一种哲日格勒-阿木-其其格中提取总生物碱的方法
【专利摘要】本发明公开了一种哲日格勒-阿木-其其格中提取总生物碱的方法，哲日格勒-阿木-其其格作为直接原料的药物不利于工业化生产，产品质量难以得到控制，加之用量大，患者依从性较差。因此，此发明提供了一种具有操作简便、提取时间短、提取率高、安全等优势的从哲日格勒-阿木-其其格中提取总生物碱的方法。该制备方法经过严格控制制备工艺中溶剂浓度，溶剂体积，回流时间和回流次数来优化现有技术。经实验证明提取的总生物碱含量高、成分明确、独特，组成稳定；其质量稳定，可以实现产业化生产，并且在工艺中革出了有机溶剂，避免残留有机溶剂及其对人的潜在毒害。
【专利说明】一种哲日格勒-阿木-其其格中提取总生物碱的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及中药、民族药领域，尤其涉及一种从蒙药成分中提取分离有效成分的方法，特别是从哲日格勒-阿木-其其格(Papaver nudicaule L.)中提取总生物碱成分的方法。
【背景技术】
[0002]溃瘍性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)是一种原因不明的慢性直肠和结肠炎性疾病，是全球性的多发病和常见病，溃疡性结肠炎属蒙医结肠“包如病”范畴。蒙医认为该病的发生与三根不固和三要素失衡有关。其内因是致病三要素(希拉、赫依、巴达干)和齐素、希日乌素。外因是饮食不当、精神刺激、感染等。这些因素均可伤及肠胃，肠胃伤则运化失常，导致肝内恶血(坏血或病血)增多，此恶血经由胃时与巴达干结合，在小肠与希日合并最后到达结肠与赫依聚合，使结肠功能失调，损伤结肠脉络，使肠粘膜损伤，形成粘膜溃疡而引发此病。包如病热邪久积结肠，使热毒成“粘”，雍而为脓，至血败肉腐产生溃疡、出血等病理变化。因此，消“粘”解毒，通行赫依，祛腐生肌是治疗关键。
[0003]根据额尔德尼班智达.松巴堪布的《甘露依法从新》记载，蒙药嘎日迪散(Garid1-san)是传统蒙医治疗“包如病”的经典方剂，由哲日格勒-阿木-其其格(Papavernudicaule L.)和蒙药 阿给(Artemisia frigida ffilld.)组成。哲日格勒-阿木-其其格(P.nudicaule L.)味酸涩、微苦、微寒，归肺、大肠、肾、胃经，功能为敛肺涩肠、燥湿解毒，在我国北方少数民族中主要用于止泻；蒙药阿给(A.frigida ffilld.)味苦，性燥、淡、糙、钝、凉，有止血、消肿、消“奇哈”之功效，用于各种出血、关节肿胀、肾热、月经不调、疮痈等，是蒙医常用的“人造甘露水”组成之一(占布拉?道尔吉，无误蒙药鉴，内蒙占人民出版社，1988)。两药合用具有疏肝除浊，清除腑热、消“粘”解毒、通行赫依、祛腐生肌等作用，在多年临床治疗UC上具有确切的疗效。
[0004]我们在前期研究中发现，蒙药嘎日迪散中抗腹泻作用成分为哲日格勒-阿木-其其格的生物碱(刘朝晖、佟继铭、崔箭、等，云南中医中药杂志，2006，27 (I):51-52;阿里穆斯、王勇、庄丽等，中央民族大学学报，2013，22(3):5-11)。然而，哲日格勒-阿木-其其格和阿给作为直接原料的药物不利于工业化生产，产品质量难以得到控制，加之用量大，患者依从性较差。因此，如何提取哲日格勒-阿木-其其格和阿给的有效成分，又不影响制剂的疗效是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
【发明内容】
[0005]本发明目的是提供一种从哲日格勒-阿木-其其格中提取总生物碱的方法。
[0006]具体地说，本发明提供了一种从哲日格勒-阿木-其其格中提取总生物碱的方法，该制备方法包括以下步骤:
[0007](I)取哲日格勒-阿木-其其格原料，加入18至26倍量体积的70体积％至80体积％的C1-C4烷醇溶剂，回流4至6小时，回流次数为I至3次；[0008]合并提取液，过滤，滤液回收C1-C4烷醇溶剂，浓缩，即得哲日格勒-阿木-其其格提取液；
[0009](2)预处理取吸附树脂；
[0010](3)取预处理后的吸附树脂，装柱，精密量取步骤(1)中的提取液，上样，进行吸附；水洗至流出液中性，C1-C4烷醇溶剂洗脱，合并洗脱液，回收C1-C4烷醇溶剂，即得哲日格勒_阿木_其其格总生物喊。
[0011]在本发明的实施方案中，本发明提供的从哲日格勒-阿木-其其格中提取总生物碱的方法，其中，所述的C1-C4烷醇溶剂选自甲醇、乙醇、或异内醇，优选地，选自乙醇。
[0012]在本发明的实施方案中，本发明提供的从哲日格勒-阿木-其其格中提取总生物碱的方法，其中，所述的吸附树脂选自大孔吸附树脂。
[0013]在一种优选的实施方案中，本发明提供的上述从哲日格勒-阿木-其其格中提取总生物碱的方法包括以下步骤:
[0014](I)取哲日格勒-阿木-其其格原料，加入22至26倍量体积的70体积％至80体积％的C1-C4烷醇溶剂，回流4至6小时，回流次数为I至3次；
[0015]合并提取液，过滤，滤液回收的C1-C4烷醇，浓缩，即得哲日格勒-阿木-其其格提取液；
[0016](2)预处理吸附树 脂；
[0017](3)取预处理后的吸附树脂，湿法装柱，精密量取步骤(1)中的提取液，上样，进行吸附；停留0.5小时后，水洗至流出液中性，用4体积％氨水乙醇溶液洗脱，合并洗脱液，回收乙醇，即得哲日格勒-阿木-其其格总生物碱。
[0018]更优选地，上述哲日格勒-阿木-其其格中提取总生物碱的方法包括以下步骤:
[0019](I)取哲日格勒-阿木-其其格原料,加入26倍量体积的70体积％溶剂，回流4小时，回流次数为2次；合并提取液，过滤，滤液回收乙醇，浓缩，即得哲日格勒-阿木-其其格提取液。
[0020](2)取吸附树脂，浸泡，使其充分膨胀，洗涤；
[0021](3)取预处理后的吸附树脂，湿法装柱，精密量取上步骤(1)中的提取液，上样，进行吸附；停留0.5小时后，水洗至流出液中性，4体积％氨水乙醇溶液沈脱，合并洗脱液，回收乙醇，即得哲日格勒-阿木-其其格总生物碱。
[0022]本发明提供了一种从哲日格勒-阿木-其其格中提取总生物碱的方法，具有操作简便、提取时间短、提取率高、安全等优势。
[0023]通过对上述组成稳定的总生物碱进行LC-MS/MS检测，确证了上述总生物碱的组成及含量。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1表示50体积％乙醇提取条件下从哲日格勒-阿木-其其格生物碱的LC-MS/MS色谱分析结果。
[0025]图2表示70体积％乙醇提取条件下从哲日格勒-阿木-其其格生物碱的LC-MS/MS色谱分析结果。
[0026]图3表示80体积％乙醇提取条件下从哲日格勒-阿木-其其格生物碱的LC-MS/MS色谱分析结果。
【具体实施方式】:
[0027]实施例1:哲日格勒-阿木-其其格总生物碱的提取方法
[0028]取哲日格勒-阿木-其其格0.18，加22倍量70体积％乙醇浸泡过夜，回流提取5小时，过滤，滤液回收乙醇，再加浓缩制成每I毫升含I克生药的溶液，即得哲日格勒-阿木_其其格提取液。
[0029]取预处理后的大孔吸附树脂15毫升，湿法装柱，精密量取上述哲日格勒-阿木-其其格提取液5毫升，上样，进行吸附；停留0.5小时后，水洗至流出液中性，用4体积％氨水乙醇溶液沈脱，合并洗脱液，回收乙醇，即得哲日格勒-阿木-其其格总生物碱。哲日格勒-阿木-其其格总生物碱含量为0.08593%。
[0030]实施例2:哲日格勒-阿木-其其格总生物碱的提取方法
[0031]取哲日格勒-阿木-其其格0.lg，第一次加10倍量70体积％乙醇浸泡过夜，回流提取2.5小时，第二次加7倍量体积的70体积％乙醇回流提取2小时，第三次加5倍量体积的70体积％乙醇回流提取1.5小时，合并三次提取液，过滤，滤液回收乙醇,再加浓缩制成每I毫升含I克生药的溶液，即得哲日格勒-阿木-其其格提取液。
[0032]取预处理后的大孔吸附树脂15毫升，湿法装柱，精密量取上述哲日格勒-阿木-其其格提取 液5毫升，上样，进行吸附。停留0.5小时后，水洗至流出液中性，用4体积％氨水乙醇溶液洗脱，合并洗脱液，回收乙醇，即得哲日格勒-阿木-其其格总生物碱。哲日格勒-阿木-其其格总生物碱含量为0.07946%。
[0033]实施例3:哲日格勒-阿木-其其格总生物碱的提取方法
[0034]取哲日格勒-阿木-其其格0.1g,第一次加10倍量体积的70体积％乙醇浸泡过夜，回流提取2.5小时，第二次加8倍量体积的70体积％乙醇回流提取1.5小时，合并二次提取液，过滤，滤液回收乙醇，再加浓缩制成每I毫升含I克生药的溶液，即得哲日格勒-阿木_其其格提取液。
[0035]取预处理后的大孔吸附树脂树脂15毫升，湿法装柱，精密量取上述哲日格勒-阿木-其其格提取液5毫升，上样，进行吸附。停留0.5小时后，水洗至流出液中性，用4%氨水乙醇溶液洗脱，合并洗脱液，回收乙醇，即得哲日格勒-阿木-其其格总生物碱。哲日格勒-阿木-其其格总生物碱含量为0.11130%。
[0036]实施例4:哲日格勒-阿木-其其格总生物碱的提取方法
[0037]取哲日格勒-阿木-其其格0.lg，第一次加14倍量体积的80%乙醇浸泡过夜，回流提取4小时，第二次加12倍量体积的80%乙醇回流提取2小时，合并二次提取液，过滤，滤液回收乙醇，再加浓缩制成每I毫升含I克生药的溶液，即得哲日格勒-阿木-其其格提取液。
[0038]取预处理后的大孔吸附树脂15毫升，湿法装柱，精密量取上述哲日格勒-阿木-其其格提取液5毫升，上样，进行吸附。停留0.5小时后，水洗至流出液中性，用4体积％氨水乙醇溶液洗脱，合并洗脱液，回收乙醇，即得哲日格勒阿木-其其格总生物碱。哲日格勒-阿木-其其格总生物碱含量为0.10330%。
[0039]实施例5:哲日格勒-阿木-其其格总生物碱的提取方法[0040]取哲日格勒-阿木-其其格0.1g,加22倍量体积的80%乙醇浸泡过夜，回流提取4小时，过滤，滤液回收乙醇，再加浓缩制成每I毫升含I克生药的溶液，即得哲日格勒-阿木_其其格提取液。
[0041]取预处理后的大孔吸附树脂15毫升，湿法装柱，精密量取上述哲日格勒-阿木-其其格提取液5毫升，上样，进行吸附。停留0.5小时后，水沈至流出液中性，用4体积％氨水乙醇溶液洗脱，合并洗脱液，回收乙醇，即得哲日格勒-阿木-其其格总生物碱。哲日格勒-阿木-其其格总生物碱含量为0.10432%
[0042]实施例6:哲日格勒-阿木-其其格总生物碱的提取方法
[0043]取哲日格勒-阿木-其其格0.1g,第一次加8倍量体积的80%乙醇浸泡过夜，回流提取2.5小时，第二次加6倍量体积的80%乙醇回流提取1.5小时，第三次加4倍量体积的80%乙醇回流提取I小时，合并三次提取液，过滤，滤液回收乙醇，再加浓缩制成每I毫升含I克生药的溶液，即得哲日格勒-阿木-其其格提取液。
[0044]取预处理后的大孔吸附树脂15毫升，湿法装柱，精密量取上述哲日格勒-阿木-其其格提取液5毫升，上样，进行吸附。停留0.5小时后，水洗至流出液中性，用4体积％氨水乙醇溶液洗脱，合并洗脱液，回收乙醇，即得哲日格勒-阿木-其其格总生物碱。哲日格勒-阿木-其其格总生物碱含量为0.09649%。
[0045]一、提取溶剂浓度为50%乙醇时的对照试验:
[0046]取哲日格勒-阿木-其其格0.lg，第一次加12倍量体积的50%乙醇浸泡过夜，回流提取3小时，第二次加10倍量体积的50%乙醇回流提取2小时，合并二次提取液，过滤，滤液回收乙醇，再加浓缩 制成每I毫升含I克生药的溶液，即得哲日格勒-阿木-其其格提取液。
[0047]取预处理后大孔吸附树脂15毫升，湿法装柱，精密量取上述哲日格勒-阿木-其其格提取液5毫升，上样，进行吸附。停留0.5小时后，水洗至流出液中性，用4体积％氨水乙醇溶液洗脱，合并洗脱液，回收乙醇，即得哲日格勒-阿木-其其格总生物碱。哲日格勒-阿木-其其格总生物碱含量为0.0079%。
[0048]二、总生物碱含量检测方法
[0049]哲日格勒-阿木-其其格碱成分的LC-MS/MS检测
[0050](I)标准溶液的制备
[0051]分别取10毫升的提取液，平行取两次，将粗提液放入蒸发皿中水浴蒸干。将干膏用20毫升的无水冰醋酸溶解后，7000r -min-l离心2次，每次20min，取上清液，弃去沉淀。采用2010版药典中记载的非水滴定法,用0.1mol *L-1高氯酸的冰醋酸标准溶液为滴定液对粗提物的无水冰醋酸溶液进行滴定，用电位滴定法指示滴定终点并计算生药材中总生物碱的质量分数，计算公式如下:
[0052]n% 二 C(V-V0)X-MX100%
mX1000
[0053]c-高氯酸标准溶液的物质的量浓度(mol.L-1)
[0054]V-样品消耗高氯酸溶液的体积(mL)
[0055]v0-空自实验消耗高氯酸溶液的体积(mL)
[0056]m-生药材的质量(g)[0057]M-哲日格勒-阿木-其其格总生物碱中含量较高的4种生物碱的平均分子量(326.5)
[0058](2)哲日格勒-阿木-其其格生物碱的LC-MS/MS检测方法
[0059]平行称取3份嘎日迪散样品，各0.lg，分别加入浓度为50%、70%、
[0060]80%的乙醇溶液，超声提取2小时，用孔径为0.22 μ m的滤膜过滤0.9mL的上清
液，至进样瓶中，备用。
[0061]色谱条件:色谱柱:ShimadzuShim-pack VP-ODS column (150mmX 2.0mm, 5 μ m);流动相为水(A)-乙腈(B) (O ~25min,B%:10%~ 30%,V/V);流速:0.2mL/min ;柱温:25°C；进样量:5yL。
[0062]质谱条件:离子源:ESI，正离子扫描；扫描范围:m/z100~1200 ;加热模块温度:200°C ;CDL温度:200°C ;雾化气流速:1.5L/min ;干燥气体压力:103.0kPa5IT真空度:1.8e-002Pa, TOF真空度:1.9e_004Pa，离子源电压:正离子模式4.5kV;检测器电压:
1.57kV。
[0063](3)哲日格勒-阿木-其其格生物碱成分的LC-MS/MS检测 [0064]附图1至3表示不同乙醇提取条件下从哲日格勒-阿木-其其格生物碱的LC-MS/MS色谱结果，显示有7个主峰，由总的峰面积可知，总生物碱含量在50%乙醇提取条件下最低，达到608863961(附图1);在70%乙醇提取条件次之，达到680848685 (附图2);在80%乙醇提取条件最高，达到841397654(附图3)。经过计算可知，图中7个主峰的[M+H] +相对分子质量主要集中在340.15，328.15，326.13，324.12，340.26。表1表示样品中主要生物碱成分[M+H]+相对分子质量。
[0065]表1样品中主要生物碱成分[M+H] +相对分子质量
[0066]
【权利要求】
1.一种从哲日格勒-阿木-其其格中提取总生物碱的方法，包括以下制备步骤: (1)取哲日格勒-阿木-其其格原料，加入18至26倍量体积的70体积％至80体积％的C1-C4烷醇溶剂，回流4至6小时，回流次数为I至3次；合并提取液，过滤，滤液回收的C1-C4烷醇，浓缩，即得哲日格勒-阿木-其其格提取液； (2)预处理吸附树脂； (3)取预处理后的吸附树脂，湿法装柱，精密量取步骤(1)中的提取液，上样，进行吸附；水洗至流出液中性，洗脱，合并洗脱液，回收乙醇，即得哲日格勒-阿木-其其格总生物碱。
2.根据权利要求1中所述的从哲日格勒-阿木-其其格中提取总生物碱的方法，其中，所述的C1-C4烷醇溶剂选自甲醇、乙醇、或异丙醇。
3.根据权利要求2中所述的从哲日格勒-阿木-其其格中提取总生物碱的方法，其中，所述的C1-C4烷醇溶剂为乙醇。
4.根据权利要求2中所述的从哲日格勒-阿木-其其格中提取总生物碱的方法，包括以下制备步骤: (1)取哲日格勒-阿木-其其格原料，加入22至26倍量体积的70体积％至80体积％的乙醇溶剂，回流4至6小时，回流次数为I至3次；合并提取液，过滤，滤液回收的乙醇，浓缩，即得哲日格勒-阿木-其其格提取液； (2)预处理吸附树脂； (3)取预处理后的吸附树脂，湿法装柱，精密量取步骤(1)中的提取液，上样，进行吸附；水洗至流出液中性，沈脱，合并洗脱液，回收乙醇，即得哲日格勒-阿木-其其格总生物碱。
5.根据权利要求4中所述的从哲日格勒-阿木-其其格中提取总生物碱的方法，包括以下制备步骤: (1)取哲日格勒-阿木-其其格原料，加入22至26倍量体积的80体积％的乙醇溶剂，回流4至6小时，回流次数为I至3次；合并提取液，过滤，滤液回收的乙醇，浓缩，即得哲日格勒_阿木-其其格提取液； (2)预处理吸附树脂； (3)取预处理后的吸附树脂，湿法装柱，精密量取步骤(1)中的提取液，上样，进行吸附；水洗至流出液中性，洗脱，合并洗脱液，回收乙醇，即得哲日格勒-阿木-其其格总生物碱。
6.根据权利要求4中所述的从哲日格勒-阿木-其其格中提取总生物碱的方法，包括以下制备步骤: (1)取哲日格勒-阿木-其其格原料，加入22至26倍量体积的70体积％的乙醇溶剂，回流4至6小时，回流次数为I至2次；合并提取液，过滤，滤液回收的乙醇，浓缩，即得哲日格勒_阿木-其其格提取液； (2)预处理吸附树脂； (3)取预处理后的吸附树脂，湿法装柱，精密量取步骤(1)中的提取液，上样，进行吸附；水洗至流出液中性，洗脱，合并洗脱液，回收乙醇，即得哲日格勒-阿木-其其格总生物碱。
7.根据权利要求6中所述的从哲日格勒-阿木-其其格中提取总生物碱的方法，包括以下制备步骤: (1)取哲日格勒-阿木-其其格，第一次加14倍量体积的70体积％乙醇浸泡过夜，回流提取2.5小时，第二次加12倍量体积的70体积％乙醇回流提取1.5小时，合并二次提取液，过滤，滤液回收乙醇，再加浓缩制成每I毫升含I克生药的溶液，即得哲日格勒-阿木_其其格提取液； (2)预处理吸附树脂； (3)取预处理后的吸附树脂，湿法装柱，精密量取步骤(1)中的提取液，上样，进行吸附；停留0.5至I小时，水洗至流出液中性，用4体积％氨水乙醇溶液洗脱，合并洗脱液，回收乙醇，即得哲日格勒-阿木-其其格总生物碱。
8.根据权利要求6中所述的从哲日格勒-阿木-其其格中提取总生物碱的方法，包括以下制备步骤: (1)取哲日格勒-阿木-其其格，22倍量体积的70体积％乙醇浸泡过夜，回流提取5小时，过滤，滤液回收乙醇，再加浓缩制成每I毫升含I克生药的溶液，即得哲日格勒-阿木_其其格提取液； (2)预处理吸附树脂； (3)取预处理后的吸附树脂，湿法装柱，精密量取步骤(1)中的提取液，上样，进行吸附；停留0.5至I小时，水洗至流出液中性，用4体积％氨水乙醇溶液洗脱，合并洗脱液，回收乙醇，即得哲日格 勒-阿木-其其格总生物碱。
9.根据权利要求1-8中任一项权利要求所述的从哲日格勒-阿木-其其格中提取总生物碱的方法，其中，所述吸附树脂为大孔吸附树脂。
【文档编号】A61K36/66GK104027402SQ201410088415
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年3月12日 优先权日:2014年3月12日
【发明者】阿里穆斯, 崔箭, 崔勋, 庞宗然, 朱丹, 庄丽, 李慧芳 申请人:阿里穆斯