一种Tat蛋白及其制备方法和应用的利记博彩app
【专利摘要】一种Tat蛋白，所述的Tat蛋白的氨基酸序列如SEQ?NO:1、SEQ?NO:2、SEQ?NO:3、SEQ?NO:4所示。本发明的Tat蛋白不但具有较好的潜伏感染激活功能，而且降低了细胞毒性和在体内的免疫原性。包括上述结构功能的蛋白能够作为HIV-1潜伏感染激活的潜在药物进行研究和开发。
【专利说明】一种Tat蛋白及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种抗病毒化合物，更具体地，涉及一种改良的Tat蛋白及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]高效抗逆转录病毒治疗(HighlyActive Antiretroviral Therapy, HAART)治疗可以有效地将病人体内的病毒数量控制到检测不到的程度，但是潜伏感染的HIV-1 (人类免疫缺陷病毒一型)前病毒整合进宿主的基因组中形成储存库以后很难去除。病人必须长期用药以抑制病毒复制，一旦撤药就会造成病毒复制的回弹。怎样清除HIV-1的潜伏感染已经成为彻底治愈艾滋病的瓶颈问题。
[0003]白介素2 (Interleukin 2，IL-2)和ant1-CD3等细胞因子曾被用于激活HIV-1的潜伏感染，这些细胞因子使细胞在整体水平上发生了激活，对机体造成了极大的毒副作用。多种组蛋白乙酰化酶抑制剂(Histone Deacetylase inhibitor, HDACi)也是目前研究比较多的潜伏激活剂，一方面由于HDACi对基因的激活也是广谱效应，容易引起其他基因的异常表达，另一方面在体外效果比较好的HDACi,如valproc acid (VPA)和Vorinostat (即suberanilohydroxamic acid, SAHA)等,在临床上的表现都不佳,不能够投入实际应用。因此，寻找新的特异性强、高效而安全的潜伏激活剂是当务之急。
[0004]HIV-1 Tat是HIV-1特异性的反式激活因子，该蛋白特异地结合到HIV-1 5’LTR的TAR上，将HIV-1 mRNA的转录抬高数百倍。Tat蛋白在HIV-1的潜伏感染中也是关键的因子。该蛋白带有穿膜肽，被证明具有高效穿过细胞膜的功能；曾被设计作为HIV-1的疫苗进入临床实验使用，对人体相对安全。但Tat蛋白被证明具有诱导凋亡的功能，可能对免疫细胞功能造成影响。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一就是寻找一种新的抗HIV途径，
首先提供一种Tat蛋白在制备抗HIV药物中的应用，本发明采用的是TAT-86来证明效
果O
[0006]更进一步提供一种减毒Tat蛋白在制备抗HIV药物中的应用，所述的减毒Tat蛋白氨基酸序列 SEQ NO: 1、SEQ NO:2, SEQ NO:3, SEQ NO:4 所示。
[0007]更进一步提供一种减毒Tat蛋白，所述的减毒Tat蛋白氨基酸序列SEQ NO:1(R4M4)、SEQN0:2 (R4M5)、SEQ NO: 3 (R4M7)、SEQ NO:4 (R5M4)所示。
[0008]进一步提供一种上述的减毒Tat蛋白的制备方法，其特征在于，首先选择定点突变的位点，对这些位点在 Tat的基因上进行定点突变,最终得到大量保留Tat的反式激活功能，并去除其中凋亡和其他活性的减毒蛋白。
[0009]本发明具有以下优点:
1.本发明的目的在于提供若干减毒的HIV-1 Tat蛋白用于激活HIV-1潜伏感染。[0010]2.本发明提供了一种利用HIV-1自身的反式激活蛋白Tat作为激活潜伏感染工具的思路，并且通过累计突变对Tat蛋白进行改造，使其在安全性上更加可靠。
[0011]3.本发明提供四种减毒的Tat蛋白，能够在细胞水平上特异性激活HIV-1潜伏感染。
[0012]4.本发明提供了一种改良的HIV-1体外潜伏感染模型的构建方式。
[0013]5.本发明提供一种减毒Tat蛋白跟SAHA联用激活HIV-1潜伏感染的新方法。
[0014]6.本发明提供的减毒Tat蛋白对免疫细胞的功能不造成影响。
[0015]7.本发明发现Tat蛋白的具备较好的反式激活活性，能够有效抬高HIV-1 mRNA的转录。
[0016]8.Tat蛋白具备良好的穿膜活性，能够有效进入细胞和各个组织发挥功能。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1:HIV1 Tat蛋白改造及筛选原理。
[0018]图2:四种减毒Tat的模式图。 [0019]图3:四种减毒Tat能够在Tzm-bl中激活HIV-1的启动子。
[0020]图4:Tat-R5M4的改造降低了细胞毒性和凋亡活性。
[0021]图5:Tat-R5M4能有效地穿膜进入细胞以及各个组织。
[0022]图6 =HIV-1体外潜伏感染模型的构建。
[0023]图7:Tat-R5M4能有效激活HIV-1体外潜伏模型。
[0024]图8:Tat-R5M4能有效激活来自临床病人外周血的潜伏感染状态的⑶4+T细胞。
[0025]图9:急性毒性实验和免疫原性检测。
【具体实施方式】
[0026]下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本【技术领域】常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。
[0027]实施例一:对Tat蛋白的改造和活性检测
在过去的几十年中，HIV-1 Tat的结构和功能已经有很详细的研究。在本发明中，我们通过积累突变改造出去除凋亡活性，同时保留大部分反式激活活性的Tat蛋白。由于Tat蛋白前三个结构域(氨基酸1-59)的研究已经非常详尽，所以我们首先选择研究较少的氨基酸60-72进行点突变，将突变的基因连接到真核表达载体上转染Tzm-bl细胞后检测荧光素酶活性，其中只有M36，M39, M51,M66, M67, M68, M69, M77保留了≥80%的反式激活活性。接着我们把这些突变进行组合叠加，进行了一共六轮突变，最后得到4个候选蛋白:R4M4，R4M5，R4M7，R5M4，其中R5M4积累了最多5个点突变。
[0028]其中R4M4在定点突变中，将第36位的缬氨酸用丙氨酸取代，第66位的谷氨酰胺用丙氨酸取代，第67位的缬氨酸用丙氨酸取代，第68位的丝氨酸用丙氨酸取代。
[0029]其中R4M5在定点突变中，将第39位的异亮氨酸用丙氨酸取代，第66位的谷氨酰胺用丙氨酸取代，第67位的缬氨酸用丙氨酸取代，第68位的丝氨酸用丙氨酸取代。
[0030]其中R4M7在定点突变中，第66位的谷氨酰胺用丙氨酸取代，第67位的缬氨酸用丙氨酸取代，第68位的丝氨酸用丙氨酸取代，第77位的丝氨酸用丙氨酸取代。[0031]其中R5M4在定点突变中，将第36位的缬氨酸用丙氨酸取代，第66位的谷氨酰胺用丙氨酸取代，第67位的缬氨酸用丙氨酸取代，第68位的丝氨酸用丙氨酸取代，第77位的丝氨酸用丙氨酸取代。
[0032]将R4M4，R4M5，R4M7，R5M4克隆到原核表达载体中进行表达及纯化，获得的蛋白对Tzm-bl细胞进行处理,48小时后检测Firefly Luciferase的活性。
[0033]该实验证明改造的R4M4，R4M5，R4M7，R5M4在Tzm-bl中具有良好的反式激活活性。
[0034]实施例二:细胞毒性和凋亡活性检测
分别将 IOnM, 50nM, IOOnM, 500nM, IuM, 2uM, 3uM, 4uM 的 Tat-86 或 Tat_R5M4 与Tzm-bl细胞共同孵育，48小时后用MTS法检测细胞活力。分别用0.lug，0.5ug, lug,2ug的Tat-86 (根据常规的技术进行原核表达，引用文献:Expression of full lengthTat in E.coli and its purification)和 Tat_R5M4 和 Jurkat 细胞共孵育，48 小时后用Annexin-V-FITC和PE双染色，通过流式细胞术检测凋亡比例。
[0035]本实验证明Tat_R5M4明显降低了细胞毒性和诱导凋亡的能力。
[0036]实施例三:检测Tat_R5M4的穿膜活性
为了验证Tat-R5M4在突变后是否影响穿膜活性，纯化的Tat_R5M4蛋白用NHS-罗丹明(NHS-Rhodanmine)进行了标记,标记过的蛋白分别处理PBMC和Jurkat细胞6小时后用流式检测Tat进入细胞的状态。Tat-R5M4具有良好的穿膜活性。为了检测Tat_R5M4进入细胞以后在胞质跟胞质的分布情况，Tzm-bl细胞用纯化的Tat-R5M4蛋白处理后用Tat_R5M4的抗体进行免疫荧光检测，我们发现Tat-R5M4进入细胞后大部分分布在胞质，仅有少量蛋白进入胞核。为了检测Tat-R5M4蛋白在小鼠体内的分布情况，罗丹明标记的Tat_R5M4蛋白通过尾静脉注射进入小鼠体内，6小时后脾脏、胸腺、大脑和小肠等组织制作切片后检测，发现Tat-R5M4明显分布在这些组织中。
[0037]本实验证明了改造后的蛋白完整保留了其穿膜特性，能够高效进入细胞和组织发挥功能。
[0038]实施例四:HIV-1体外潜伏感染模型的构建
用带有&7-J?基因的假病毒感染激活的原代⑶4+T细胞，通常阳性率在5%-10%之间。感染3天后，我们通过流式分选把GFP阳性的细胞分选出来，用添加了 IL-2的PRM1640培养基继续培养，同时添加CD3和CD28抗体进行再次激活，一周后换成不添加任何细胞因子PRM1640培养基，培养3-4周后撤除IL-2使细胞逐步进入静息状态。这些静息状态的细胞即可用于潜伏激活剂的检测。
[0039]实施例五:Tat_R5M4在HIV-1体外潜伏感染模型和临床病人来源的⑶4+T细胞中的激活作用
用体外构建的潜伏感染系统对Tat-R5M4激活潜伏感染的能力进行检测，同时用CD3/⑶28和SAHA处理作为阳性对照，三天后通过荧光显微镜观察GFP阳性细胞的比例。
[0040]用CD3/CD28抗体和SAHA作为阳性对照，同时用Tat_R5M4或者Tat_R5M4和SAHA联用处理分离的临 床样本⑶4+T细胞，18小时后取上清，提取RNA检测上清中的HIV-1 RNA含量。
[0041]以上实验证明Tat_R5M4能有效地激活HIV-1体外潜伏感染模型和临床病人样本来源的潜伏状态的CD4+T细胞，同时与SAHA联用能增强其反式激活效应。[0042]实验六:急性毒性实验和免疫原性检测
为了给后续的动物实验提供了一定的理论支持，Tat-R5M4蛋白的毒性被进行进一步的检测。首先，用Babl/c小鼠进行的急性毒性实验表明，当尾静脉注射剂量达到40mg/ml时小鼠依然生存良好。小鼠的丙氨酸氨基转移酶或谷丙(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶或谷草(AST)、尿素氮(BREA)和CR (肌酐)等指标经检测都处于正常水平，病理切片也显示，除了野生型Tat-86蛋白引起了肝部局部炎症细胞的浸润，小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺部和肾都未显示明显损伤，表明Tat-R5M4对小鼠实验而言是安全的。同时，我们发现尾静脉注射Tat-86 —周后，小鼠的脾脏有明显的肿大，说明Tat-86会引起明显的免疫反应，但Tat-R5M4不会引起类似的现象。继而我们分别用Tat-86和Tat_R5M4皮下注射免疫小鼠，在7天，14天,21天时分别断尾取血检测Tat抗体的浓度,发现Tat_R5M4刺激产生的抗体量明显要低于Tat-86。
[0043]本实验证明改 造后的Tat_R5M4对小鼠相对安全，且免疫原性显著降低，比野生型Tat-86更适于进行体内实验。
【权利要求】
1.一种Tat蛋白在制备抗HIV药物中的应用。
2.一种减毒Tat蛋白在制备抗HIV药物中的应用，其特征在于，所述的减毒Tat蛋白氨基酸序列 SEQ NO: 1、SEQ NO: 2、SEQ NO: 3、SEQ NO: 4 所示。
3.一种减毒Tat蛋白，其特征在于，所述的减毒Tat蛋白氨基酸序列SEQ NO: 1、SEQNO: 2、SEQ NO: 3、SEQ NO:4 所示。
4.一种根据权利要求3所述的减毒Tat蛋白的制备方法，其特征在于，首先选择定点突变的位点，对这些位点在Tat的基因上进行定点突变,最终得到大量保留Tat的反式激活功能，并去除其中凋亡和 其他活性的减毒蛋白。
【文档编号】A61K38/16GK104001155SQ201410259996
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月12日 优先权日:2014年6月12日
【发明者】张辉, 耿冠男 申请人:中山大学