提高南美白对虾抗病力的马尾藻多糖脂质体纳米制剂的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种马尾藻多糖脂质体纳米制剂制备的乙醇注入法，操作简便，适合大量生产，应用于生产马尾藻多糖脂质体纳米制剂包封率达38%，平均粒径为203nm，且多数在于190～342nm之间，脂质体产品较理想，为今后规模化生产提供了很好的工艺路线，可有效地提高其制剂的药效，保证这种替代抗生素和化学药物饲料添加剂的天然药物高新制剂的市场供应。试验证明，马尾藻多糖脂质体纳米制剂可提高南美白对虾抗病力。饲料中添加马尾藻多糖脂质体纳米制剂，可显著提高南美白对虾的溶菌酶活性，具有免疫促进作用；还能显著提高染毒南美白对虾的存活率，具有较好的保护效果。
【专利说明】提高南美白对虾抗病力的马尾藻多糖脂质体纳米制剂
【技术领域】
[0001]本发明属于马尾藻多糖制剂【技术领域】，尤其涉及一种提高南美白对虾抗病力的马尾藻多糖脂质体纳米制剂。
【背景技术】
[0002]南美白对虾因其生长快、抗环境变化能力强、对饵料的要求低、具有很高的营养价值和经济价值，是目前国际水产品市场和世界虾类养殖业者深受欢迎的争夺对象。据报道2010年世界对虾养殖的总产量350万吨。我国对虾养殖产量也在逐年提高，2010年达到134.8万吨，南美白对虾的产量约占80%，为107.84万吨。为保证南美白对虾养殖的经济效益，亟待提高其抗病力。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题是提供一种安全可靠、无激素、无副作用及药物残留的提高南美白对虾抗病力的马尾藻多糖脂质体纳米制剂，该制剂对南美白对虾具有免疫保护作用，可提高染毒南美白对虾的存活率。
[0004]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:马尾藻多糖脂质体纳米制剂在制备提高南美白对虾抗病力药物方面的应用。
[0005]提高南美白对虾抗病力的马尾藻多糖脂质体纳米制剂，按以下工艺制备:
[0006]<1>按质量比2~8:1准确称取分析纯的大豆卵磷脂和胆固醇，用无水乙醇溶解制成质量浓度为6~18%的类脂溶液；
`[0007]<2>用pH6.0~7.5的磷酸盐缓冲液搅拌溶解马尾藻多糖制成质量浓度为0.5~
1.5%的马尾藻多糖溶液；
[0008]<3> 一边搅拌步骤〈2>所得马尾藻多糖溶液，一边将步骤〈1>所得类脂溶液按体积比2~5:1缓缓地注入其中，继续搅拌I~2小时，挥发除去乙醇得马尾藻多糖脂质体混悬液。
[0009]搅拌置于磁力搅拌机上45~65°C恒温搅拌,搅拌速度为1500~1800r/min。
[0010]注入采用5号注射器针头且保持针头在液面以下。
[0011]本发明的马尾藻多糖脂质体纳米制剂采用乙醇注入法，操作简便，适合大量生产，应用于生产马尾藻多糖脂质体纳米制剂包封率达38%，平均粒径为203nm，且多数在于190~342nm之间，脂质体产品较理想，为今后规模化生产提供了很好的工艺路线，可有效地提高其制剂的药效，保证这种替代抗生素和化学药物饲料添加剂的天然药物高新制剂的市场供应。试验证明，马尾藻多糖脂质体纳米制剂可提高南美白对虾抗病力。饲料中添加马尾藻多糖脂质体纳米制剂，可显著提高南美白对虾的溶菌酶活性，具有免疫促进作用；还能显著提高染毒南美白对虾的存活率，具有较好的保护效果。
【具体实施方式】[0012]马尾藻多糖纳米脂质体的制备、质量评价及毒性观察
[0013]以下分别采用逆相蒸发法和乙醇注入法研究马尾藻多糖脂质体(Sargassumpolysaccharide liposome, SPL)的制备工艺，比较两种方法的优劣和适用性；对其质量进行评价，包括外观形态、粒径及其分布、包封率等；并进行毒性观察，为马尾藻多糖脂质体的开发利用提供一些参考依据，并选取适当的马尾藻多糖浓度作为下一步实验应用的参考标准。
[0014]1、材料与方法
[0015]1.1药品与试剂
[0016]马尾藻多糖，广西大学动科院药理实验室提取。大豆卵磷脂、胆固醇、氯仿、乙醚、无水乙醇、磷酸二氢钾、十二水磷酸氢二钠、氯化钠等均为国产分析纯。
[0017]1.2试剂的配制
[0018]0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.0):准确称取磷酸二氢钾0.54g、十二水磷酸氢二钠2.15g、氯化钠4.5g,加蒸懼水定容至1000mL。
[0019]1.3仪器设备
[0020]AB104-L分析天平(瑞士梅特勒)；RE_52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；SHB-D型微型循环水真空泵(郑州长城仪器厂)；KQ-50B超声波清洗器(昆山市超声波仪器有限公司)；磁力加热搅拌器(常州市华普达教学仪器有限公司)；冷冻超速离心机(SIGMA)；Zetasizer Nano S 激光纳米粒度 分析仪(英国 Malvern instrument lid)。
[0021]1.4逆相蒸发法制备不同浓度的SPL
[0022]按一定比例将大豆磷脂、胆固醇置于圆底烧瓶中，加入氯仿溶解；将圆底烧瓶置于旋转蒸发仪上减压旋转蒸发除氯仿，使瓶壁形成一层均匀的薄膜；放置过夜使氯仿除尽；加入乙醚将膜溶解；然后加入含不同浓度SP的PBS (pH=7.0) (SP分别为0.5%、0.75%、1%);冰水浴超声5min，形成W/0 ;室温减压旋转蒸发30min除去乙醚；最后加入PBS水合，进一步减压旋转蒸发15min脱胶，得脂质体悬浮液。过直径0.45 μ m微孔滤膜，重复操作数次使脂质体大小均匀。同时按以上操作但不加入多糖制备空白脂质体作为空白对照。1.5乙醇注入法制备SPL
[0023]称取一定比例的大豆卵磷脂、胆固醇、马尾藻多糖。将多糖溶于PBS，加入吐温80，沸水浴3min，置于磁力搅拌机上搅拌。将磷脂、胆固醇溶于无水乙醇。用5mL注射器吸取缓慢加入到多糖溶液中，高速搅拌。继续搅拌Ih待乙醇蒸发，即可得到马尾藻多糖脂质体混悬液。同时按以上操作但不加入多糖制备空白脂质体作为空白对照。
[0024]1.6外观及形态观察
[0025]将制备好的马尾藻多糖脂质体密封装入灭菌瓶中，分别放置于常温和4°C冰箱中保存数月。观察其颜色、透光性、流动性、浑浊度。并用透射电镜观察单个脂质体的形态。
[0026]1.7粒径及其分布的测定
[0027]采用激光纳米粒度分析仪测定马尾藻多糖脂质体的粒径及其分布。
[0028]1.8包封率的测定
[0029]采用超速离心法测定SPL的包封率。吸取ImL样品加入到ImLEP管中，4°C，15000r/min离心30min,取ImL上清液加PBS (pH=7.0)定容至IOmL,取ImL稀释后的上清
液按苯酚-硫酸法测吸光度，计算多糖含量W#iS。[0030]吸取ImL样品定容至IOmL,取ImL稀释后的样品加入ImL无水乙醇,镟润震荡Imin破乳，取ImL混合液4°C, 15000r/min离心30min,吸取ImL上清液按苯酹-硫酸法测吸光度，计算多糖含量W,6。
[0031]包封率=(W总-W游离)/W总X 100%
[0032]1.9SPL毒性观察
[0033]取小鼠3只，按5g/kg体重剂量SPL灌胃给药。一次最大灌胃量，小鼠不超过ImL/只。若灌胃量太大，可在24h分成2~3次给药，但合并作为一日剂量计算。观察记录小鼠的一般健康状况，中毒表现和死亡过程。观察一周，对死亡小鼠作剖检，必要时进行病理学检查。
[0034]2、结果与分析
[0035]2.1外观及形态
[0036]制备的马尾藻多糖脂质体颜色呈棕黄色，过滤前较为浑浊，有小块磷脂沉淀。过滤后澄清，透光性好，流动性好。0.45 μ m滤膜过滤的SPL室温、4°C放置2个月未见有沉淀析出，室温放置的样品颜色有变淡。未过滤的SPL放置会出现沉淀析出。通过透射电镜观察可见，马尾藻多糖脂质体为粒径均匀的球状小囊泡。
[0037]2.2粒径及其分布
[0038]马尾藻多糖脂质体粒径范围为9Inm~53Inm,多数存在于190nm~342nm之间，平均粒径为203nm。呈正态分布。
[0039]2.3不同浓度SPL的包封率
[0040]0.5%、0.75%、1.0 % 的 SPL 的包封率分别为 38.6%,35.7%,26.2%。SPL 的包封率随着加多糖的加入量增加而降低。
[0041]2.4SPL毒性观察
[0042]给药后，经过连续7天的观察，小鼠无一死亡且一般状态良好。剖检观察各脏器未见明显的变化。
[0043]3、讨论
[0044]3.1不同方法制备SPL的比较
[0045]逆相蒸发法在制备过程中发生了相的转变，此方法制备的脂质体药物包封率大，有机溶剂除去较为完全，适合包封水溶性药物及生物大分子活性物质。但由于操作过程相对复杂和所需要的仪器的局限性，所以只适用于实验室制备，不适合大规模生产。
[0046]乙醇注入法操作简便，适合大量生产，有机相中磷脂浓度对脂质体的大小影响较小，但有机溶剂和高温会使大分子物质(如蛋白质等)变性或对热敏感的物质灭活，此外制得的脂质体粒径较大，不易均匀，不适合用于静脉注射。
[0047]综合上述因素，在以下试验中，将采用乙醇注入法来大量制备SPL，此方法也有利于今后的应用推广。
[0048]3.2SPL的粒径大小
[0049]粒径的大小直接影响脂质体的释放和生物利用度、脂质体的载药量以及体内分布的靶向性。例如随着纳米球粒径的增大，载药量随之增大，但药物从纳米球中的释放速度减慢。影响脂质体粒径大小的因素主要有:制备方法、药物浓度、搅拌速度等。
[0050]注入法制备的脂质体粒径较大，且分布不均匀；超声分散法制备的脂质体粒径小且分布均匀。本实验采用在逆相蒸发法中加入超声处理，可有效地减小脂质体的粒径，但需要控制好超声的时间，超声时间过长会导致磷脂双分子层膜破裂，药物渗漏，降低包封率，影响药物稳定性。Cesar A.S.Andrade研究超声处理对凝集素Cra脂质体的使红血球活性的影响时发现，超声处理超过250s后，凝集素Cra脂质体的使红血球凝集的活性降低。
[0051]随着药物浓度的增加，脂质体载药量增加，但脂质体的粒径也随之增大，因此需要寻找一个最佳的药物/载体材料比，当比例高时，载体材料浓度相对较低，这一方面会导致脂质体产率降低，另一方面由于脂质体中所载药物的超负荷现象会导致药物在载体表面过分沉积，一旦进入机体内会立即释放，使其在非靶组织部位产生毒副作用。董岸杰在制备紫杉醇纳米囊时，纳米囊的载药量随着紫杉醇投药量的增大而增大，但包封率下降。纳米囊的粒径小于IOOnm,粒径分布比较窄，随着紫杉醇投药量和纳米囊载药量的增大,粒径增大，当载药量大于10%时，粒径变化不大。
[0052]搅拌速度对脂质体的粒径也稍有影响，奉建用乳化聚合法在聚氰基丙烯酸烷基酯纳米囊时，以600r/min及3000r/min的搅拌速率分别得126nm及161nm的平均粒径,原因是增大搅拌速率给微粒提供了更大的动能而促使其聚集。粒径增大的同时粒径分布也变宽。
[0053]3.3包封率的测定
[0054]包封率是评价脂质体质量好坏的重要指标。药物的溶解性、相对分子质量大小、荷电性质及药物浓度等都会影响到脂质体对药物的包封情况，脂溶性和水溶性特别好的药物可包封成较高包封率的脂质体。由于马尾藻多糖为水溶性一般的大分子物质，属于硫酸多糖，所以包封率一般较低，本实验制备的0.5%浓度的SPL包封率为38.6%。由于硫酸多糖相对分子质量大，而且电荷密度较高，因此其脂质体的包封率不如传统的小分子药物，但这已足可以改变硫酸多糖的药动学性质。
[0055]包封率在某种程度上也取决于脂质的化学性质、脂质浓度以及脂质、有机溶剂、缓冲液的比例，有研究表 明，当溶液的水相:酿相等于1:3时,脂质体的包封率最闻。本实验采用卵磷脂:胆固醇为4: 1、多糖加入量为0.5%、水相:醚相为1:3时得到相对较高的包封率。
[0056]此外，温度也是影响包封率的因素之一。温度升高，分子热运动加剧，药物向外层水相扩散速度加快，而且各相液体的粘度降低，减小了药物扩散的阻力，包封率下降；但是，温度过低，则有机溶剂挥发的速度将会减慢，延长了制备时间，也相应延长了药物向外层水相扩散的时间，同样会使得包封率不高。为此，本实验采用在减压条件下室温下挥发有机溶剂，这样既能使有机溶剂以较快速度挥发，又不会影响体系的粘度，并使制备过程温和，减小了药物损失。
[0057]冷冻超速离心法利用游离药物与含药脂质体的重力差异进行分离，测定脂质体包封率操作方便快捷，可使脂质体与游离药物具有较好的分离，但离心过程会使脂质体破裂，导致药物渗漏，影响包封率。增加多糖浓度会降低脂质体的包封率，根据SPL的包封率以及载药量，可能选择加入0.5%SP溶液制备的脂质体作为临床试验应用较为合适。
[0058]马尾藻多糖脂质体纳米制剂对南美白对虾抗病力影响的研究
[0059]一试验目的
[0060]本试验通过观察马尾藻多糖脂质体纳米制剂(SPL)对南美白对虾血淋巴液白蛋白、总蛋白、溶菌酶及酸性磷酸酶的影响，从而了解其对南美白对虾免疫功能的调节作用；观察马尾藻多糖脂质体纳米制剂对南美白对虾人工感染白斑病病毒、桃拉病病毒的抵抗力，评价马尾藻多糖脂质体纳米制剂对南美白对虾抗病力的影响。
[0061]二试验材料
[0062]2.1 药物
[0063]0.5%马尾藻多糖脂质体纳米制剂，由广西大学动物科技学院制备(按实施例1制备)。
[0064]对照药:盐酸左旋咪唑+黄芪多糖可溶性粉，湖南湘大兽药有限公司生产，商品名为:瘟毒清，生产批号:20110680。规格:100g:盐酸左旋咪唑5g+黄芪多糖8g。
[0065]2.2试验虾
[0066]试验用虾取自广西水产研究所南美白对虾企沙养殖基地SPF南美白对虾的幼虾432尾，平均体长为(4.5±0.55) cm，平均体重为(0.69±0.31) g，暂养7天后称初重。
[0067]2.3饲料:对奸基础饲料
[0068]2.4 病毒
[0069]对虾白斑病综合征病毒，桃拉病病毒，由广西壮族自治区水产研究所保存，TCID50=KTfVml。
[0070]三试验方法
[0071]3.1马尾藻多糖脂`质体纳米制剂对南美白对虾免疫功能的影响
[0072]将72尾SPF南美白对虾，分为2组，每组36尾(见表1 )。
[0073]表1SPF对南美白对虾免疫功能的影响分组与处理
[0074]
【权利要求】
1.马尾藻多糖脂质体纳米制剂在制备提高南美白对虾抗病力药物方面的应用。
2.一种提高南美白对虾抗病力的马尾藻多糖脂质体纳米制剂，其特征在于按以下工艺制备: 〈1>按质量比2~8:1准确称取分析纯的大豆卵磷脂和胆固醇，用无水乙醇溶解制成质量浓度为6~18%的类脂溶液； 〈2>用pH6.0~7.5的磷酸盐缓冲液搅拌溶解马尾藻多糖制成质量浓度为0.5~1.5%的马尾藻多糖溶液； <3> 一边搅拌步骤〈2>所得马尾藻多糖溶液，一边将步骤〈1>所得类脂溶液按体积比2~5:1缓缓地注入其中，继续搅拌I~2小时，挥发除去乙醇得马尾藻多糖脂质体混悬液。
3.根据权利要求2所述的纳米制剂，其特征在于:所述搅拌置于磁力搅拌机上45~65°C恒温搅拌，搅拌速度为1500~1800r/min。
4.根据权利要求3所述的纳米制剂，其特征在于:所述注入采用5号注射器针头且保持针头在液 面以下。
【文档编号】A61K9/127GK103845291SQ201410088327
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年3月11日 优先权日:2014年3月11日
【发明者】胡庭俊, 尹丹, 郝祝兵, 钟舒红, 韦现色, 崔月明 申请人:广西大学