含生长因子的椎间盘组织支架及其制备方法
【专利摘要】本发明属于组织工程【技术领域】，具体涉及含生长因子的椎间盘组织支架及其制备方法。本发明要解决的技术问题是为治疗下腰痛提供一种组织工程支架。本发明的技术方案是含生长因子的椎间盘组织支架，为采用同轴静电纺丝技术制备得到的同轴电纺支架；所述的生长因子为TGF-β1。本发明还提供了所述的椎间盘组织支架的制备方法。本发明可用于下腰痛的治疗。
【专利说明】含生长因子的椎间盘组织支架及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于组织工程【技术领域】，具体涉及含生长因子的椎间盘组织支架及其制备 方法。
【背景技术】
[0002] 下腰痛是一种临床常见疾病，严重影响人们的生活质量。研究表明，椎间盘退变及 髓核钙化与下腰痛密切相关。保守治疗只能缓解症状，椎间盘髓核摘除术或脊柱节段融合 内固定等手术虽然能解除神经压迫症状，但术后椎间关节强硬高发及椎间盘突出复发等问 题。目前，生物治疗的方式包括基因治疗，生长因子治疗，细胞和组织工程等。
[0003] 组织工程是把细胞和支架结合起来，对损伤部分进行替代治疗的一种方法。然而， 目前仍面临许多问题，如缺少能够维持种子细胞生长、分化、增殖及基质合成的理想支架。 间充质干细胞是目前应用广泛的一种细胞，但其分化需要一定的物理、化学、生物刺激。生 长因子作为生物刺激的一种经常用于刺激干细胞的增殖和分化。若组织工程支架能长时间 稳定释放生长因子，将会是对细胞的增殖分化起到良好的作用。之前的研究多使用水凝胶 作为承载生长因子的载体，但其缺点有水凝胶内部的细胞容易死亡、水凝胶力学性能差、用 途局限等。静电纺丝技术在1934年由Formalas发明。主要指聚合物熔体或者溶液在高 压静电场作用下形成纤维的过程。目前，静电纺丝已经成为一种用于生产不同功能多聚纳 米纤维的新技术，并已经发展成为一种传递生物活性材料的工具。纳米纤维表面的小孔用 于释放存放在纤维中的药剂。与传统的药物传递系统相比，这个方法极大的增加了作用时 间。这个方法也具有质量小，伤口闭合率高的优越性，从而有效的辅助伤口复原。特别是，含 有血小板源生长因子（PDGF)，血管内皮生长因子（VEGF)和PDGF，以及转化生长因子-beta (TFG-beta)等多种生长因子的纳米纤维的制造已有报道。除了同轴电纺以外，共轴电纺技 术也已经广泛应用。
[0004] 静电纺丝技术在骨科迅速发展，通过静电纺丝技术制成的纳米支架具有纤维直径 小(几十到数百纳米)，孔隙率高，比表面积大，均一性好等优点。同轴电纺因为具有内外双 层结构，克服了单轴静电纺丝时水溶性和脂溶性材料相互难融合的问题。将生长因子作为 静电纺丝支架的一部分，构建促进间充质千细胞向髓核样细胞分化的组织工程支架，有望 成为生物治疗的有效手段。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是为治疗下腰痛提供一种组织工程支架。
[0006] 本发明的技术方案是含生长因子的椎间盘组织支架，为采用同轴静电纺丝装置制 备得到的同轴电纺支架；所述的生长因子为TGF-β 1 ;其中，同轴电纺支架外层溶液为以六 氟异丙醇为溶剂的13?17%g/mL聚乳酸PLGA ;同轴电纺支架内层溶液为13?17%g/mL聚 乙烯醇PVA和3 μ LTGF- β 1 ;其中TGF- β 1溶解于1%的BSA中，其浓度为lng/ μ L。
[0007] 优选的，同轴电纺支架外层溶液为以六氟异丙醇为溶剂的15%g/mL聚乳酸PLGA。
[0008] 优选的，同轴电纺支架内层溶液为15%g/mL聚乙烯醇pVA。
[0009] 本发明还提供了椎间盘组织支架的制备方法，包括如下步骤：
[0010] 步骤1、将聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA溶解于六氟异丙醇hfip中，制成13? 17%g/mLPLGA溶液，即为同轴静电纺丝外层溶液；
[0011] 步骤2、将TGF-β 1用1%牛血清白蛋白BSA稀释为浓度lng/yL ;
[0012] 步骤3、将PVA溶于超纯水中，成为I3?l7%g/mLPVA溶液。
[0013] 步骤4、在2mL15%PVA溶液中加入6 μ Ling/ μ L的TGF-β 1，此为同轴静电纺丝的 内层溶液；
[0014] 步骤5、组装好仪器，针头距离接受装置15cm,电压16?18Κν，注射速度0.2? 0. 4mL/h，内、外层溶液都纺1. 2mL。
[0015] 步骤6、支架完成后，保存于-20°C。
[0016] 优选的，步骤1中PLGA的浓度为15%g/mL。
[0017] 优选的，步骤3中PVA的浓度为15%g/mL。
[0018] 优选的，步骤5中注射速度为0. 3mL/h。
[0019] 本发明组织工程支架纺丝均一性好，具有内外双层结构。该支架具有良好的力学 特性、亲水性，可以长时间稳定释放生长因子TGF-βΙ，促进人间充质干细胞的增殖和向髓 核样细胞的分化。其制备方法简单易行。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1、静电纺丝装置，由高压电源、喷头及给液装置、接受装置构成。高压电源是提 供高达几万伏特的直流电源；喷头为含内外两层的同轴喷头，给液装置为内含配好的溶液 的注射器及固定注射器的注射泵；接收装置为金属接收板，并有导线接地。
[0021]图2、A图对构建的椎间盘组织支架进行扫描电镜观察，B图为纺丝直径分布进行 统计。
[0022] 图3、使用投射电镜观察椎间盘组织支架的纺丝壳-核双层结构。
[0023] 图4、使用高效液相色谱分析法测量椎间盘组织支架TGF- β 1释放。
[0024]图5、对椎间盘组织支架进行了水接触角测试。
[0025]图6、使用ΜΤΤ方法测量人间充质千细胞在椎间盘组织支架表面增殖情况。
[0026] 图7、人间充质干细胞在椎间盘组织支架表面的生长情况。
【具体实施方式】
[0027] 实施例1采用本发明方法制备同椎间盘组织支架
[0028] 步骤1、将聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA)溶解于六氟异丙醇（HFIP)中，制成 15%PLGA溶液，即为同轴静电纺丝外层溶液；
[0029] 步骤2、将TGF-β 1 (Prospec公司）用1%牛血清白蛋白（BSA)稀释为浓度lng/ μ l ；
[0030] 步骤3、将聚醋酸乙烯酯（PVA)溶于超纯水中，成为15%PVA溶液。
[0031] 步骤4、在2mL15%PVA溶液中加入6 μ Llng/μ L的TGF-β 1，此为同轴静电纺丝的 内层溶液；
[0032] 步骤5、如图1组装好仪器，注射器为（LSP02-1B，保定兰格公司，China)，高压 电源为中频直流高压器（RXZGF，上海日行公司，China)，针头距离接受装置15cm，电压 16-18KV，注射速度0. 3mL/h，内、外层溶液都纺1. 2mL。
[0033] 步骤6、支架完成后，保存于-20°C。
[0034] 实施例2对本发明椎间盘组织支架的性能检测
[0035] 1、对构建的椎间盘组织支架进行扫描电镜观察，并对纺丝直径分布进行统计。结 果见图2。扫描电镜结果可见纺丝直径较为均一，大部分都分布在200?500nm范围内。投 射电镜可以明显看到椎间盘组织支架的双层结构。
[0036] 2、使用投射电镜观察椎间盘组织支架的纺丝壳-核双层结构，结果见图3。内层核 层与外层的壳层之间可见明显界限，说明成功得到内外双层壳-核结构的纺丝。
[0037] 3、为了明确椎间盘组织支架缓释TGF-β 1的作用，使用高效液相色谱分析法测量 其释放。具体的，将同轴电纺支架分别置于装有PBS缓冲液的透析袋内，将其放置于37°C的 温育箱内，用处理搅拌器以50rpm的速率搅拌。按照设定好的时间（在第1，2, 3, 7, 14天)， 取出5mL的PBS，同时放入新的PBS缓冲液。释放出TGF-β 1用HPLC/MS(Agilent，USA)测 量。共测量了 1，2, 3, 7, 14天共5个时间点。结果见图4,可见蛋白的释放随着时间不断增 多，具有明显的缓释效果。
[0038] 4、为了 了解椎间盘组织支架表面的亲水性，进行了水接触角测试，将同轴电纺支 架以lcmX2cm的尺寸分别进行裁剪，且注意将内膜朝上平放在玻璃平面上，再用另一面玻 璃进行适量按压，使得样品表面较为平整。然后用接触角测量仪测量接触角，每次用0. 5mL 超纯水检测样品，取统计值分析。结果见图5和表1。在3s，6s，12s，18s分别测量了其接触 角。可见材料表面具有良好的亲水性，且可以预测其表面适合细胞粘附、增殖、生长、分化。 [0039] 表1水接触角测试
[0040]
[0041]
【权利要求】
1. 含生长因子的椎间盘组织支架，其特征在于：为采用同轴静电纺丝装置制备得到的 同轴电纺支架；所述的生长因子为TGF-β 1 ;其中，同轴电纺支架外层溶液为以六氟异丙醇 为溶剂的13?17%g/mL聚乳酸PLGA ;同轴电纺支架内层溶液为13?17%g/mL聚乙烯醇PVA 和3 μ LTGF- β 1 ;其中TGF- β 1溶解于1%的BSA中，其浓度为lng/ μ L。
2. 如权利要求1所述的椎间盘组织支架，其特征在于：同轴电纺支架外层溶液为以六 氟异丙醇为溶剂的15%g/mL聚乳酸PLGA。
3. 如权利要求1或2所述的椎间盘组织支架，其特征在于：同轴电纺支架内层溶液为 15%g/mL聚乙烯醇PVA。
4. 椎间盘组织支架的制备方法，其特征在于：包括如下步骤： 步骤1、将聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA溶解于六氟异丙醇HFIP中，制成13?17%g/ mLPLGA溶液，即为同轴静电纺丝外层溶液； 步骤2、将TGF-β 1用1%牛血清白蛋白BSA稀释为浓度lng/μ L ; 步骤3、将PVA溶于超纯水中，成为13?17%g/mLPVA溶液。 步骤4、在2mL15%PVA溶液中加入6μ Llng/μ L的TGF-β 1，此为同轴静电纺丝的内层 溶液； 步骤5、组装好仪器，针头距离接受装置15cm,电压16?18Κν，注射速度〇· 2?0. 4mL/ h，内、外层溶液都纺1.2mL。 步骤6、支架完成后，保存于-20°C。
5. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤！中PLGA的浓度为15%g/mL。
6. 如权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：步骤3中pVA的浓度为15%g/mL。 7·如权利要求4?6任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤5中注射速度为〇· 3mL/ h〇
【文档编号】A61L27/22GK104189959SQ201410087968
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年3月11日 优先权日:2014年3月11日
【发明者】崔翔, 刘铭汉, 王加旭, 黄博, 向强, 周跃 申请人:中国人民解放军第三军医大学第二附属医院