一种在聚碳酸酯膜上构建用于检测化妆品刺激性的组织工程表皮的方法
【专利摘要】本发明涉及一种在聚碳酸酯膜上构建用于检测化妆品刺激性的组织工程表皮的方法，其特征在于：采用以下步骤：（1）表皮形成细胞的分离培养；（2）脂质混合物溶液的配制；（3）聚碳酸酯膜上构建组织工程表皮。本发明具有以下优点，操作简便，成本低，利于产品的合成和规模生产，产品具有形态分化完全的基底层、棘层、颗粒层、透明层和角质层组织工程表皮，方便用于检测化妆品刺激性。
【专利说明】一种在聚碳酸酯膜上构建用于检测化妆品刺激性的组织工程表皮的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种在聚碳酸酯膜上构建用于检测化妆品刺激性的组织工程表皮的方法。
【背景技术】
[0002]传统皮肤刺激和腐蚀试验多采用动物进行。单次体内皮肤刺激试验一般用兔进行，每次试验至少选择4只健康的成年动物。如预期有刺激反应，初试应考虑使用I只动物。如没有出现明显的阳性反应(红斑或水肿记分大于2)时，应至少再使用2只动物进行试验。如预期无反应，初试可使用3只动物。在使用了至少3只动物后，如仍为疑似反应或不明确，应考虑进行复试。多次体内皮肤刺激试验是指在7-14天内对实验动物进行重复皮肤染毒，对检测化妆品刺激性的效果比单次染毒效果好，特别适用于与皮肤长期密切接触的或反复使用的个人护理产品。每次试验选择三组以上的动物，每组动物雌雄各5-10只，各组分别接受不同剂量的受试物进行测试。根据产品的性质和用途，多次皮肤刺激试验进行染毒程序、方式和次数的调整。皮肤刺激和腐蚀试验的动物实验，所消耗动物批量大，成本高。
[0003]自1959年Russell和Burch提出动物实验的减少、替代和优化(reduction,replacement, and refinement, 3R)理论以来，国外的3R研究发展迅速,特别是近20年，不再以动物模式为基础的毒理学系统已成为生物医学重要发展方向，并被政府和研究机构所接受。一些动物实验替代方法成为关系国际贸易的技术壁垒。欧洲替代法验证中心(European Center for the Validation of Alternative Methods, ECVAM)在 2007 年 5月发布的“人皮肤模型用于体外皮肤刺激试验的技术标准”指南，以及在2008年11月发布的“两项体外皮肤刺激试验验证方法”声明中，均已表明组织工程皮肤可作为体外皮肤刺激试验的替代模型，如组织工程皮肤Episkin?、EpiDerm?和SkinEthic?等,但这些商品化的产品存在价格昂贵、来源受限等缺陷，因此在实验室条件下构建价格较为低廉，便于批量生产的可用于皮肤刺激试验的组织工程皮肤模型可有效解决这些问题。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是，提供一种在聚碳酸酯膜上构建用于检测化妆品刺激性的组织工程表皮的方法，该方法操作简便，便于产品的合成和规模生产，产品具有分化完好的角质层，方便用于检测化妆品刺激性。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:一种在聚碳酸酯膜上构建用于检测化妆品刺激性的组织工程表皮的方法，其特征在于:采用以下步骤:
(I)表皮形成细胞的分离培养:无菌条件下取引产胎儿背部皮肤16cm2，轧制成0.5cmX0.5cm大小的皮块，用生理盐水洗涤，用30ml质量百分比为0.125%的Dispase II酶在20°C消化10小时，再加入IOml质量百分比0.1%胰蛋白酶在37°C消化30分钟，获得分离成单个细胞的表皮细胞溶液，5000rpm离心10分钟，去掉上层清液，用生理盐水洗涤下层细胞，然后5000rpm离心10分钟，重复清洗和离心3次后，加入50ml含30_60U/ml青霉素、30-50ug/ml链霉素的限制性表皮细胞无血清培养基(DK-SFM)，摇匀后在37°C培养24小时，获得表皮形成细胞分散液，在接种前用生理盐水稀释至细胞密度为1-5X IO5个/ml;
(2)脂质混合物溶液的配制:称取棕榈酸150g、亚油酸100g、花生四烯酸50g,溶于500ml 0.1 mo I/L NaOH溶液，加热至70°C，保温30分钟，然后用4-羟乙基哌嗪乙磺酸调节溶液PH值6.5-7.0，将上述溶液与质量百分比为10%的牛血清白蛋白溶液按体积比1:1-2混匀，55 °C下恒温摇床混合20分钟；
(3)聚碳酸酯膜上构建组织工程表皮:取聚碳酸酯过滤膜(厚度0.2mm,孔径0.4 μ m，面积0.64 cm2)表面涂覆10%的IV胶原蛋白水溶液，在37°C烘箱放置I小时干燥后，然后在表面接种步骤I准备的细胞密度为1-5 X IO5个/ml的表皮形成细胞分散液0.5ml，涂覆均匀，将接种后的聚碳酸酯薄膜置于新鲜Epilife培养基进行气液面培养，培养48小时后换新鲜Epilife培养基，按每100ml Epilife培养基中加入步骤2配制的20_30ml脂质混合物溶液，添加CaCl2和抗坏血酸，使Ca2+浓度1.5-2.0mmoI/L,抗坏血酸浓度在50-60 μ g/mL，继续培养13天后可得生长在聚碳酸酯膜表面，厚度为0.3-0.6mm，具有形态分化完全的基底层、棘层、颗粒层、透明层和角质层组织工程表皮。
[0006]本发明采用表皮形成细胞与聚碳酸酯膜构建组织工程表皮模型的方法，建立可用于皮肤刺激试验的组织工程表皮模型。应用组织工程方法，以聚碳酸酯膜为支架，以人皮肤表皮形成细胞来源，采用气液面培养技术，构建可用于检测化妆品刺激性的组织工程表皮模型。
[0007]聚碳酸酯由于其良好的生物相容性和无毒性，在构建肿瘤细胞转移模型、制作医用透析膜等医学领域应用广泛。本研究在聚碳酸酯膜上构建的组织工程表皮模型，具有与正常表皮高度相似的微观结构，可作为检测化妆品刺激性的组织工程表皮。
[0008]本发明具有操作简便，成本低，便于产品的合成和规模生产，具有形态分化完全的基底层、棘层、颗粒层、透明层和角质层组织工程表皮，方便用于检测化妆品刺激性。
【具体实施方式】
[0009]为进一步说明本发明，结合以下实施例具体阐述:
实施例1:
一种在聚碳酸酯膜上构建用于检测化妆品刺激性的组织工程表皮的方法，采用以下步
骤:
(1)表皮形成细胞的分离培养:无菌条件下取引产胎儿背部皮肤16cm2，轧制成0.5cmX0.5cm大小的皮块，用生理盐水洗涤，用30ml质量百分比为0.125%的Dispase II酶在20°C消化10小时，再加入IOml质量百分比0.1%胰蛋白酶在37°C消化30分钟，获得分离成单个细胞的表皮细胞溶液，5000rpm离心10分钟，去掉上层清液，用生理盐水洗涤下层细胞，然后5000rpm离心10分钟，重复清洗和离心3次后，加入50ml含30U/ml青霉素，30ug/ml链霉素的限制性表皮细胞无血清培养(DK-SFM)，摇匀后在37°C培养24小时，获得表皮形成细胞分散液，在接种前用生理盐水稀释至细胞密度为IX IO5个/ml ；
(2)脂质混合物溶液的配制:称取棕榈酸150g、亚油酸100g、花生四烯酸50g,溶于500ml 0.1 mo I/L NaOH溶液，加热至70°C，保温30分钟，然后用4-羟乙基哌嗪乙磺酸调节溶液PH值6.5，将上述溶液与质量百分比为10%的牛血清白蛋白溶液按体积比1:1混匀，55 °C下恒温摇床混合20分钟；
(3)聚碳酸酯膜上构建组织工程表皮:取聚碳酸酯过滤膜(厚度0.2mm,孔径0.4 μ m，面积0.64 cm2)表面涂覆10%的IV胶原蛋白水溶液，在37°C烘箱放置I小时干燥后，然后在表面接种步骤I准备的细胞密度为IX IO5个/ml的表皮形成细胞分散液0.5ml，涂覆均匀，将接种后的聚碳酸酯薄膜置于新鲜Epilife培养基进行气液面培养，培养48小时后换新鲜Epilife培养基，按每100ml Epilife培养基中加入步骤2配制的20ml脂质混合物溶液，添加CaCl2和抗坏血酸，使Ca2+浓度在1.5mmol/L,抗坏血酸浓度在50 μ g/mL，继续培养13天后可得生长在聚碳酸酯膜表面，厚度为0.3mm，具有形态分化完全的基底层、棘层、颗粒层、透明层和角质层组织工程表皮。
[0010]实施例2:
一种在聚碳酸酯膜上构建用于检测化妆品刺激性的组织工程表皮的方法，采用以下步
骤:
(1)表皮形成细胞的分离培养:无菌条件下取引产胎儿背部皮肤16cm2，轧制成0.5cmX0.5cm大小的皮块，用生理盐水洗涤，用30ml质量百分比为0.125%的Dispase II酶在20°C消化10小时，再加入IOml质量百分比0.1%胰蛋白酶在37°C消化30分钟，获得分离成单个细胞的表皮细胞溶液，5000rpm离心10分钟，去掉上层清液，用生理盐水洗涤下层细胞，然后5000rpm离心10分钟，重复清洗和离心3次后，加入50ml含35U/ml青霉素，35ug/ml链霉素的限制性表皮细胞无血清培养(DK-SFM)，摇匀后在37°C培养24小时，获得表皮形成细胞分散液，在接种前用生理盐水稀释至细胞密度为2X IO5个/ml;
(2)脂质混合物溶液的配制:称取棕榈酸150g、亚油酸100g、花生四烯酸50g,溶于500ml 0.1 mo I/L NaOH溶液，加热至70°C，保温30分钟，然后用4-羟乙基哌嗪乙磺酸调节溶液PH值6.5，将上述溶液与质量百分比为10%的牛血清白蛋白溶液按体积比1:1混匀，55 °C下恒温摇床混合20分钟；
(3)聚碳酸酯膜上构建组织工程表皮:取聚碳酸酯过滤膜(厚度0.2mm,孔径0.4 μ m，面积0.64 cm2)表面涂覆10%的IV胶原蛋白水溶液，在37°C烘箱放置I小时干燥后，然后在表面接种步骤I准备的细胞密度为2 X IO5个/ml的表皮形成细胞分散液0.5ml，涂覆均匀，将接种后的聚碳酸酯薄膜置于新鲜Epilife培养基进行气液面培养，培养48小时后换新鲜Epilife培养基，按每100ml Epilife培养基中加入步骤2配制的20_30ml脂质混合物溶液，添加CaCl2和抗坏血酸，使Ca2+浓度在1.5mmol/L,抗坏血酸浓度在50 μ g/mL,继续培养13天后可得生长在聚碳酸酯膜表面，厚度为0.4mm，具有形态分化完全的基底层、棘层、颗粒层、透明层和角质层组织工程表皮。
[0011]实施例3:
一种在聚碳酸酯膜上构建用于检测化妆品刺激性的组织工程表皮的方法，采用以下步
骤:
(I)表皮形成细胞的分离培养:无菌条件下取引产胎儿背部皮肤16cm2，轧制成0.5cmX0.5cm大小的皮块，用生理盐水洗涤，用30ml质量百分比为0.125%的Dispase II酶在20°C消化10小时，再加入IOml质量百分比0.1%胰蛋白酶在37°C消化30分钟，获得分离成单个细胞的表皮细胞溶液，5000rpm离心10分钟，去掉上层清液，用生理盐水洗涤下层细胞，然后5000rpm离心10分钟，重复清洗和离心3次后，加入50ml含40U/ml青霉素，40ug/ml链霉素的限制性表皮细胞无血清培养(DK-SFM)，摇匀后在37°C培养24小时，获得表皮形成细胞分散液，在接种前用生理盐水稀释至细胞密度为3X IO5个/ml;
(2)脂质混合物溶液的配制:称取棕榈酸150g、亚油酸100g、花生四烯酸50g,溶于500ml 0.1 mo I/L NaOH溶液，加热至70°C，保温30分钟，然后用4-羟乙基哌嗪乙磺酸调节溶液PH值7.0，将上述溶液与质量百分比为10%的牛血清白蛋白溶液按体积比1: 1.5混匀，55 °C下恒温摇床混合20分钟；
(3)聚碳酸酯膜上构建组织工程表皮:取聚碳酸酯过滤膜(厚度0.2mm,孔径0.4 μ m，面积0.64 cm2)表面涂覆10%的IV胶原蛋白水溶液，在37°C烘箱放置I小时干燥后，然后在表面接种步骤I准备的细胞密度为3 X IO5个/ml的表皮形成细胞分散液0.5ml，涂覆均匀，将接种后的聚碳酸酯薄膜置于新鲜Epilife培养基进行气液面培养，培养48小时后换新鲜Epilife培养基,按每100ml Epilife培养基中加入步骤2配制的30ml脂质混合物溶液，添加CaCl2和抗坏血酸，使Ca2+浓度在2.0mmoI/L,抗坏血酸浓度在50 μ g/mL,继续培养13天后可得生长在聚碳酸酯膜表面，厚度为0.45_，具有形态分化完全的基底层、棘层、颗粒层、透明层和角质层组织工程表皮。
[0012]实施例4:
一种在聚碳酸酯膜上构建用于检测化妆品刺激性的组织工程表皮的方法，采用以下步
骤:
(1)表皮形成细胞的分离培养:无菌条件下取引产胎儿背部皮肤16cm2，轧制成0.5cmX0.5cm大小的皮块，用生理盐水洗涤，用30ml质量百分比为0.125%的Dispase II酶在20°C消化10小时，再加入IOml质量百分比0.1%胰蛋白酶在37°C消化30分钟，获得分离成单个细胞的表皮细胞溶液，5000rpm离心10分钟，去掉上层清液，用生理盐水洗涤下层细胞，然后5000rpm离心10分钟，重复清洗和离心3次后，加入50ml含55U/ml青霉素，55ug/ml链霉素的限制性表皮细胞无血清培养(DK-SFM)，摇匀后在37°C培养24小时，获得表皮形成细胞分散液，在接种前用生理盐水稀释至细胞密度为4X IO5个/ml;
(2)脂质混合物溶液的配制:称取棕榈酸150g、亚油酸100g、花生四烯酸50g,溶于500ml 0.1 mo I/L NaOH溶液，加热至70°C，保温30分钟，然后用4-羟乙基哌嗪乙磺酸调节溶液PH值7.0，将上述溶液与质量百分比为10%的牛血清白蛋白溶液按体积比1:2混匀，55 °C下恒温摇床混合20分钟；
(3)聚碳酸酯膜上构建组织工程表皮:取聚碳酸酯过滤膜(厚度0.2mm,孔径0.4 μ m，面积0.64 cm2)表面涂覆10%的IV胶原蛋白水溶液，在37°C烘箱放置I小时干燥后，然后在表面接种步骤I准备的细胞密度为4 X IO5个/ml的表皮形成细胞分散液0.5ml，涂覆均匀，将接种后的聚碳酸酯薄膜置于新鲜Epilife培养基进行气液面培养，培养48小时后换新鲜Epilife培养基,按每100ml Epilife培养基中加入步骤2配制的30ml脂质混合物溶液，添加CaCl2和抗坏血酸，使Ca2+浓度在2.0mmoI/L,抗坏血酸浓度在60 μ g/mL,继续培养13天后可得生长在聚碳酸酯膜表面，厚度为0.53mm，具有形态分化完全的基底层、棘层、颗粒层、透明层和角质层组织工程表皮。
[0013]实施例5:
一种在聚碳酸酯膜上构建用于检测化妆品刺激性的组织工程表皮的方法，采用以下步骤:
(1)表皮形成细胞的分离培养:无菌条件下取引产胎儿背部皮肤16cm2，轧制成0.5cmX0.5cm大小的皮块，用生理盐水洗涤，用30ml质量百分比为0.125%的Dispase II酶在20°C消化10小时，再加入IOml质量百分比0.1%胰蛋白酶在37°C消化30分钟，获得分离成单个细胞的表皮细胞溶液，5000rpm离心10分钟，去掉上层清液，用生理盐水洗涤下层细胞，然后5000rpm离心10分钟，重复清洗和离心3次后，加入50ml含60U/ml青霉素，50ug/ml链霉素的限制性表皮细胞无血清培养(DK-SFM)，摇匀后在37°C培养24小时，获得表皮形成细胞分散液，在接种前用生理盐水稀释至细胞密度为5X IO5个/ml ；
(2)脂质混合物溶液的配制:称取棕榈酸150g、亚油酸100g、花生四烯酸50g,溶于500ml 0.1 mo I/L NaOH溶液，加热至70°C，保温30分钟，然后用4-羟乙基哌嗪乙磺酸调节溶液PH值7.0，将上述溶液与质量百分比为10%的牛血清白蛋白溶液按体积比1: 2混匀，55 °C下恒温摇床混合20分钟；
(3)聚碳酸酯膜上构建组织工程表皮:取聚碳酸酯过滤膜(厚度0.2mm,孔径0.4 μ m，面积0.64 cm2)表面涂覆10%的IV胶原蛋白水溶液，在37°C烘箱放置I小时干燥后，然后在表面接种步骤I准备的细胞密度为5 X IO5个/ml的表皮形成细胞分散液0.5ml，涂覆均匀，将接种后的聚碳酸酯薄膜置于新鲜Epilife培养基进行气液面培养，培养48小时后换新鲜Epilife培养基,按每100ml Epilife培养基中加入步骤2配制的30ml脂质混合物溶液，添加CaCl2和抗坏血酸，使Ca2+浓度在2.0mmoI/L,抗坏血酸浓度在60 μ g/mL,继续培养13天后可得生长在聚碳酸酯膜表面，厚度为0.6mm，具有形态分化完全的基底层、棘层、颗粒层、透明层和角质层组织工程表皮。
【权利要求】
1.一种在聚碳酸酯膜上构建用于检测化妆品刺激性的组织工程表皮的方法，其特征在于采用以下步骤: (1)表皮形成细胞的分离培养:无菌条件下取引产胎儿背部皮肤16cm2，轧制成0.5cmX0.5cm大小的皮块，用生理盐水洗涤，用30ml质量百分比为0.125%的Dispase II酶在20°C消化10小时，再加入IOml质量百分比0.1%胰蛋白酶在37°C消化30分钟，获得分离成单个细胞的表皮细胞溶液，5000rpm离心10分钟，去掉上层清液，用生理盐水洗涤下层细胞，然后5000rpm离心10分钟，重复清洗和离心3次后，加入50ml含30_60U/ml青霉素、30-50ug/ml链霉素的限制性表皮细胞无血清培养基，摇匀后在37°C培养24小时，获得表皮形成细胞分散液，在接种前用生理盐水稀释至细胞密度为1-5X IO5个/ml ； (2)脂质混合物溶液的配制:称取棕榈酸150g、亚油酸100g、花生四烯酸50g,溶于500ml 0.1 mo I/L NaOH溶液，加热至70°C，保温30分钟，然后用4-羟乙基哌嗪乙磺酸调节溶液PH值6.5-7.0，将上述溶液与质量百分比为10%的牛血清白蛋白溶液按体积比1:1-2混匀，55 °C下恒温摇床混合20分钟； (3)聚碳酸酯膜上构建组织工程表皮:取厚度0.2mm、孔径0.4 μ m、面积0.64 cm2的聚碳酸酯过滤膜，表面涂覆质量比为10%的IV胶原蛋白水溶液，在37°C烘箱放置I小时干燥后，然后在表面接种步骤I准备的细胞密度为1-5 X IO5个/ml的表皮形成细胞分散液0.5ml，涂覆均匀，将接种后的聚碳酸酯薄膜置于新鲜Epilife培养基进行气液面培养，培养48小时后换新鲜Epilife培养基，按每100ml Epilife培养基中加入步骤2配制的20-30ml脂质混合物溶液，添加CaCl2和抗坏血酸，使Ca2+浓度1.5-2.0mmoI/L,抗坏血酸浓度在50-60 μ g/mL，继续培养13天后可得生长在聚碳酸酯膜表面，厚度为0.3-0.6_，具有形态分化完全的基底层、棘层、颗粒层、透明层和角质层组织工程表皮。
【文档编号】A61L27/54GK103884835SQ201410088817
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月12日 优先权日:2014年3月12日
【发明者】毕永贤, 杨盼盼, 陈斌 申请人:珀莱雅化妆品股份有限公司