用于治疗癌症的方法和药物组合物的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及一种用于治疗癌症的包含氨基酸序列：KRFYVVMWKK(SEQ ID NO：1)的可溶肽或者其功能保守性变体。本发明还涉及一种用于治疗癌症的药物组合物，包含至少一种本发明的可溶肽，或者至少一种本发明的核酸，或者至少一种本发明的表达载体，或者至少一种本发明中的宿主细胞，和药学上可接受的载体。
【专利说明】用于治疗癌症的方法和药物组合物
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于治疗癌症的包含氨基酸序列：KRFYVVMWKK(SEQ ID NO :1)的 可溶肽或者其功能保守性变体。
[0002] 本发明还涉及一种用于治疗癌症的药物组合物，包含至少一种本发明的可溶肽， 或者至少一种本发明的核酸，或者至少一种本发明的表达载体，或者至少一种本发明的宿 主细胞，和一种药学上可接受的载体。
【背景技术】
[0003] 癌症是一种恶性肿瘤，是一组全部涉及失调的细胞生长的广泛的各种疾病。2007 年，癌症引起的死亡占全世界全部死亡人数的13% (7900000)。随着越来越多的人更加长 寿以及发展中国家生活方式的巨大改变，比例将继续上升。
[0004] 特别地，慢性淋巴细胞白血病（CLL)是西方国家中最常见的成人白血病，其特征 在于外周血、骨髓和二级淋巴器官中单克隆⑶5+B-淋巴细胞的逐步累积。所形成的阻 塞导致免疫和造血系统的逐步失效。预测CLL进展的高风险标志包括17pl3(TP53)和 llq22_q23(ATM)的细胞遗传学特征的突变/缺失、IGHV的未突变状态、ΖΑΡ70的高表达、 CD38、可溶性CD23的增加，以及正在研宄但还没有证实的N0TCH1，MYD88、BIRC3、XP01、 KLHL6、SF3B1 和 POTl 基因中的突变[Gribben JG，2010;Lanasa MC，2010 and Chiorazzi N.等，2005]。具有与ATM和TP53基因相关的机能障碍的患者预后最差，需要特定的积极治 疗，包括异基因干细胞移植[Pospisilova N，2012]。CLL的特征是：（i)不可治愈，因为所 有的患者最终都会复发，强调该疾病对现有治疗方案的抗性。（ii)对现有的但非最佳的治 疗的响应而言是非常异质性疾病。（iii)耐药性仍然是CLL治疗失败的一个主要原因，且由 于该疾病自然病程的延长和重复治疗引起的其不可避免的命运产生了相关的社会和健康 问题。（iv)主要影响老年人，并且被认为是大部分年龄相关癌症的一个典型例子。（V)仍 然缺乏强大而特定的用于预测治疗响应的标记物，尽管迫切需要这些标记物以实现与风险 相适应的个性化的治疗，在最小化成本的同时使临床获益最大化。
[0005] 尽管导致这种恶性肿瘤发展的直接原因尚不完全清楚，但现在已经完全证实， CLL代表由增殖和细胞程序性死亡（PCD)之间的不平衡引起的人类恶性肿瘤的完美例子 [Chiorazzi N，2007]。所以，更好的了解调控白血病CLL细胞寿命的P⑶机制应该能够对 治疗性干预这种白血病提供关键的进展。
[0006] PCD是细胞自我毁灭的过程，其特征在于模式化的超微结构的变化，包括线粒体的 改变、细胞核和细胞质的浓缩、细胞膜出泡以及磷脂酰丝氨酸的外显。过去十年进行的大量 研宄已经鉴定了多种PCD调控中涉及的酶和其他调控蛋白。这些研宄的结论是，在大多数 情况下，当半胱氨酸蛋白酶（也称为半胱天冬酶）家族被激活时发生PCD。由于通过使用半 胱天冬酶活化剂诱导细胞凋亡在理论上可构成对癌症的治疗，最初的促凋亡抗肿瘤实验都 集中在半胱天冬酶的活性上。不幸的是，大部分这些研宄由于其低效率而仍处于临床前研 宄阶段。某种程度上，这可能是由于即使当半胱天冬酶级联受阻，PCD仍可进行的事实。该 事实也揭示了定义为独立于半胱天冬酶的替代通路的存在。因此，独立于半胱天冬酶的PCD 通路的综合分析对CLL和其他肿瘤性疾病的治疗策略的设计提供了新的挑战。
[0007] 如上所述，耐药性仍然是CLL治疗失败的一个主要原因。事实上，目前的治疗是形 成若干副作用的原因，增加了治疗相关残疾的发生，最终影响到大多数患者的健康，如果不 是生存率的话。至今为止，治疗的目的是维持最佳生活质量，且只有当患者出现其疾病的症 状时才开始治疗。对大多数患者来说，这意味着用"观望"的方法来确定疾病的发展速度以 及评估症状的发展。对CLL患者的最初治疗包括一种核苷类似物（氟达拉宾）或者一种烷 化剂（苯丁酸氦芥）。联合治疗方案，例如氟达拉宾和环磷酰胺（FC)，或者是目前公认的标 准一线治疗的最近的在FC中添加利妥昔单抗（FCR治疗），改进了最初的治疗方案。对于耐 药或复发的患者，也开发了一些替代治疗，比如苯达莫司汀、蛋白酶抑制剂、或者单克隆抗 体（抗⑶52、优化的抗⑶20、抗⑶23等）。
[0008] 就目前的临床试验而言，更相关的是单克隆抗体（GA101，鲁昔单抗、鲁卡木单 抗）、BH3模拟物（obatoclax、ABT-263)、细胞周期蛋白依赖性的激酶抑制剂（黄酮吡醇、 SNS-032)，Lyn-激酶抑制剂（达沙替尼、巴非替尼）、低甲基化剂（氮胞苷、地西他滨）、组 蛋白去乙酰化酶抑制剂（parobinastat)、嗓呤类似物（8-氯腺甘、forodesine)和小分子 免疫药物（TRU-016)的使用。抑制B细胞受体结合下游信号的分子是新型的作用在不同的 靶标上的口服试剂，包括磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂（CAL-101)、布鲁顿酪氨酸激酶（BTK) (PCI-32765)和脾酪氨酸激酶（SYK)抑制剂（fostamitinib) 〇
[0009] 上述的大多数化疗治疗经由半胱天冬酶依赖性的机制诱导细胞毒性（见上，第2 页），从而产生非常多变的结果：许多患者具有阳性反应，而其他患者仍然难治（15-25%的 CLL患者在疾病过程中变得难治）。事实上，由于白血病B细胞存在分子缺陷，使其能特别 地对抗半胱天冬酶依赖性的P⑶通路（P53失活，抗凋亡蛋白例如Mcl-I或Bcl-2的过表 达），因此很大一部分CLL患者用目前的化疗治疗很难治疗。因此，引入能经由替代的独立 于半胱天冬酶的PCD通路诱导PCD的新药，能够为改进目前的CLL治疗中所使用的策略提 供新的手段。
[0010] ⑶47受体是一种广泛表达的免疫球蛋白（Ig)超家族成员，同时作为凝血栓蛋 白-I(TSP-I)的受体和跨膜信号调节蛋白SIRPa和γ的配体[Brown EJ et al.，2001]。 这些分子调节免疫系统的各种生物现象，包括血小板激活、白细胞迀移、巨噬细胞多核化 和P⑶。TSP-I被证实经由其COOH端的细胞结合域特异性结合⑶47,相比而言，SIRP α和 SIRP γ均不涉及⑶47诱导的P⑶。许多癌症似乎通过上调⑶47作为免疫逃避机制，而最 近的研宄表明CD47是不同类型非霍金奇淋巴瘤（NHL)包括CLL中的预后因子和潜在治疗 革巴标[Edris，B et al.，2012 ;Willingham，S. B 等，2012 ;Chao，M. P 等，2010 ;Jaiswal，S 等， 2009 and Chao，M. P等，2011]。本发明人和其他人最近证实，通过固定化的抗⑶47 mAb (不 通过可溶性的抗⑶47)与⑶47的结合，即使是在来自难治疗患者的CLL细胞中，也能诱导 独立于半胱天冬酶的P⑶。
[0011] 发明概述
[0012] 本发明阐述了通过4N1K(SEQ ID NO :1)(模拟TSP-I C端结构域的可溶性单价十 肽）与CD47的结合来诱导B-慢性淋巴细胞白血病（CLL)原代细胞中独立于半胱天冬酶 的PCD。与需要固定来诱导PCD的抗CD47单抗相反，可溶性4N1K肽不需要包被于塑料制 品上来诱导独立于半胱天冬酶的K：D。阴性对照肽4NGG(SEQ ID NO :2-两个氨基酸突变的 4N1K)不能诱导P⑶，意味着4N1K诱导P⑶的特异性（图1)。并且，4N1K及其衍生物PKHBl 与CD47的结合能特异性地清除白血病B细胞，而不会清除来自CLL患者的健康的B淋巴细 胞或者静止的正常B细胞（图2、图5和图6)，且代表好于半胱天冬酶依赖性PCD的诱导死 亡手段（这种死亡形式甚至在来自携带17pl3或Ilq22_q23缺失：ATM/TP53失活的难治性 个体的CLL细胞内也有效，图2)。小鼠体内研宄充分证实了这种肽策略在白血病细胞中诱 导PCD的特异性（图7和图8)。
[0013] 因此，本发明涉及一种用于治疗癌症的包含氨基酸序列：KRFYVVMWKK(SEQ ID NO : 1)的可溶肽或者其功能保守性变体。
[0014] 本发明还涉及一种用于治疗癌症的药物组合物，包含至少一种本发明的可溶肽， 或者至少一种本发明的核酸，或者至少一种本发明的表达载体，或者至少一种本发明的宿 主细胞，和一种药学上可接受的载体。
[0015] 发明详述
[0016] 肽及其用涂
[0017] 本发明的第一个目的涉及一种用于治疗癌症的包含氨基酸序列：KRFYVVMWKK(SEQ ID NO :1)的可溶肽或者其功能保守性变体。
[0018] 本发明也涵盖上述包含SEQ ID NO :1的可溶肽的功能保守性变体。
[0019] 在一个实施方案中，本发明所述的可溶肽可与SEQ ID NO :1具有1、2或3个氨基 酸的差异。
[0020] 在另一个实施方案中，本发明所述的可溶肽可与SEQ ID NO :1具有4或5个氨基 酸的差异。
[0021] 在一个实施方案中，本发明所述的可溶肽与SEQ ID NO :1具有至少75%的一致 性，甚至更加优选的，具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%的一致性， 并仍能降低肿瘤细胞增殖或者仍能在肿瘤细胞中诱导PCD。
[0022] 在一个实施方案中，本发明所述的可溶肽在于SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列或 与 SEQ ID N0:1 具有至少 75%、优选至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、 99. 5%或99. 9%-致性，并仍能降低肿瘤细胞增殖或者仍能在肿瘤细胞中诱导PCD的其变 体。
[0023] 为验证新生成的可溶肽是否与最初表征的肽4N1K -样能诱导相同类型的独立于 半胱天冬酶的PCD，可对每条肽进行流式细胞仪分析（例如如图2所述）。包含和不包含半 胱天冬酶抑制剂Z-VAD. fmk的处理中所获得的结果对比将支持由4N1K衍生肽诱导的细胞 死亡模式是独立于半胱天冬酶的。此外，在不同肿瘤细胞中进行的时程和剂量响应将确定 每种肽和每种肿瘤细胞类型的最佳条件。
[0024] 在本发明的一个实施方案中，所述可溶肽是长度小于50个氨基酸的氨基酸序列， 其包含如上文所定义的氨基酸序列SEQ ID NO :1。
[0025] 在本发明的另一个实施方案中，所述可溶肽是长度小于45个氨基酸的氨基酸序 列，其包含如上文所定义的氨基酸序列SEQ ID NO :1。
[0026] 在本发明的另一个实施方案中，所述可溶肽是长度小于40个氨基酸的氨基酸序 列，其包含如上文所定义的氨基酸序列SEQ ID NO :1。
[0027] 在本发明的另一个实施方案中，所述可溶肽是长度小于30个氨基酸的氨基酸序 列，其包含如上文所定义的氨基酸序列SEQ ID NO :1。
[0028] 在本发明的另一个实施方案中，所述可溶肽是长度小于20个氨基酸的氨基酸序 列，其包含如上文所定义的氨基酸序列SEQ ID NO :1。
[0029] 在本发明的另一个实施方案中，所述可溶肽是长度小于15个氨基酸的氨基酸序 列，其包含如上文所定义的氨基酸序列SEQ ID NO :1。
[0030] 如本文所用的，术语"功能保守性变体"是指在不改变肽的总体构造和功能的情况 下改变（插入、缺失或者替换）蛋白质或酶中给定的氨基酸残基的那些。此类变体包括具 有氨基酸改变例如缺失、插入和/或替换的蛋白质。"缺失"是指蛋白质中一个或多个氨基 酸的缺少。"插入"是指蛋白质中一个或多个氨基酸的增加。"替换"是指蛋白质中用另一个 氨基酸残基替代一个或多个氨基酸。典型地，给定的氨基酸被具有相似性质（例如极性、氢 结合可能性、酸性、碱性、疏水性、芳香性等）的氨基酸所替代。所述给定的氨基酸可以是天 然氨基酸或非天然氨基酸。除了蛋白质中标明是保守性的氨基酸以外的其他氨基酸可以不 同，这样任意两个具有相似功能的蛋白质之间的氨基酸序列相似度可以不同且可以是，例 如通过如其中相似性是基于MEGALIGN算法的Cluster Method的比对方案测定，其相似度 为70 %到99 %。"功能保守性变体"还包括通过BLAST或FASTA算法测定与原蛋白或母蛋白 相比具有至少60 %氨基酸一致性、优选至少75%、更优选至少85%、仍然优选至少90%、甚 至最优选至少95%氨基酸一致性且具有相同或基本相似性质或功能的肽。当两条氨基酸序 列具有大于80%、优选大于85%、优选大于90%的氨基酸相同，或者在较短序列全长内具 有大于约90%，优选大于95%是相似的（功能上一致），则该两条氨基酸序列被认为是"基 本上同源"或"基本上相似"。优选，相似或同源序列可以通过比对采用例如GCG(Geneti CS Computer Group,Program Manual for the GCG Package,Version 7,Madison，Wisconsin) 累积程序，或其他任何序列比对算法如BLAST、FASTA等鉴定。
[0031] 典型地，本发明涵盖与包含SEQ ID NO :1的可溶肽基本上一致的可溶肽，其中一个 或多个残基被功能相似的残基保守性替换，且具有上文描述的包含SEQ ID NO :1的可溶肽 的功能方面，即仍能基本上以由给定氨基酸序列组成的肽的相同方式降低肿瘤细胞增殖。
[0032] 保守性替换的例子包括用一个非极性（疏水性）残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸 或蛋氨酸替换另一个非极性残基；用一个极性（亲水性）残基替换另一个极性残基，如精氨 酸和赖氨酸之间、谷氨酰胺和天冬酰胺之间、甘氨酸和丝氨酸之间的替换；用一个碱性残基 如赖氨酸、精氨酸和组氨酸替换另一个碱性残基；或者用一个酸性残基如天冬氨酸和谷氨 酸替换另一个酸性残基。
[0033] 术语"保守性替换"还包括用化学衍生的残基取代非衍生的残基。"化学衍生物"是 指具有一个或多个通过侧链官能团的反应化学衍生的残基的主题肽。此类衍生物分子的例 子包括，例如其中游离氨基被衍生以形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁氧羰基、 氯乙酰基或甲酰基的那些分子。游离羧基可被衍生以形成盐、甲酯和乙酯或其他类型的酯 或酰肼。游离羟基可被衍生以形成〇-酰基或〇-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可被衍生以 形成N-咪挫-节基组氨酸（N-im-benzylhistidine)。化学衍生物还包括含有20个标准氨 基酸的一个或多个天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如：可用4-羟脯氨酸替换脯氨酸，可 用5-羟赖氨酸替换赖氨酸，可用3-甲基组氨酸替换组氨酸，可以高丝氨酸替换丝氨酸，可 用鸟氨酸替换赖氨酸。术语"保守性替换"还包括用于控制和稳定肽或者蛋白质二级结构 的非天然氨基酸。这些非天然氨基酸是化学修饰的氨基酸，例如如下所述的prolinoamino acid、β-氨基酸、N-甲基氨基酸、环丙基氨基酸、α，α-取代的氨基酸。这些非天然氨基 酸可包括含氟化、氯化、溴化或碘化修饰的氨基酸。
[0034] 在一个实施方案中，本发明所述的可溶肽可如实施例2中所描述。
[0035] 在另一个实施方案中，本发明所述的可溶肽是实施例2和3中所描述的PKHB 1 肽。
[0036] 在另一个实施方案中，本发明所述的可溶肽是实施例2中所描述的PKHB 3肽。
[0037] 在另一个实施方案中，本发明所述的可溶肽是实施例2中所描述的PKHB 4肽。
[0038] 在另一个实施方案中，本发明所述的可溶肽是实施例2中所描述的PKHB 9肽。
[0039] 在另一个实施方案中，本发明所述的可溶肽是实施例2中所描述的PKHB 10肽。
[0040] 在另一个实施方案中，本发明所述的可溶肽是实施例2中所描述的PKHB 11肽。
[0041] 在一个实施方案中，本发明所述的可溶肽可包含标签。标签是指可用于纯化可溶 肽的包含表位的序列。它可以通过各种技术如亲和层析连接，用于在细胞或组织样品中采 用免疫标记技术定位所述肽或多肽，以及通过免疫印迹法等检测所述肽或多肽。本领域常 用的标签的例子包括GST (谷胱甘肽-S-转移酶）标签、FLAG?标签、Strep ?标签、V5标签、 myc标签、His标签等。
[0042] 在一个实施方案中，本发明所述的可溶肽可能被荧光染料标记。染料标记的荧光 肽是细胞研宄中的重要工具。可将肽标记在N-端侧或C-端侧上。
[0043] 采用胺反应性荧光染料的N-端肽标记：
[0044] 胺反应性荧光探针被广泛用于修饰肽的N端或赖氨酸残基。已开发许多荧光胺反 应性染料来标记各种肽，且由此产生的结合物被广泛用于生物应用。目前用于标记肽的三 种主要类型的胺反应性荧光试剂包括：琥珀酰亚胺酯（SE)、异硫氰酸酯和磺酰氯。
[0045] 采用包含胺的荧光染料的C-端标记：
[0046] 包含胺的染料用于采用水溶性碳化二亚胺（比如EDC)将肽的羧基转化为酰胺基 来修饰肽。NHS或NHSS可用于提高EDC介导的蛋白-羧酸结合的耦合效率。
[0047] 4N1K衍生的标记肽具有以下通式：
【权利要求】
1. 一种用于治疗癌症的包含氨基酸序列：KRFYVVMWKK(SEQ ID N0:1)的可溶肽或者其 功能保守性变体。
2. 根据权利要求1所述的可溶肽，其中所述可溶肽可与SEQ ID NO :1具有1、2或3个 氨基酸的差异。
3. 根据权利要求1所述的可溶肽，其中所述可溶肽为氨基酸序列SEQ ID NO :1。
4. 根据权利要求1-3任一项所述的可溶肽，其中所述癌症是白血病。
5. 根据权利要求4所述的可溶肽，其中所述白血病是B-慢性淋巴细胞白血病（CLL)。
6. 根据权利要求5所述的可溶肽，其中所述CLL是难治性CLL。
7. -种用于预防或者治疗癌症的编码权利要求1-6任一项所述的可溶肽的核酸。
8. -种用于预防或者治疗癌症的包含权利要求7所述的核酸的表达载体。
9. 一种用于预防或者治疗癌症的包含权利要求8所述的表达载体的宿主细胞。
10. -种用于治疗癌症的药物组合物，包含至少一种权利要求1-6任一项所述的可溶 肽，或至少一种权利要求7所述的核酸，或至少一种权利要求8所述的表达载体，或至少一 种权利要求9所述的宿主细胞，和药学上可接受的载体。
11. 式（I)的可溶肽： I
β (I)
12. 式（II)的可溶肽：
13. 式（III)的可溶肽：
14. 一种用于治疗癌症的根据权利要求11-13所述的可溶肽。
【文档编号】A61K38/08GK104519898SQ201380029870
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年6月6日 优先权日:2012年6月6日
【发明者】桑托斯·苏西, 皮埃尔·洛奈, 菲利普·卡罗扬, 埃莱纳·梅尔-贝拉尔 申请人:国家健康与医学研究院, 皮埃尔与玛丽-居里大学, 巴黎大学迪德罗特第七分校, 笛卡尔巴黎大学, 巴黎公共救济院