征在于: 所述步骤3)中切向流超滤系统是使用截留分子量为1KD的Quixstand中空纤维柱进行超滤。
5.如权利要求1所述的一种白喉疫苗的制备方法，其特征在于: 所述步骤4)中纯化方法为分子筛层析法，其中分子筛填料为Sephacryl S-300HR。
6.如权利要求1所述的一种白喉疫苗的制备方法，其特征在于: 所述步骤I)中发酵培养采用合成培养基，所述合成培养基包括:20g/L酸水解酪蛋白、5g/L 蛋白胨、2.5g/L 麦芽糖、2.5ml/L 乳酸，lml/L Mueller 氏 I 号液、2ml/L Mueller 氏 II号液、浓度低于0.10mg/ml的铁离子。
【文档编号】A61K39/05GK104027797SQ201410276097
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月19日 优先权日:2014年6月19日
【发明者】耿星涛, 樊可, 陶亮, 马世勇, 许小媛, 贾福利, 刘彪, 贾涛 申请人:山东亦度生物技术有限公司