一种分离富集菊花提取液中黄酮的方法
【专利摘要】本发明涉及一种分离富集菊花提取液中黄酮的方法，尤其涉及一种用双水相浮选技术来分离富集菊花中的黄酮的方法，属于医药化工【技术领域】。本发明利用小分子醇/盐双水相气浮溶剂浮选法分离富集菊花中的黄酮，是以低成本的小分子醇丙酮作为浮选溶剂，以硫酸铵((NH4)2SO4)作为盐析剂，利用惰性气体N2对菊花中黄酮进行分离富集；用该方法得到的菊花黄酮的回收率和分配系数分别为76.81%和50.93，富集倍数高达13.56，是双水相萃取的7倍左右，体现了该技术的最大优势-节省有机溶剂用量，成本低，对环境污染小。
【专利说明】一种分离富集菊花提取液中黄酮的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种分离富集菊花提取液中黄酮的方法，尤其涉及一种用双水相浮选技术来分离富集菊花中的黄酮的方法，特指以小分子醇类丙酮为浮选剂，以硫酸铵作为分相的盐析剂，在惰性气体N2的作用下基于小分子醇类双水相气浮溶剂浮选法(ATPF)分离富集菊花提取液中的黄酮的方法，属于医药化工【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 黄酮类化合物(Flavonoid)是指具有C6-C3-C6基本结构的天然产物，大部分为色原酮的衍生物，广泛存在于药用植物、水果、蔬菜和牧草当中，是植物在长期自然选择过程中产生的一些次级代谢产物。最初，这类物质的粗制品仅作为燃料使用，20世纪20年代以来，国外把槲皮素，芦丁用于临床药物后，才逐渐引起人们的关注。之后相继发现黄酮类化合物具有VC的活性和较强的抗油脂氧化能力。至80年代以后，对其研究又开始转向对活性氧自由基的清除以及对老年疾病的防治功能上，发现在生物体内黄酮类化合物具有显著的抗菌抗病毒、抗炎抗过敏、防癌抗癌、抗衰老、预防心血管疾病、调节免疫和止血镇痛等功效。近年来，随着黄酮类化合物在食品，药品，化妆品等行业中的广泛应用，黄酮类化合物的独特功效将得到不断的发掘及应用。因此采用不同方法，从大自然中获取黄酮类化合物被各国政府，医药部门列为重要的研究热点，黄酮类化合物也日益成为天然药材，保健食品的一类功能因子而备受人们亲睐。
[0003]菊花是被子植物门双子叶植物纲菊目菊科菊属多年生菊科草本植物，它的主要化学成份包括黄酮类化合物，三萜类化合物，挥发油等。目前已经从菊花中分离得到的黄酮类化合物有:香叶木素，芹菜素，木犀草素，榭皮素，橙皮素等。传统的黄酮提取方法包括有机溶剂提取法、固相萃取法、超临界萃取法、超声波提取法。但是这些方法操作复杂，所需设备成本高，同时提取出来的黄酮杂质多，纯度低，产品的商业价值小。因此，需要建立一种高效、无污染的绿色分离纯化方法。
[0004]双水相体系是一类新型萃取分离体系，它是由两种聚合物或一种聚合物和一种盐的水溶液在一定浓度下混合自发形成的两相体系，具有无毒、无污染、萃取条件温和、样品易分离、操作简单等优点。与传统的双水相萃取体系相比，小分子醇-无机盐双水相体系使用的有机溶剂成本低且易于蒸发回收，分相时间短，萃取过程不易乳化，达到绿色化学的目的。
[0005]1955年由Albertson首先利用双水相技术来分离生物分子(Albertson P A,(1986) Partition of cell Particles and Macromolecules, 3rd ed., New York, JohnWiley & Sons)，在随后的几十年中，这项技术有了长足的发展。近几年来，双水相技术在动力学研究、双水相亲和分离、多级逆流层析、反应分离耦合等方面都取得了显著的成绩。由于其操作条件温和、有机溶剂用量少、可调节因素多及易于工业化放大和操作等，广泛用于物质的提取和分离富集。
[0006]Sebba 于 1962 年首次提出溶剂浮选(Solvent Sublation,简称 SS) (Sebba F.1onFlotation.New York: Elsevier, 1962, Page 154.),是指将一定量非极性、弱极性或混合有机溶剂加在待浮选溶液的表层，直接将目标物浮选至上相。与常规分离方法相比，具有设备简便、操作简单、浓缩分离快、富集倍数高(通常达IO4)、耗能低等特点，尤其适用于处理大量试样和分离富集极稀溶液中的痕量成分。
【发明内容】
[0007]本发明旨在克服菊花黄酮提取工艺复杂，成本高，耗时低效的缺陷问题，提供一种操作简单，成本低廉同时易于工业化生产的双水相气浮溶剂浮选法提取分离菊花中的黄酮的方法，使得菊花资源能更好的被我们开发利用。
[0008]本发明采用的技术方案是:
利用小分子醇/盐双水相气浮溶剂浮选法分离富集菊花中的黄酮，是以低成本的小分子醇丙酮作为浮选溶剂，以硫酸铵((NH4)2SO4)作为盐析剂，利用惰性气体N2对菊花中黄酮进行分离富集的方法。
[0009]本发明具体步骤:
(I)用超声细胞破碎仪对菊花进行粗提取，用循环冰水浴控制粗提液的温度在超声结 束后为35±1°C (上升10°C左右)。
[0010]其中提取溶剂为30%-80%的乙醇溶液，超声功率为70%_30%(额定输出功率650W)，料液比(g/mL)为 1:50-2:50，超声时间 5 min-20 min。
[0011]通过单因素实验得到超声提取菊花黄酮的最佳条件-料液比1.5:50，60%的乙醇溶液，超声功率55%，超声提取时间10 min。
[0012]超声结束后减压抽滤得菊花黄酮粗提液，粗提液中黄酮的浓度为1.17-1.50 mg/mL。
[0013](2)在磨口比色管中，加入固体硫酸铵((NH4)2SO4)和蒸馏水，振荡使其溶解，然后加入超声提取的菊花粗提液。
[0014]其中，硫酸铵溶液的浓度为26%_30%，粗提液与溶液总体积的比例为1:10。
[0015](3)将上述溶液转至浮选池中，加入浮选溶剂丙酮进行浮选后，停止通气，待无气泡时用滴管移取出上相有机相，下相从浮选池底部开关流出，用紫外-可见分光光度法在波长510 nm处分析测定上下相中的黄酮含量。
[0016]其中，加入的浮选溶剂丙酮为4_5mL, N2浮选流速为10-50 mL/min,浮选20-60min。
[0017](4)用响应曲面BBD优选出浮选的最佳条件。
[0018]浮选最佳条件为:26%的(NH4)2SO4溶液，上相加入的丙酮的体积为4.1 mL，浮选流速30 mL/min,浮选时间为50 min。
[0019](5)将浮选上相进行旋转蒸发，在得到菊花黄酮膏状物的同时，也实现了丙酮的分离和
回收，然后将黄酮膏状物置于真空干燥箱中进行干燥，得到黄酮终产物。
[0020]本发明的有益效果:
本发明建立了一种全新的分离富集菊花中黄酮体系一小分子醇类/盐双水相气浮溶剂浮选法(ATPF)。它是将气浮溶剂浮选的气泡以传质方式引入到小分子醇/盐双水相体系中而形成的一种新的分离技术。这种新型的分离模式集小分子醇/盐双水相萃取优点(样品易分离、操作简单、适用于极性和弱极性及非极性物质的分离/富集等)和气浮浮选优点(高富集倍数、高选择性、有机溶剂用量少、适合大剂量样品分离/富集等)于一体，改变了有机溶剂只能浮选非极性物质的局限性，富集倍数高、选择性好。用该方法得到的菊花黄酮的回收率和分配系数分别为76.81%和50.93，富集倍数高达13.56，是双水相萃取的7倍左右。体现了该技术的最大优势一节省有机溶剂用量，成本低，对环境污染小。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为超声提取时间和料液比对黄丽粗提液的影响。
[0022]图2为小分子醇和无机盐的选择。
[0023]图3为(NH4)2SO4浓度对黄酮浮选率的影响。
[0024]图4为浮选时间对黄酮浮选率，分配系数和富集倍数的影响。
[0025]图5为浮选流 速对黄酮浮选率，分配系数和富集倍数的影响。
[0026]图6为pH对黄酮浮选率，分配系数和富集倍数的影响。
【具体实施方式】
[0027]下面的实施实例是为了使本领域的技术人员理解本发明，但不以任何方式限定本发明。
[0028]下面结合具体实例对本发明作进一步的说明。
[0029]实施例1:
一种分离富集菊花粗提液中黄酮的方法，具体步骤如下:
称取I g菊花花瓣，向其中加入50 mL 30%的乙醇溶液，超声功率为额定功率的30%，超声20 min，超声停止后，减压抽滤得菊花黄酮粗提液。称取17.57克硫酸铵，加入一定量的蒸馏水配成盐溶液，然后加入5.0毫升菊花上述黄酮粗提液，(蒸馏水的质量和菊花粗提液质量的总和为50克)，震荡混合均匀后，转移至浮选池中，然后从浮选池的顶端加入4.0 mL丙酮，在10 mL/min的流速下浮选20 min。浮选结束后,停止通气,待溶液中无气泡时取出浮选上相。将其旋转蒸发，在真空干燥箱中干燥得到菊花黄酮产品。黄酮在上相的回收率为52.07%，分配系数为4.62，浓缩因子为3.51。
[0030]实施例2:
一种分离富集菊花粗提液中黄酮的方法，具体步骤如下:
称取2 g菊花花瓣，向其中加入50 mL 80%的乙醇溶液，超声功率为额定功率的70%，超声5 min，超声停止后，减压抽滤得菊花黄酮粗提液。称取21.43克硫酸铵，加入一定量的蒸馏水配成盐溶液，然后加入5.0毫升菊花上述黄酮粗提液(蒸馏水的质量和菊花粗提液质量的总和为50克)，震荡混合均匀后，转移至浮选池中，然后从浮选池的顶端加入5.0 mL丙酮,在50 mL/min的流速下浮选60 min。浮选结束后,停止通气,待溶液中无气泡时取出浮选上相。将其旋转蒸发，在真空干燥箱中干燥得到菊花黄酮产品。黄酮在上相的回收率为66.54%，分配系数为47.25，浓缩因子为7.21。
[0031]实施例3:
一种分离富集菊花粗提液中黄酮的方法，具体步骤如下:称取1.5 g菊花花瓣，向其中加入50 mL 55%的乙醇溶液，超声功率为额定功率的50%，超声12.5 min，超声停止后，减压抽滤得菊花黄酮粗提液。称取19.45克硫酸铵，加入一定量的蒸馏水配成盐溶液，然后加入5.0毫升菊花上述黄酮粗提液(蒸馏水的质量和菊花粗提液质量的总和为50克)，震荡混合均匀后，转移至浮选池中，然后从浮选池的顶端加入4.5mL丙酮,在30 mL/min的流速下浮选40 min。浮选结束后,停止通气,待溶液中无气泡时取出浮选上相。将其旋转蒸发，在真空干燥箱中干燥得到菊花黄酮产品。黄酮在上相的回收率为79.24%，分配系数为69.25，浓缩因子为8.12。
[0032]实施例4:超声提取菊花黄酮粗提液的选择
为了增加传质过程，得到最大浓度的菊花黄酮粗提液，借助超声作用首先从菊花固体中提取菊花粗提液。发挥到最大程度，讨论了超声提取条件对菊花黄酮粗提液浓度的影响。考虑到温度对超声提取的影响不是很大，另一方面，温度过高也不利于黄酮的保存，用冰水浴来减小在超声过程中的升温，使得从超声开始至结束提取液温度控制在35°C左右。超声波细胞粉碎仪的功率不能过大，否则会损坏超声探头，功率过小又会增加超声时间，所以本发明固定超声功率在55%。因此讨论了料液比和超声时间对菊花粗提液黄酮浓度的影响，结果如图1所示，随着超声时间的增加，黄酮浓度先增加后来基本保持不变。超声加快了黄酮的扩散，同时增加了黄酮从菊花细胞中释放到溶液中的速度。但是一段时间过后绝大部分菊花细胞已经破裂并且破裂的细胞中的黄酮已经释放到溶液中了，所以黄酮浓度在超声一段时间过后基本不再增加。另一方面，料液比越小，超声达到平衡所需的时间也越短。当料液比增加的时候黄酮浓度也会增加，但是当料液比增大一倍的时候黄酮浓度并没有变为原来的两倍。也就是说，黄酮浓度并未随料液比的成倍增加呈现相对应的变化。此外，当超声功率固定的情况下，烧杯中的菊花花瓣数量越多，越不利于超声探头的保护。综合考虑所有因素，本发明选择料液比1.5:50，超声时间10 min为最佳超声条件。[0033]实施例5:浮选条件的选择
1.有机溶剂和分相盐的选择
选择一种合适的有机溶剂和分相盐是双水相浮选的一个重要因素。小分子醇双水相浮选是将一层小分子醇加在待分离物质试液的表面，该小分子醇应具有能很好地溶解被浮选捕集成分、密度小、粘度小等特点。小分子醇主要是指甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丙酮等。甲醇毒性大且分相困难，乙醇容易盐析不利于浮选的进行，因此实验中讨论了正丙醇和丙酮两种有机溶剂的影响。至于无机盐的选择，磷酸氢二钾为盐相的时候，浮选过程中出现团状聚合物，不利于浮选的进行。所以本发明中比较了磷酸二氢钠和硫酸铵这两种酸性盐和正丙醇与丙酮成相的情况。
[0034]结果如图2所示。从图中可以看出，硫酸铵-丙酮体系中黄酮的浮选率最高，因此最终选择硫酸铵-丙酮作为成相体系。
[0035](NH4)2SO4浓度对黄酮和糖的回收率和分配系数的影响:
当(NH4)2SO4的浓度小于24%时，双水相体系无法形成，超过32%时会发生盐析，所以在这部分我们选择(NH4)2SO4的浓度范围为24%-32%。结果如图3，随着(NH4)2S04浓度增加，黄酮浮选率不断增大，在(NH4)2SO4浓度为28%的时候黄酮浮选率达到最大，随后黄酮浮选率随着(NH4)2SO4浓度的增加而减小。因此选择(NH4)2SO4的浓度为28%进行后续实验。
[0036]2.浮选时间对黄酮浮选率的影响浮选时间对黄酮浮选率的影响见图2。随着浮选时间的增加，黄酮浮选率，分配系数和浓缩因子都升高，当浮选时间为50 min时，黄酮的浮选率和浓缩因子都达到最大，随后基本保持不变。这是由于随着浮选时间的增加，上升的气泡和黄酮分子之间有足够的接触时间，使得目标物吸附在气泡表面的几率增加，因此通过气泡吸附从下相转移到上相的黄酮的量也会增加，即黄酮的浮选率和浓缩因子增加。但是考虑到成本节约问题和时间问题，选择50min为最佳浮选时间。
[0037]3.浮选流速对黄酮浮选率的影响
浮选流速从10-50 mL-min—1中选择5个流速进行考察。从图5可以看出，浮选流速从
10mlrmiiT1增长到30 mlrmirT1的过程中，黄酮的浮选率，分配系数和浓缩因子都呈上升趋势，并在30 mL-min-1时达到最大值，因为浮选流速的增加使得气泡数量增加，即气泡的表面积增大，黄酮吸附在气泡上的机会就会相应的增加，这样黄酮的浮选率也会提高。然而随着浮选流速继续增大，黄酮浮选率反而略有下降。这是因为流速过大时，上下相界面的混乱度就会增大，在浮选上相就会存在一个边缘合并层，使得吸附在气泡表面的目标浮选物不能与上相浮选溶剂接触，而直接从边缘合并层重新返回至下相盐溶液，由此黄酮的浮选率会有不同程度的降低。故本实验中选择浮选流速为30 mL'mirT1。
[0038]4.pH对黄酮浮选率的影响
PH对黄酮浮选率的影响见图6。 pH是影响萃取率的重要因素，由于选择酸性盐作为分相盐，pH环境就应该处于酸性范围内，试验中选择的pH范围为2.0-6.0。随着pH值的增加，黄酮的分配系数和回收率先增加再减小。黄酮的浮选率，分配系数和浓缩因子都在pH
3.0的时候达到最大值。这可能是因为pH为3.0的时候黄酮以分子状态存在，疏水性比较强，更利于浮选。当PH继续增大的时候，酚羟基会有不同程度的解离，导致黄酮分子的亲水性增加。因此在pH为3.0-6.0的时候浮选效果不好。综上所述，pH 3.0是最佳值。
[0039]5.丙酮体积对黄酮浮选率的影响
总得来说，丙酮的初始体积的影响不是很明显。3.0 mL丙酮是最小的体积，因为当丙酮体积小于3.0 mL的时候不能完全覆盖水相，另一方面，吸附在气泡表面的黄酮不能完全溶解在3.0-4.0 mL丙酮中，导致黄酮的浮选率比较低。同时又考虑到增加丙酮体积会减小黄酮的浓缩因子，因此选择4.0 mL丙酮为最佳上相加入量体积。
[0040]6.BBD优化浮选条件
在以上单因素实验的基础上，用BBD响应曲面法优化浮选条件，以(NH4)2SO4浓度(26%-30%)，pH(3.0-5.0)和丙酮初始体积(4.0-5.0 ml)为参数，菊花黄酮的浮选率，分配系数和浓缩因子为响应值，进行了三因素三水平响应面分析实验。实验的水平因素和实验中得到的响应值见表1，利用Design Expert V8.0.6软件对数据进行二次多元回归拟合，得到菊花黄酮浮选率(E)，分配系数(K)和浓缩因子(a)对自变量之间的二次多项回归方程。回归方程系数及方差分析见表2，在单因素实验的基础上通过响应曲面法的优化，获得双水相浮选分离富集菊花黄酮的最佳条件:26% (NH4)2SO4, pH 3.0，上相丙酮初始体积4.1mL。
[0041]实施例6:双水相气浮溶剂浮选和双水相萃取的对比
在最优条件下，双水相气浮溶剂浮选分离富集菊花黄酮和双水相萃取的对比结果显示双水相浮选的浮选率为76.81%，略低于双水相萃取的79.88%，但是双水相浮选的分配系数(50.93)和浓缩因子(13.86)都明显高于双水相萃取的24.21和1.73。
[0042] 表1.响应曲面BBD设计实验
【权利要求】
1.一种分离富集菊花提取液中黄酮的方法，其特征在于，按照以下步骤进行: (1)用超声细胞破碎仪对菊花进行粗提取，用循环冰水浴控制粗提液的温度在超声结 束后为35±1°C ;超声结束后减压抽滤得菊花黄酮粗提液； (2)在磨口比色管中，加入固体硫酸铵和蒸馏水，振荡使其溶解，然后加入步骤(1)中超声提取的菊花粗提液； (3)将步骤(2)中所得溶液转至浮选池中，加入浮选溶剂丙酮进行浮选后，停止通气，待无气泡时用滴管移取出上相有机相，下相从浮选池底部开关流出，用紫外-可见分光光度法在波长510 nm处分析测定上下相中的黄酮含量； (4)用响应曲面BBD优选出浮选的最佳条件； (5)将浮选上相进行旋转蒸发，在得到菊花黄酮膏状物的同时，也实现了丙酮的分离和回收，然后将黄酮膏状物置于真空干燥箱中进行干燥，得到黄酮终产物。
2.根据权利要求1所述的一种分离富集菊花提取液中黄酮的方法，其特征在于，步骤(O中用超声细胞破碎仪对菊花进行粗提取时，提取溶剂为30%-80%的乙醇溶液，超声功率为额定输出功率的70%-30%，其中额定输出功率650 W，料液比为l-2g:50 mL，超声时间5min-20 min。
3.根据权利要求2所述的一种分离富集菊花提取液中黄酮的方法，其特征在于，步骤(1)中用超声细胞破碎仪对菊花进行粗提取时，料液比为1.5:50，提取溶剂为60%的乙醇溶液，超声功率额定输出 功率的55%，超声时间10 min。
4.根据权利要求1所述的一种分离富集菊花提取液中黄酮的方法，其特征在于，步骤(O中所得粗提液中黄酮的浓度为1.17-1.50 mg/mL。
5.根据权利要求1所述的一种分离富集菊花提取液中黄酮的方法，其特征在于，步骤(2)中所述硫酸铵溶液的浓度为26%-30%，粗提液与溶液总体积的比例为1:10。
6.根据权利要求1所述的一种分离富集菊花提取液中黄酮的方法，其特征在于，步骤(2)中所述硫酸铵溶液的浓度为26%。
7.根据权利要求1所述的一种分离富集菊花提取液中黄酮的方法，其特征在于，步骤(3)中所述加入的浮选溶剂丙酮为4-5mL，N2浮选流速为10-50mL/min,浮选时间20-60min。
8.根据权利要求1所述的一种分离富集菊花提取液中黄酮的方法，其特征在于，步骤(3)中所述加入的浮选溶剂丙酮的为4.1 mL, N2浮选流速30 mL/min，浮选时间为50 min。
【文档编号】A61K36/28GK103933096SQ201410173417
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月28日 优先权日:2014年4月28日
【发明者】闫永胜, 刘峪, 韩娟, 刘仕通, 朱康洋 申请人:江苏大学