抑制晚期内皮祖细胞功能的方法
【专利摘要】本发明公开了一种抑制晚期内皮祖细胞功能的方法，该方法采用聚乳酸防粘连膜。与现有的相比，本发明保护的方法可以抑制晚期内皮祖细胞的增殖、粘附、迁移或成血管功能，减少新生血管的形成，从而预防感染或手术后永久性粘连发生。
【专利说明】抑制晚期内皮祖细胞功能的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种抑制晚期内皮祖细胞功能的方法、一种减少新生血管的形成的方法以及一种模拟预防感染或手术后永久性粘连发生的方法。
【背景技术】
[0002]感染或手术易引起粘连，粘连的过程相对较为复杂，除受到纤维蛋白溶解机制失调的影响外，各种细胞因素和生长因子等也对粘连的形成产生一定的影响。研究表明，术后粘连如持续3天未能溶解，则有成纤维细胞增生，伴随新生毛细血管长入其中，在相互接触的组织间形成永久性纤维性粘连。
[0003]现有的关于粘连的研究基本上集中在成纤维细胞，但新生血管的生成是永久性粘连形成的一个重要过程。现有的研究显示，内皮祖细胞(endothelial progenitorcells, EPCs)，特别是晚期EPCs，具有和成熟血管内皮细胞相似的特性，在一定条件下，能在组织损伤部位、机体缺血区及肉芽形成过程中形成新生血管。
[0004]术后粘连是外科手术中亟待解决的难题，由于组织的创伤，结缔组织纤维与相邻的器官或组织结合在一起，从而形成异常结构，造成关节活动受限或畸形、粘连性肠梗阻、不孕症及盆腔炎症等严重的术后并发症。受损组织和与其相接触的脏器间形成的暂时性纤维蛋白性粘连，正常情况下可被间皮及间皮下毛细血管内存在的纤维蛋白裂解酶所溶解，但这些粘连如持续3天未能溶解，则有成纤维细胞增生，伴随新生毛细血管长入其中，在相互接触的组织间形成永久性纤维性粘连。
[0005]目前临床上使用的防粘连膜壳聚糖，其缺点在于壳聚糖防粘连膜材料活性保持时间较短。
【发明内容】
[0006]本发明中，聚乳酸防粘连膜购自广州市弘健生物医用制品科技有限公司；SD大鼠(体重100-150g，雌雄不限)购自中国人民解放军第八十九医院实验动物中心)；EGM-2培养基购自美国(Invitrogen,);胎牛血清(0.25%胰蛋白酶)购自美国(HyClone);纤维粘连蛋白(Fibronectin, FN)购自德国(Roche);CCK_8 购自日本(Dojindo) ；Matrigel 胶，AnnexinV/PI凋亡试剂购自美国(BD) ;β-半乳糖苷酶试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司；Boyden小室购自江苏海门麒麟医用仪器厂；酶标仪(Bio-Rad Laboratories)购自美国；C02培养箱购自美国(Thermo);荧光显微镜购自德国(Leica);流式细胞仪购自美国(BD FACSCaliburX
[0007]本发明的目的之一就在于提供一种抑制晚期内皮祖细胞功能的方法。
[0008]技术方案是:一种抑制晚期内皮祖细胞功能的方法，该方法采用聚乳酸防粘连膜。
[0009]作为优选，所述晚期内皮祖细胞功能为增殖、粘附、迁移或/和成血管功能。
[0010]本发明的目的之二在于提 供一种减少新生血管的形成的方法。
[0011]技术方案是:一种减少新生血管的形成的方法，该方法采用上述方法减少新生血管的形成。
[0012]本发明的目的之三在于提供一种预防感染或手术后永久性粘连发生的模拟方法。
[0013]技术方案是:一种预防感染或手术后永久性粘连发生的模拟方法，该方法包括:
[0014]大鼠骨髓EPCs的分离培养和鉴定；
[0015]用胰蛋白酶消化、完全EGM-2培养基重悬制成细胞悬液，接种于六孔板中，六孔板孔中预先放入聚乳酸防粘连膜膜片，置于培养箱中，每隔3天换一次液。
[0016]作为优选，所述大鼠骨髓EPCs的分离培养和鉴定为采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓单核细胞，以完全EGM-2培养液重悬细胞，将其接种于预先经FN打底的培养瓶中，置37°C含5%C02的培养箱中；4天后更换培养液，以后每隔3天换一次液；待细胞生长到80%左右时，用0.25%胰蛋白酶按1:1比例传代；以传至第三代的EPCs，即晚期EPCs为靶细胞，细胞行Dil-ac-LDL及FITC-UEA-1染色，双染阳性，流式细胞术检测VEGFR2、vWF、CD31及VE-Cadherin等内皮细胞标记的表达。
[0017]作为优选，所述聚乳酸防粘连膜膜片为无菌的聚乳酸防粘连膜膜片。
[0018]作为优选，所述聚乳酸防粘连膜膜片规格为1.5cmX 1.5cm。
[0019]作为优选，所述细胞悬液密度为5X104/ml的或所述胰蛋白酶为0.25%胰蛋白酶。
[0020]作为优选，所述培养箱为温度为37°C、含5%C02的培养箱。
[0021]与现有技术相比，本发明的有益效果在于:
[0022]EPCs又称为血管内皮干细胞，作为一种原始细胞，EPCs具有较强的分化增殖能力和生物活性。研究发现EPCs至少分为早期EPCs和晚期EPCs两种类型[19]。早期EPCs出现于单个核细胞贴壁培养的早期，表达⑶14、⑶45及⑶133等干细胞标记，不具有体外成血管能力，晚期EPCs多出现于培养2~4周，表达VEGFR2，vWF,⑶31及VE-钙黏素等成熟内皮细胞标记，因其典型的内皮细胞形态和高增殖潜力被认为是真正的EPCs，能在组织损伤部位、机体缺血区及肉芽形成过程中形成新生血管。因此抑制晚期EPCs的功能有利于抑制永久性纤维性粘连的产生。
[0023]相对于壳聚糖防粘连膜材料活性保持时间较短的缺点，聚乳酸防粘连膜植入人体后，在手术创面愈合时间内始终保持活性，将会在预先设计的时间内逐渐降解、吸收，最终形成二氧化碳和水，以呼吸和体液的形式排出体外，无任何残留和蓄积。
[0024]本发明将晚期EPCs种植于聚乳酸防粘连膜上培养一定时间后，细胞的增殖、粘附、迁移、成血管功能均降低，衰老比率增高。该研究结果提示聚乳酸防粘连膜除在手术创面和周围组织之间形成自然屏障，抑制成纤维细胞对手术创面的入侵外，尚可通过抑制晚期EPCs的功能来减少新生血管的形成。
[0025]本发明中，由于聚乳酸及其共聚物的物理和化学性能俱佳，具有可降解性和生物相容性，它能够在体内完全代谢无蓄积，最终的降解产物是CO2和H2O,对人体无毒、无刺激，因此本发明方法对增殖、粘附、迁移、体外成血管、细胞衰老等指标测定结果均表明聚乳酸防粘连膜对晚期EPCs的功能有抑制作用，提示聚乳酸防粘连膜亦可通过抑制EPCs的功能，减少新生血管的形成，预防手术后永久性粘连的发生。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1聚乳酸防 粘连膜对晚期EPCs细胞形态的影响示意图；[0027]图2聚乳酸防粘连膜对晚期EPCs增殖的影响示意图；
[0028]图3聚乳酸防粘连膜对晚期EPCs粘附的影响示意图；
[0029]图4聚乳酸防粘连膜对晚期EPCs迁移的影响示意图；
[0030]图5聚乳酸防粘连膜对晚期EPCs体外成血管能力的影响示意图；
[0031]图6聚乳酸防粘连膜对晚期EPCs凋亡的影响示意图；
[0032]图7聚乳酸防粘连膜对晚期EPCs衰老的影响示意图；
[0033]图1-7中，Control是对照组，PLLA是实验组；图3中，A为荧光显微镜下迁移细胞图像(X 100)，B为统计学分析结果；图4中，A为荧光显微镜下迁移细胞图像(X100)，B为统计学分析结果；图5中，A为光镜下晚期EPCs体外成血管图像(X 100)，B为统计学分析结果；图6中，A为EPCs凋亡的流式散点图，B为统计学分析结果；图7中，A为光镜下晚期EPCs β -gal细胞衰老染色图像(X 100)，B为统计学分析结果。
【具体实施方式】
[0034]下面将结合附图对本发明作进一步说明。
[0035]实施例1
[0036]①大鼠骨髓EPCs的分离培养和鉴定
[0037]采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓单核细胞，以完全EGM-2培养液重悬细胞，将其接种于预先经FN打底的培养瓶中，置37°C含5%C02 (体积百分比)的培养箱中。4天后更换培养液，以后每隔3天换一次液。待细胞生长到80%左右时，用0.25% (重量百分比)胰蛋白酶按1:1比例传代。以传至第三代的EPCs，即晚期EPCs为靶细胞，细胞行Dil-ac-LDL及FITC-UEA-1染色，双染阳性，流式细胞术检测VEGFR2、vWF、CD31及VE-Cadherin等内皮细胞标记的表达。
[0038]②取上面①制取的晚期EPCs，用0.25%胰蛋白酶消化、完全EGM-2培养基重悬制成密度为5X104/ml的细胞悬液，接种于六孔板中，本发明组六孔板孔中预先放入无菌的聚乳酸防粘连膜膜片(1.5cmXl.5cm)，对照组孔中不放置，置于37°C含5%C02的培养箱中，每隔3天换一次液，6天后进行形态观察及下面的功能检测。
[0039]形态观察1-晚期EPCs细胞形态观察(本发明组与对照组)
[0040]观察结果见图1和图2。
[0041]由图1-图2可见，种植于聚乳酸防粘连膜上晚期EPCs胞体略大于对照组，有伪足形成，总体细胞数量明显少于对照组。
[0042]功能检测1-增殖功能检测
[0043]采用CCK-8法检测细胞的增殖能力。向96孔板中均匀加入细胞(4000个细胞/100 μ I/孔)，置37°C 5%C02培养箱48h后取出，弃去各孔培养基，加入CCK-8试剂和培养基的混合液(按1:10比例)，在培养箱内孵育60min，酶标仪测定各孔在450nm波长的吸光度。
[0044]将晚期EPCs分别种植于聚乳酸防粘连膜上或普通培养板。6天后以CCK-8法检测EPCs的增殖能力。检测结果见图2。
[0045]如图2所示，聚乳酸防粘连膜抑制晚期EPCs的增殖能力(Ρ〈0.01)。
[0046]功能检测2-粘附能力检测
[0047]用10mg/L的FN预包被12孔板2h，PBS洗3遍。将I X 104晚期EPCs种植于预先包被的培养板中，置37°C含5%C02的培养箱中30min后取出，IXPBS洗掉未贴壁的细胞，每孔随机取6个视野(XlOO)计数贴壁细胞。
[0048]将晚期EPCs分别种植于聚乳酸防粘连膜上或普通培养板。6天后，细胞再次接种于经FN预处理的培养板中，30min后观测粘附细胞数，结果见图3。
[0049]由图3可知，聚乳酸防粘连膜抑制晚期EPCs的粘附能力(Ρ〈0.01)。
[0050]功能检测3-迁移功能检测
[0051]采用改良的Boyden小室法观察细胞迁移情况，用ΕΒΜ-2培养基制成悬液计数，50 μ I细胞(2X 104)悬浮液注入上室，用培养基加满下室。置于37°C、5%C02和饱和湿度的培养箱内。8h后，刮去滤膜上面的未移动细胞，PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定，DAPI染色，显微镜下随机选取5个视野(X 100)，计数迁移细胞，取其平均数。
[0052]以改良Boyden小室法检测聚乳酸防粘连膜对晚期EPCs迁移能力的影响。结果见图4。
[0053]由图4可知，本发明组迁移的细胞数明显少于对照组(P〈0.01)，提示聚乳酸防粘连膜抑制晚期EPCs的迁移能力。
[0054]功能检测4-衰老功能检测
[0055]采用β_半乳糖苷酶法检测细胞衰老。按说明书进行洗涤、固定、染色，置37°C无CO2恒温箱中20h后取出，光学显微镜下拍照计数。表达β-gal活性的地方呈蓝色，计算视野中的染成蓝色的细胞阳性率。
[0056]体外成血管实验结果见图5。
[0057]由图5可知，聚乳酸防粘连膜可抑制晚期EPCs在Matrigel上形成管腔样结构，与对照组比较，其形成的血管腔数量较少，细胞连接比较松散。图像及统计学分析结果提示，实验组晚期EPCs形成的血管样结构管腔数明显低于对照组(P〈0.01)。
[0058]功能检测5-凋亡功能检测
[0059]采用Annexin V-FITC和PI双染细胞，流式细胞仪检测凋亡细胞数。
[0060]收集对照组及实验组晚期EPCs行AnnexinV/PI染色，FASC检测细胞凋亡，设定AnnexinV (+)PI(_)细胞为凋亡细胞。结果见图6。
[0061]由图6可知，聚乳酸防粘连膜对晚期EPCs凋亡无明显影响。
[0062]功能检测6-体外成血管功能检测
[0063]吸取100 μ I/孔基质胶加入96孔板，37 V，5%C0 2孵育Ih后，将晚期EPCs以2X 104/ml密度接种于基质胶，8h后，倒置显微镜下拍照观察。利用图像分析软件Image-Pro Plus (Media Cybernetics, USA)分析形成管腔数。
[0064]结果见图7。
[0065]由图7可知，β -gal细胞衰老染色显示:与对照组相比，聚乳酸防粘连膜实验组晚期EPCs蓝染细胞数较多，其染色阳性细胞百分比率为(22.19±2.37)%，显著高于对照组细胞(15.03 ±2.30)%(Ρ〈0.01)。
[0066]本发明中，统计学分析的所有数据以x±χ表示，采用SPSS 10.0统计学软件处理，数据间比较采用t检验，P 〈0.05时认为有统计学差异。
【权利要求】
1.一种抑制晚期内皮祖细胞功能的方法，其特征在于:该方法采用聚乳酸防粘连膜。
2.根据权利要求1所述的抑制晚期内皮祖细胞功能的方法，其特征在于:所述晚期内皮祖细胞功能为增殖、粘附、迁移或/和成血管功能。
3.一种减少新生血管的形成的方法，其特征在于:该方法通过权利要求1或2所述的方法减少新生血管的形成。
4.一种预防感染或手术后永久性粘连发生的方法，其特征在于:该方法采用聚乳酸防粘连膜。
5.一种预防感染或手术后永久性粘连发生的模拟方法，该方法包括: 大鼠骨髓EPCs的分离培养和鉴定； 用胰蛋白酶消化、完全EGM-2培养基重悬制成细胞悬液，接种于六孔板中，六孔板孔中预先放入聚乳酸防粘连膜膜片，置于培养箱中，每隔3天换一次液。
6.根据权利要求5所述的预防感染或手术后永久性粘连发生的模拟方法，其特征在于:所述大鼠骨髓EPCs的分离培养和鉴定为采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓单核细胞，以完全EGM-2培养液重悬细胞，将其接种于预先经FN打底的培养瓶中，置37°C含5%C02的培养箱中；4天后更换培养液，以后每隔3天换一次液；待细胞生长到80%左右时，用0.25%胰蛋白酶按1:1比例传代；以传至第三代的EPCs，即晚期EPCs为靶细胞，细胞行Dil-ac-LDL及FITC-UEA-1染色，双染阳性，流式细胞术检测VEGFR2、vWF、CD31及VE-Cadherin等内皮细胞标记的表达。
7.根据权利要求5所述的预防感染或手术后永久性粘连发生的模拟方法，其特征在于:所述聚乳酸防粘连膜膜片为无菌的聚乳酸防粘连膜膜片。
8.根据权利要求5所述的预防感染或手术后永久性粘连发生的模拟方法，其特征在于:所述聚乳酸防粘连膜膜片规格为1.5cmX 1.5cm。
9.根据权利要求5所述的预防感染或手术后永久性粘连发生的模拟方法，其特征在于:所述细胞悬液密度为5 X 104/ml的或所述胰蛋白酶为0.25%胰蛋白酶。
10.根据权利要求5所述的预防感染或手术后永久性粘连发生的模拟方法，其特征在于:所述培养箱为温度为37°C、含5%C02的培养箱。
【文档编号】A61K31/765GK103784469SQ201410027874
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月21日 优先权日:2014年1月21日
【发明者】成敏, 官秀梅, 李鑫 申请人:潍坊医学院