利用基因敲入和核移植技术在转基因动物生产重组人丁酰胆碱酯酶的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用基因敲入和核移植技术在转基因非人哺乳动物生产重组人丁酰胆碱酯酶的方法，具体地，本发明提供了一种用于乳腺特异表达的供体构建物，所述构建物将人丁酰胆碱酯酶DNA编码序列定点整合于乳腺特异表达蛋白基因位点并成功转染非人哺乳动物胚胎成纤维细胞，幼年和成年体细胞，或胚胎干细胞，利用体细胞核移植技术进行克隆从而获得新的个体，其所携带的人丁酰胆碱酯酶基因能使非人哺乳动物乳腺稳定表达并分泌人丁酰胆碱酯酶全酶或单体。本发明方法所生产的重组蛋白可用于预防和治疗神经毒剂和有机磷化合物中毒，可卡因中毒和琥珀胆碱引起的呼吸暂停，及用于检测和祛除蔬菜瓜果和其他农作物、各种物件层面及土壤的有机磷化合物残留。
【专利说明】利用基因敲入和核移植技术在转基因动物生产重组人丁酰胆碱酯酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物制药【技术领域】，具体地涉及利用基因敲入和体细胞核移植技术在转基因动物乳腺生物反应器平台稳定生产重组人丁酰胆碱酯酶的方法。
【背景技术】
[0002]所谓转基因动物制药即是将药物蛋白基因导入到动物体内，例如牛或奶山羊，然后使药物从乳腺或其它器官中生产出来，通过提纯等工序制成基因工程药品。此法的特点是产量高，成本低，药物生物学活性稳定，高产量，高质量，能耗低，无污染；但技术较复杂，前期投资较高。近年来，由于基因工程技术的不断完善和动物克隆技术的发明，转基因动物制药已成为研发非常活跃的领域。西方发达国家已有三十多年转基因动物制药开发历史，技术已趋成熟。最近，美国GTC公司在羊奶中生产的ATryni> (—种人体抗凝血蛋白)已获欧洲EMEA和FDA批准，进入欧洲和美国市场。这是第一个通过转基因在羊奶中生产的上市药品，对转基因工业界而言具有里程碑意义。中国虽然在此领域的科学研究已取得进展，但工业化则刚刚起步。
[0003]胆碱酯酶是一类参与神经递质传递的酯酶总称，其主要功能是在神经胆碱能突触水解乙酰胆碱。此类突触存在于人类、其他脊椎动物及昆虫的神经系统。当这些突触不断发射信号时，肌肉、腺体和神经元会受到刺激或抑制。神经递质乙酰胆碱的作用是传递这些刺激信号，而胆碱酯酶通过水解乙酰胆碱阻止其信号传递。胆碱酯酶抑制物质如有机磷化合物或氨基甲酸酯类杀 虫剂及药物能阻止乙酰胆碱水解，造成乙酰胆碱堆积，从而引起神经系统过度活跃。人类和其他动物若接触胆碱酯酶抑制物质，取决于其类型和数量，可造成从轻度如抽搐、颤抖等到严重如呼吸麻痹、惊厥等症状。在极端情况下，引起死亡。
[0004]胆碱酯酶可由不同数量的催化和非催化亚基组成。这两种酶都由约600个氨基酸的亚单位组成并糖基化。根据其底物偏好和对选择性抑制剂的敏感性，胆碱酯酶分为两大类。那些优先水解乙酰胆碱酯类如乙酰胆碱的酶，其酶活性对化学抑制剂BW284C51敏感，被称为乙酰胆碱酯酶(AChE)，或乙酰胆碱乙酰水解酶(EC3.1.1.7)。乙酰胆碱酯酶又称真实型，特异型，纯正型，红细胞型，或I型胆碱酯酶，是一种膜结合糖蛋白，并以不同分子形式存在于红细胞、神经末梢、肺、脾和大脑灰质。乙酰胆碱酯酶在体内主要用于水解乙酰胆碱。
[0005]那些优先水解其他类酯如丁酰胆碱的酶，其酶活性对化学抑制剂四异丙酯焦磷酰胺(ISO-OMPA)敏感，被称为丁酰胆碱酯酶(BChE，EC3.1.1.8)。丁酰胆碱酯酶也被称为假性丁酰胆碱酯酶或非特异丁酰胆碱酯酶。丁酰胆碱酯酶优先使用丁酰胆碱和苯甲酰胆碱作为其体外反应底物。该酶存在于哺乳动物血浆、肝、胰、肠粘膜、中枢神经系统白质、平滑肌和心脏。丁酰胆碱酯酶的具体功能尚不明晰，它没有已知的特定自然底物，虽然它也水解乙酰胆碱。一般认为，它是乙酰胆碱酯酶在血液中的备用酶。
[0006]尽管丁酰胆碱酯酶有因阻止有机磷化合物中毒而作为广泛应用药物的潜能，但由于供应受限目前无法广泛使用。由于提供保护所需的1:1化学计量比，需大量丁酰胆碱酯酶进行有效治疗。目前只能从人血浆中提取。远远不能满足各种需求。
[0007]鉴于丁酰胆碱酯酶的重要药用潜力，研究主要集中利用基因工程方法研发和生产。不同于血浆生产酶类，重组丁酰胆碱酯酶传播传染性病原体包括病毒，如丙型肝炎和艾滋病毒的风险要低很多。据报道，重组丁酰胆碱酯酶已在下列系统中表达:大肠杆菌，显微注射爪蟾卵母细胞，体外昆虫细胞系及昆虫幼虫体内，家蚕，以及哺乳动物COS细胞和CHO细胞。然而，许多基因工程生产的丁酰胆碱酯酶只具备很少或没有体内酶活性，这些表达系统不足以产生足够数量可实际应用的丁酰胆碱酯酶。
[0008]此外，虽然有利用转基因山羊奶生产出丁酰胆碱酯酶的研究，但由于转基因山羊是经配子微注射方法而获得，不仅周期长而且转基因效率很低，只有5%左右。由于转基因动物所产重组人丁酰胆碱酯酶为四聚体，二聚体和单体的混合物(PNAS104:13603-13608, 2007)，不利于质量控制和后续加工，因此产业化难度较大。另外，由于重组人丁酰胆碱酯酶编码序列是随机整合于转基因山羊基因组，不能完全克服和解决随机整合点染色体位置效应作用的难题。因此个体间表达并分泌重组人丁酰胆碱酯的水平相差较大，无法得到表达载体所拥有的山羊自身内源性调控元件，如酪蛋白启动子，原有功能的正常体现。虽然绝缘体DNA序列在一些染色体区域可能起到克服位置效应的作用，但要完全克服和解决这一难题，只能将外源基因定点整合至转基因动物基因组。
[0009]综上所述，现有技术中的各种表达或分离纯化系统或者不能生产或分离纯化足够数量具活性的重组人丁酰胆碱酯酶，或者所生产的具活性的重组人丁酰胆碱酯酶产品不均一化，因此本领域迫切需要开发新的稳定、高效、简便、适合大规模生产和应用的制备丁酰胆碱酯酶的方法 。
【发明内容】
[0010]本发明的目的就是提供一种稳定、高效、简便、适合大规模生产和应用的制备丁酰胆碱酯酶的方法。
[0011]本发明的第一方面，提供了一种用于乳腺特异表达的供体构建物，所述构建物从5’至3’，依次包括可操作性连接的式I中所示的元件:
[0012]Al-Bl-C-Dl-El-F (式 I)
[0013]式中，
[0014](i)Al为5’同源臂序列，所述5’同源臂序列选自哺乳动物的乳腺特异表达蛋白基因组序列，所述的乳腺特异表达蛋白包括:乳清酸性蛋白(WAP)，CiSl-酪蛋白，CIS2-酪蛋白，β_酪蛋白，K-酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳清蛋白；
[0015](ii)Bl为剪接接受位点序列；较佳地，所述的剪接接受位点序列为AG)；
[0016](iii)C为含信号肽编码序列和重组蛋白的编码序列，所述重组蛋白编码序列编码丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体(截断型，不形成四聚体)，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白；
[0017](iv)Dl为终止密码子以及位于所述密码子下游的丁酰胆碱酯酶CDNA3’末端UTR序列；
[0018](V)El为位于基因定点整合位点下游的3’同源臂序列，所述的3’同源臂序列选自哺乳动物的乳腺特异表达蛋白基因组序列，所述的乳腺特异表达蛋白包括:乳清酸性蛋白(WAP)，α S1-酪蛋白，aS2_酪蛋白，β-酪蛋白，K-酪蛋白，β-乳球蛋白和a -乳清蛋白；并且所述5’同源臂序列和3’同源臂序列来自同一蛋白的基因组序列，并且用于将外源基因定点整合入所述蛋白基因组序列的内显子I区域；
[0019](Vi)F为抗性基因以及位于抗性基因两侧的Cre — 1xP序列。
[0020]在另一优选例中，所述构建物从5’至3’，依次包括可操作性连接的式Ia中所示的元件还可以是:
[0021]Al-Bl-C-Dl-Ela-Fl (式 Ia)
[0022]式中，
[0023](i)Al为5’同源臂序列，所述5’同源臂序列选自哺乳动物的乳腺特异表达蛋白基因组序列，所述的乳腺特异表达蛋白包括:乳清酸性蛋白(WAP)，CiSl-酪蛋白，CIS2-酪蛋白，β_酪蛋白，K-酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳清蛋白；
[0024](ii)Bl为剪接接受位点序列；较佳地,所述的剪接接受位点序列为AG)；
[0025](iii)C为含信号肽编码序列和重组蛋白的编码序列，所述重组蛋白编码序列编码丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体(截断型，不形成四聚体)，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白； [0026](iv)Dl为终止密码子以及位于所述密码子下游的丁酰胆碱酯酶CDNA3’末端UTR序列；
[0027](V)Ela为抗性基因以及位于抗性基因两侧的Cre — 1xP序列；
[0028](vi)Fl为位于基因定点整合位点下游的3’同源臂序列，所述的3’同源臂序列选自哺乳动物的乳腺特异表达蛋白基因组序列，所述的乳腺特异表达蛋白包括:乳清酸性蛋白(WAP)，α S1-酪蛋白，aS2_酪蛋白，β_酪蛋白，K-酪蛋白，β-乳球蛋白和a -乳清蛋白；并且所述5’同源臂序列和3’同源臂序列来自同一蛋白的基因组序列，并且用于将外源基因定点整合入所述蛋白基因组序列的内显子I区域。
[0029]在另一优选例中，当所述供体构建物导入或整合入哺乳动物细胞后，经核移植使转基因哺乳动物乳腺表达并分泌丁酰胆碱酯酶全酶、或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。
[0030]在另一优选例中，所述的信号肽编码序列提供表达丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白分泌的信号肽。
[0031]在另一优选例中，所述的信号肽编码序列选自下组:乳清酸性蛋白(WAP)，a S1-酪蛋白，aS2_酪蛋白，β-酪蛋白，K-酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳清蛋白。
[0032]在另一优选例中，所述的信号肽编码序列选自下组:丁酰胆碱酯酶，血清白蛋白。
[0033]本发明的第二方面，提供了一种用于乳腺特异表达的供体构建物所述构建物从5’至3’，依次包括可操作性连接的式II中所示的元件:
[0034]A2-B2-C-D2-E2-F (式 II)
[0035]式中，
[0036](i)A2为5’同源臂序列，所述5’同源臂序列选自哺乳动物的乳腺特异表达蛋白基因组序列，所述的乳腺特异表达蛋白包括:乳清酸性蛋白(WAP)，a S1-酪蛋白，CIS2-酪蛋白，β_酪蛋白，K-酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳清蛋白；[0037](ii)B2为连接肽的编码序列，所述的连接肽为2A多肽或其衍生多肽；
[0038]在另一优选例中，所述的2A衍生多肽为N端含RKRR的2A多肽；
[0039](iii)C为含信号肽编码序列和重组蛋白的编码序列，所述重组蛋白编码序列编码丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体(截断型，不形成四聚体)，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白；
[0040](iv)D2为终止密码子或无；
[0041](v)E2为位于基因定点整合位点下游的3’同源臂序列，所述的3’同源臂序列选自哺乳动物的乳腺 特异表达蛋白基因组序列，所述的乳腺特异表达蛋白包括:乳清酸性蛋白(WAP)，α S1-酪蛋白，aS2_酪蛋白，β-酪蛋白，K-酪蛋白，β-乳球蛋白和a -乳清蛋白；并且所述5’同源臂序列和3’同源臂序列来自同一蛋白的基因组序列，并且用于将外源基因定点整合入所述蛋白基因组序列的终止密码子之前；
[0042](Vi)F为抗性基因以及位于抗性基因两侧的Cre — 1xP序列。
[0043]在另一优选例中，所述构建物从5’至3’，依次包括可操作性连接的式IIa中所示的元件:
[0044]A2-B2-C-D2-E2a-F2 (式 IIa)
[0045]式中，
[0046](i)A2为5’同源臂序列，所述5’同源臂序列选自哺乳动物的乳腺特异表达蛋白基因组序列，所述的乳腺特异表达蛋白包括:乳清酸性蛋白(WAP)，CiSl-酪蛋白，CIS2-酪蛋白，β_酪蛋白，K-酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳清蛋白；
[0047](ii)B2为连接肽的编码序列，所述的连接肽为2A多肽或其衍生多肽；
[0048]在另一优选例中，所述的2A衍生多肽为N端含RKRR的2A多肽；
[0049](iii)C为含信号肽编码序列和重组蛋白的编码序列，所述重组蛋白编码序列编码丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体(截断型，不形成四聚体)，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白；
[0050](iv)D2为终止密码子或无；
[0051](v)E2a为抗性基因以及位于抗性基因两侧的Cre — 1xP序列；
[0052](vi) F2为位于基因定点整合位点下游的3’同源臂序列，所述的3’同源臂序列选自哺乳动物的乳腺特异表达蛋白基因组序列，所述的乳腺特异表达蛋白包括:乳清酸性蛋白(WAP)，α S1-酪蛋白，aS2_酪蛋白，β_酪蛋白，K-酪蛋白，β-乳球蛋白和a -乳清蛋白；并且所述5’同源臂序列和3’同源臂序列来自同一蛋白的基因组序列，并且用于将外源基因定点整合入所述蛋白基因组序列的终止密码子之前。
[0053]在另一优选例中，所述的定点整合是in-frame整合(不引入移码突变)。
[0054]在另一优选例中，当定点整合位点刚好位于所述蛋白基因组序列的终止密码子之前从而保留该终止密码子时，所述的D2为无。
[0055]在另一优选例中，当所述构建物导入或整合入哺乳动物细胞后，经核移植使转基因哺乳动物乳腺表达并分泌丁酰胆碱酯酶全酶、或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。
[0056]在另一优选例中，所述的信号肽编码序列提供表达丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白分泌的信号肽。[0057]在另一优选例中，所述的信号肽编码序列选自下组:乳清酸性蛋白(WAP)，α S1-酪蛋白，aS2_酪蛋白，β-酪蛋白，K-酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳清蛋白。
[0058]在另一优选例中，所述的信号肽编码序列选自下组:丁酰胆碱酯酶，血清白蛋白。
[0059]在另一优选例中，所述的丁酰胆碱酯酶单体是缺失了野生型BChE的C末端40个氨基酸残基的丁酰胆碱酯酶，即delC40-BChE。
[0060]在另一优选例中，所述的丁酰胆碱酯酶或其融合蛋白选自下组:
[0061](i)氨基酸序列如SEQ ID N0.:1所示的重组人丁酰胆碱酯酶；
[0062](ii)氨基酸序列如SEQ ID N0.:2所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体；
[0063](iii)氨基酸序列如SEQ ID N0.:3所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。
[0064]在另一优选例中，所述的重组蛋白编码序列选自下组:
[0065](i)核苷酸序列如SEQ ID N0.: 4所示的重组人丁酰胆碱酯酶编码DNA序列；
[0066]( ii)核苷酸序列如SEQ ID N0.: 5所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体编码DNA序列；
[0067](iii)核苷酸序列如SEQ ID N0.:6所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白编码DNA序列。
[0068]本发明的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第一方面或第二方面所述的构建物。
[0069]本发明的第四方面，提供了一种用于定点整合的“构建物一载体”组合，所述的组合包括(a)本发明第一方面或第二方面所述的构建物；和(b)辅助进行基因敲入的TALEN载体，所述的TALEN载体表达特异性识别整合位点的TALEN酶和对整合位点进行切割的FokI 酶。
[0070]本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述细胞中含有本发明第三方面所述的载体或基因组中整合有本发明第一或第二方面所述的构建物。
[0071]在另一优选例中，所述的宿主细胞用本发明第四方面所述的“构建物一载体”组合共同转染后，还从基因组中敲除所述F、Ela或E2a中的抗性基因。
[0072]在另一优选例中，所述的敲除是通过Cre酶处理。
[0073]在另一优选例中，所述的宿主细胞是哺乳动物细胞(非生殖细胞)，更佳地选自山羊、绵羊、牛、兔、啮齿动物(大鼠、小鼠)。
[0074]在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组:乳腺上皮(MAC-T)细胞，胚胎成纤维细胞，体细胞，胚胎干细胞，或胚胎新生细胞。
[0075]在另一优选例中，所述的体细胞为成年或幼年细胞。
[0076]本发明的第六方面，提供了一种制备转基因非人哺乳动物的方法，包括步骤:
[0077](i)应用如本发明第五方面提供的宿主细胞作为供体细胞转入去核卵母细胞，从而在体外形成胚胎；
[0078](ii)将上一步骤的胚胎转入雌性哺乳动物代孕体，从而制得转基因非人哺乳动物；
[0079]其中，所述的细胞、卵母细胞和雌性哺乳动物属于同一物种。
[0080]在另一优选例中，所述的转基因非人哺乳动物为雌性。
[0081]在另一优选例中，相对于整合位点所对应的乳腺特异表达蛋白而言，所述的转基因非人哺乳动物所分泌的乳汁中所含的该乳腺特异表达蛋白仍为野生型。
[0082]在另一优选例中，所述的转基因非人哺乳动物所分泌的乳汁中含有的乳腺特异表达蛋白为野生型(当2A衍生多肽为N端含RKRR的2A多肽时，可导致该衍生多肽被完全切除，从而形成野生型乳腺特异表达蛋白)。
[0083]本发明的第七方面，提供了一种制备丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白的方法，包括步骤:
[0084](i)饲养雌性的、如本发明第六方面所述方法所制备的转基因非人哺乳动物，从而使所述动物在泌乳期分泌含丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白的乳汁；和
[0085](ii)从所述乳汁中分离所述的丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。
[0086]本发明的第八方面，提供了一种乳汁原料，所述乳汁由雌性的、如本发明第六方面所述方法所制备的转基因非人哺乳动物所分泌，并且所述乳汁中含有重组的丁酰胆碱酯酶单体或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白，其中所述乳汁中丁酰胆碱酯酶基本上以单体形式存在。
[0087]在另一优选例中，所述的乳汁中含有的乳腺特异表达蛋白为野生型。
[0088]本发明的第九方 面，提供了一种分离或纯化的重组蛋白，所述重组蛋白选自丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白，并且所述的重组蛋白是用本发明第七方面所述方法制备的。
[0089]本发明第十方面，提供了一种制造药物组合物的方法，该方法包括步骤:
[0090]将(i)本发明第九方面所述的分离或纯化的丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白，与(ii)药学上可接受的载体或赋形剂混合，从而形成药物组合物。
[0091]本发明第十一方面，提供了本发明第九方面所述的重组蛋白的用途，用于(i)制备预防和/或治疗神经毒剂和有机磷化合物中毒的药物；(ii)制备治疗手术后琥珀酰胆碱诱导的睡眠呼吸暂停的药物；(iii)制备治疗可卡因中毒的药物。
[0092]根据本发明方法所产生的重组人丁酰胆碱酯酶，丁酰胆碱酯酶单体和丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白氨基酸序列分别见SEQ ID N0.:1、2和3。根据本发明方法所产生的重组人丁酰胆碱酯酶，丁酰胆碱酯酶单体和丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白编码DNA序列分别见SEQ ID N0.:4、5和6。
[0093]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0094]图1A显示了本发明一个实例中山羊β_酪蛋白基因内显子I敲入供体构建物示意图。SA-BChE，具剪接接受位点的BChE编码序列；图1B为载体示意图；图1C为载体经Notl酶切后的电泳图(1%琼脂糖)，其中I列为酶切消化载体，2为DNA分子量标记。
[0095]图2A显示了本发明一个实例中山羊酪蛋白基因外显子8敲入供体构建物示意图，2A-BChE，2A多肽-BChE编码序列；图2B显示了 2A_BChE β -酪蛋白基因敲入供体载体示意图。
[0096]图3Α显示了本发明一个实例中山羊β-酪蛋白基因内显子I敲入TALEN核酸酶载体示意图；图8显示了载体经酶切后的电泳图(1%琼脂糖)，其中I列为DNA分子量标记；2 列为 TALEN-R BamHI+Hindlll 双切酶；3 列为 TALEN-R EcoRI+Notl 双切酶；4 列为TALEN-LBamHI+Hindlll 双切酶；5 列为 TALEN-L EcoRI+Notl 双切酶。
[0097]图4显示经电转染后的GFP阳性山羊乳腺上皮细胞。含GFP质粒经电穿孔转染山羊乳腺上皮细胞(200X )，48小时后在光学显微镜(A)和荧光显微镜(B)下观察。
[0098]图5显示了本发明一个实例中山羊β_酪 蛋白基因内显子I敲入供体构建物在TALEN载体帮助下整合于内显子I示意图。SA-BChE，具剪接接受位点的BChE编码序列。
[0099]图6显示了本发明一个实例中山羊酪蛋白基因外显子8敲入供体构建物在TALEN载体帮助下整合于外显子8示意图。2A-BChE，2A多肽-BChE编码序列。
[0100]图7显示了本发明一个实例中从羊奶纯化的丁酰胆碱酯酶变性银染SDS-电泳图。1，非转基因山羊奶；2，转基因山羊奶；3，人丁酰胆碱酯酶单体阳性对照；4，从羊奶纯化的丁酰胆碱酯酶。
[0101]发明详述
[0102]本发明人经过广泛而深入的研究，利用乳腺特异表达蛋白基因组序列，采用特定的转基因构建物，从而在不影响转基因非人哺乳动物正常表达所述乳腺特异表达蛋白的前提下，首次成功地在乳腺中实现丁酰胆碱酯酶的特异性稳定高效表达。在此基础上完成了本发明。
[0103]具体地，本发明人利用非人哺乳动物乳腺特异表达蛋白DNA调控序列和3’末端序列，构建乳腺特异表达蛋白基因敲入供体构建物，将人丁酰胆碱酯酶DNA编码序列定点整合于该乳腺特异表达蛋白基因位点。所述位点包括(a)内含子I区域或(b)终止密码子之前区域；优选的，所述位点包括(a)内含子I区域或(b)最后一个外显子编码序列与终止密码子之间的区域。在载体的3’末端亦连接了 NEO抗性基因和Cre-LoxP序列，用于细胞转染筛选和NEO抗性基因序列的切除。本发明使用该基因敲入供体构建物和TALEN载体共同转染非人哺乳动物胚胎成纤维细胞，幼年和成年体细胞，或胚胎干细胞，筛选同源重组的阳性细胞作为供体，利用体细胞核移植技术进行克隆从而获得新的个体，其所携带的人丁酰胆碱酯酶基因能在乳腺特异表达蛋白DNA调控序列指导下在非人哺乳动物乳腺稳定表达并分泌人丁酰胆碱酯酶全酶或单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。本发明方法不仅转化效率高、生产周期短，而且能稳定高效生产全酶和均一单体产品，易于进行质量控制和后续加工，因此特别适合大规模产业化应用。在此基础上完成了本发明。应用本发明方法所生产的重组蛋白可用于预防和治疗神经毒剂和有机磷化合物中毒，可卡因中毒和琥珀胆碱引起的呼吸暂停，及用于检测和祛除蔬菜瓜果和其他农作物、各种物件层面及土壤的有机磷化合物残留。
[0104]1.丁酰胆碱酯酶
[0105]如本文所用，“丁酰胆碱酯酶”指用本发明转基因动物乳腺生物反应器平台稳定大规模生产出的重组人丁酰胆碱酯酶。丁酰胆碱酯酶包括丁酰胆碱酯酶及同工酶，或衍生物，或变异体，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体与其他蛋白(如白蛋白)的融合蛋白。
[0106]可用于本发明的丁酰胆碱酯酶没有特别限制，可以是来源于任何生物体的丁酰胆碱酯酶，优选来自于哺乳动物(如灵长类动物)，更佳地来源于人。此外，应理解，“丁酰胆碱酯酶”包括野生型或突变型(包括截断型)的丁酰胆碱酯酶，只要该突变型丁酰胆碱酯酶保留或保持了野生型丁酰胆碱酯酶的解毒活性。
[0107]人丁酰胆碱酯酶cDNA序列已被克隆(美国专利号5215909)。此外，美国专利号5248604揭示了人类乙酰胆碱酯酶的非糖基化的变异体。野生型人类丁酰胆碱酯酶的氨基酸序列，以及几个丁酰胆碱酯酶变异体单一氨基酸的变化，在美国专利号6001625也有披露。
[0108]在本发明中，特别优选的是截断型丁酰胆碱酯酶，尤其是去除了 C末端的多个Iys残基所获得的BCHE，例如截断的、不含C末端最后40个氨基酸残基的丁酰胆碱酯酶(简称为“delC40-BChE”)。因为3个赖氨酸残基处于被删除的40个残基中，生产出的规格一致的丁酰胆碱酯酶单体可增加下游化学过程如单体聚乙二醇化处理的有效性。
[0109]实验表明，截断的delC40-BChE显示与原酶具同样催化性能。
[0110]另一种优选方式是截断型丁酰胆碱酯酶与其他蛋白(如白蛋白)形成的融合蛋白。
[0111]本发明蛋白由于成分均一，因此特别适合进行后加工或修饰，以便获得改善的性能，其中包括(但并不限 于):聚乙二醇修饰等。
[0112]聚乙二醇修饰通常能改善重组蛋白药代动力学和毒性性能。多肽或蛋白吸附亲水性PEG分子后，能提高水溶性并形成一个屏障，以防止酶降解、肾脏清除、与细胞表面蛋白发生相互作用和形成中和抗体，从而延长多肽或蛋白的半衰期。
[0113]本发明生产的重组丁酰胆碱酯酶，可用于治疗和/或预防有机磷农药中毒，神经毒气中毒，可卡因中毒和琥珀胆碱引起的呼吸暂停，及用于水解蔬菜瓜果和其他农作物、各种物件层面及土壤的有机磷农药残留。
[0114]2.丁酰胆碱酯酶选择
[0115]丁酰胆碱酯酶正常情况下形成球状四聚体，分子量约为340kDa。该形式最稳定，首选用于治疗目的。野生型，变异体，和人工丁酰胆碱酯酶可通过根据本发明的转基因哺乳动物而产生。由此产生的丁酰胆碱酯酶具有中和和/或水解有机磷农药，毒气，琥珀酰胆碱，或可卡因的能力。
[0116]根据本发明产生的丁酰胆碱酯酶所包含的氨基酸序列与发现的哺乳动物丁酰胆碱酯酶序列最好基本相同，更好与人丁酰胆碱酯酶序列基本相同。本发明所生产的丁酰胆碱酯酶可为四聚体，三聚体，二聚体，或单体。本发明所产生的丁酰胆碱酯酶最好具有与自然人丁酰胆碱酯酶基本类似的糖基化属性。根据本发明生产的丁酰胆碱酯酶最好与人血清白蛋白融合以增加其血浆半衰期。
[0117]I).四聚体丁酰胆碱酯酶
[0118]根据本发明产生的丁酰胆碱酯酶最好是四聚体形式。该形式更稳定，并具有较长的血浆半衰期，从而增加其疗效。丁酰胆碱酯酶在CHO细胞的重组表达被发现不是以更稳定的四聚体形式存在，而是包括约55% 二聚体，10%-30%四聚体和15-40%单体(Biochem J327:747-757，1997)。有研究表明，富含脯氨酸的胶原尾部蛋白的N-末端氨基酸序列可将乙酰胆碱酯酶组装成四聚体(J Biol Chem272:3016-3021, 1997 ；J BiolChem272:22840-22847,1997)。因此，为了提高根据本发明所产生的丁酰胆碱酯酶的四聚体含量，编码丁酰胆碱酯酶的DNA序列可包含富含脯氨酸附属区域(PRAD)，该区域帮助组装重组丁酰胆碱酯酶亚单位(例如，单体，二聚体和三聚体)从而形成四聚体。该区域最好包括至少6个残基，后跟至少10个脯氨酸残基。一个在本发明中PRAD的实例包括下列氨基酸序列Glu-Ser-Thr- (Gly) 3- (Pro) 10。该PRAD可能被包括在一个编码PRAD和丁酰胆碱酯酶的双顺反子表达构建体，或在不同的表达构建体。此外，PRAD编码可定向附于丁酰胆碱酯酶编码。本发明还包括在重组丁酰胆碱酯酶混合物中添加合成的(例如，聚脯氨酸)或天然存在的PRAD，以诱导丁酰胆碱酯酶重排为四聚体。
[0119]2).非四聚体丁酰胆碱酯酶
[0120]虽然四聚体丁酰胆碱酯酶是有机磷中毒预防和治疗的最有效形式，本发明也包括已表明底物活性的其他形式的丁酰胆碱酯酶(例如，单体，二聚体和三聚体)。然而，非四聚体形式丁酰胆碱酯酶在体内不太稳定的观察不能排除它们在体内应用的有效性。非四聚体较高剂量或更频繁在体内给药可以导致满意的治疗结果。
[0121]丁酰胆碱酯酶非四聚体可用于许多并不需要在体内给药的场合，如清理用于存储有机磷化合物的场地，以及军事设备有机磷的去污。作为体外应用，这些非四聚体可制成海绵，喷雾剂，清洁溶液或其他材料用于清洁设备和人员。非四聚体也可应用于已暴露于有机磷化合物的人类患者的皮肤和外衣。非四聚体也可以作为障碍物和密封剂用于化学战中军事服装和防毒面具的接缝和关闭处。 [0122]此外，生产规格一致的丁酰胆碱酯酶单体可增加下游化学过程如单体聚乙二醇化的有效性。聚乙二醇修饰通常能改善重组蛋白药代动力学和毒性性能，从而延长重组蛋白的半衰期。
[0123]3).产生编码突变体丁酰胆碱酯酶的核酸序列
[0124]野生型人丁酰胆碱酯酶氨基酸序列载于编号为6001625的美国专利，该专利还公开了在117位由组氨酸取代甘氨酸残基(定义为G117H)的突变体丁酰胆碱酯酶。该突变体丁酰胆碱酯酶已被证明对由有机磷化合物引起的失活特别耐受(Biochemistry36:786-795，1997)。许多在本领域已知的方法，如PCR，位点定向体外诱变技术，包括连接子插入，嵌套删除，连接子扫描，和寡核苷酸介导的诱变等，可用于在编码丁酰胆碱酯酶核酸序列引入突变。这类突变型丁酰胆碱酯酶，其催化性能，温度分布，稳定性，循环时间和与可卡因或其他底物及/或特定的有机磷化合物的亲和性可发生改变；其四聚体，二聚体或单体形成可增加或减少；或其它所需功能发生改变。在本发明中，可应用这些编码突变型丁酰胆碱酯酶的核酸序列。
[0125]一种优选的方法，如核酸序列或DNA的“混洗”(shuffling)，可产生重组编码突变型丁酰胆碱酯酶核酸序列的资料库，用于产生和识别突变型丁酰胆碱酯酶核酸序列。将所获资料库在一个合适的宿主细胞系表达以筛选和生产具有所需特性的突变型丁酰胆碱酯酶。
[0126]另一种优选的方法，如利用计算机模型进行分子动力学模拟(PNAS102:16656-16661，2005)，可用于模拟能更有效水解有机磷化合物的丁酰胆碱酯酶蛋白结构稳定优化环境，从而发现比野生型丁酰胆碱酯酶更有效催化有机磷化合物的突变型丁酰胆碱酯酶。
[0127]4).自然存在的丁酰胆碱酯酶变异体
[0128]丁酰胆碱酯酶编码基因在人类有四个主要的等位基因形式和其他25个与遗传缺陷有关的形式(见表1)。四个主要的等位基因形式为Eu，Ea, Ef和Es。Eu为野生具全功能的等位基因，含表型EuEu或UU。Ea等位基因被称为非典型丁酰胆碱酯酶，含纯合子表型(EaEa=AA)的人血清对大多数酶底物只有微弱反应，并显示对地布卡因抑制酶活性抵抗力增加。Ef等位基因也产生较弱酶活性，但呈现对氟化物抑制抵抗力增加。Es与缺乏酶活性(沉默)有关。
[0129]某些人群携带非典型丁酰胆碱酯酶编码基因，他们能正常水解乙酰胆碱，但不能水解一种常用麻醉剂，如琥珀酰胆碱。这个问题常见于一种非典型变异体Es，其中3-6%的白人人口为杂合子，约0.05%为 纯合子。另一个变型体，El，导致纯合子血清丁酰胆碱酯酶催化活性完全缺失。携带非典型或沉默丁酰胆碱酯酶编码基因人群手术后可能发生呼吸暂停。因此，该类人群服用重组丁酰胆碱酯酶可减轻或防止长时间手术后呼吸暂停。
[0130]表1.人丁酰胆碱酯酶表型结构基础
[0131]
【权利要求】
1.一种用于乳腺特异表达的供体构建物，其特征在于，所述构建物从5’至3’，依次包括可操作性连接的式I中所示的元件: Al-Bl-C-Dl-El-F (式 I) 式中， (i)Al为5’同源臂序列，所述5’同源臂序列选自哺乳动物的乳腺特异表达蛋白基因组序列，所述的乳腺特异表达蛋白包括:乳清酸性蛋白(WAP)，α S1-酪蛋白，a S2_酪蛋白，β_酪蛋白，K-酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳清蛋白； (?)Β1为剪接接受位点序列； (iii)C为含信号肽编码序列和重组蛋白的编码序列，所述重组蛋白编码序列编码丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体(截断型，不形成四聚体)，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白； (iv)Dl为终止密码子以及位于所述密码子下游的丁酰胆碱酯酶cDNA3’末端UTR序列； (V)El为位于基因定点整合位点下游的3’同源臂序列，所述的3’同源臂序列选自哺乳动物的乳腺特异表达蛋白基因组序列，所述的乳腺特异表达蛋白包括:乳清酸性蛋白(WAP), α S1-酪蛋白，aS2_酪蛋白，β-酪蛋白，K-酪蛋白，β-乳球蛋白和a -乳清蛋白；并且所述5’同源臂序列和3’同源臂序列来自同一蛋白的基因组序列，并且用于将外源基因定点整合入所述蛋白基因组序列的内显子I区域； (Vi)F为抗性基因以及位于抗性基因两侧的Cre — 1xP序列。
2.一种用于乳腺特异表达的供体构建物，其特征在于，所述构建物从5’至3’，依次包括可操作性连接的式II中所示的元件: A2-B2-C-D2-E2-F (式 II) 式中， (i)A2为5’同源臂序列，所述5’同源臂序列选自哺乳动物的乳腺特异表达蛋白基因组序列，所述的乳腺特异表达蛋白包括:乳清酸性蛋白(WAP)，a S1-酪蛋白，a S2_酪蛋白，β_酪蛋白，K-酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳清蛋白； (?)Β2为连接肽的编码序列，所述的连接肽为2A多肽或其衍生多肽； (iii)C为含信号肽编码序列和重组蛋白的编码序列，所述重组蛋白编码序列编码丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体(截断型，不形成四聚体)，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白； (iv)D2为终止密码子或无； (v)E2为位于基因定点整合位点下游的3’同源臂序列，所述的3’同源臂序列选自哺乳动物的乳腺特异表达蛋白基因组序列，包括:乳清酸性蛋白(WAP)，a S1-酪蛋白，aS2_酪蛋白，β-酪蛋白，K-酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳清蛋白；并且所述5’同源臂序列和3’同源臂序列来自同一蛋白的基因组序列，并且用于将外源基因定点整合入所述蛋白基因组序列的终止密码子之前； (Vi)F为抗性基因以及位于抗性基因两侧的Cre — 1xP序列。
3.如权利要求1或2所述的构建物，其特征在于，所述的丁酰胆碱酯酶单体是缺失了野生型BChE的C末端40个氨基酸残基的丁酰胆碱酯酶，即delC40-BChE。
4.如权利要求1或2所述的构建物，其特征在于，所述的丁酰胆碱酯酶或其融合蛋白选自下组: (i)氨基酸序列如SEQ ID N0.:1所示的重组人丁酰胆碱酯酶； (ii)氨基酸序列如SEQ ID N0.: 2所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体； (iii)氨基酸序列如SEQ ID N0.:3所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。
5.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求1或2所述的构建物。
6.一种用于定点整合的“构建物一载体”组合，其特征在于，所述的组合包括(a)权利要求I或2所述的构建物；和(b)辅助进行基因敲入的TALEN载体，所述的TALEN载体表达特异性识别整合位点的TALEN酶和对整合位点进行切割的FokI酶。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞中含有权利要求5所述的载体或基因组中整合有权利要求1或2所述的构建物。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞选自下组:乳腺上皮细胞，胚胎成纤维细胞，体细胞，胚胎干细胞，或胚胎新生细胞。
9.一种制备转基因非人哺乳动物的方法，其特征在于，包括步骤: (i)应用如权利要求7所述宿主细胞作为供体细胞转入去核卵母细胞，从而在体外形成胚胎； (ii)将上一步骤的胚胎转入雌性哺乳动物代孕体，从而制得转基因非人哺乳动物； 其中，所述的细胞、卵母细胞和雌性哺乳动物属于同一物种。
10.一种制备丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白的方法，其特征在于，包括步骤: (i)饲养雌性的、如权利要求9所述方法所制备的转基因非人哺乳动物，从而使所述动物在泌乳期分泌含丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白的乳汁；和 (ii)从所述乳汁中分离所述的丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。
11.一种乳汁原料，其特征在于，所述乳汁由雌性的、如权利要求9所述方法所制备的转基因非人哺乳动物所分泌，并且所述乳汁中含有重组的丁酰胆碱酯酶单体或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白，其中所述乳汁中丁酰胆碱酯酶基本上以单体形式存在。
12.—种分离或纯化的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白选自丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白，并且所述的重组蛋白是用权利要求10所述方法制备的。
13.—种制造药物组合物的方法，其特征在于，该方法包括步骤: 将(i)权利要求12所述的分离或纯化的丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白，与(ii)药学上可接受的载体或赋形剂混合，从而形成药物组合物。
14.权利要求12所述的重组蛋白的用途，其特征在于，用于(i)制备预防和/或治疗神经毒剂和有机磷化合物中毒的药物；(ii)制备治疗手术后琥珀酰胆碱诱导的睡眠呼吸暂停的药物；(iii)制备治疗可卡因中毒的药物。
【文档编号】A61P39/02GK103966245SQ201410044003
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年1月29日 优先权日:2013年2月4日
【发明者】黄跃进 申请人:南京杰蒙生物技术有限公司