预防口蹄疫的肽疫苗的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及式(I)的树枝状肽构建体，其中：T是FMDV的T表位，通过其N末端与赖氨酸核心结合，B是FMDV的B表位，W是连接基团，Z是通过其硫原子结合至连接基团W的半胱氨酸或是通过其ε氨基结合至连接基团W的赖氨酸，当B通过其N末端结合到Z的α-羧基时，X是不存在的，或当B通过其C末端结合到Z的α-氨基时，X是酰基。本发明还涉及所述构建体作为免疫原应用于动物口蹄疫的预防的用途。
【专利说明】预防口蹄疫的肽疫苗
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基于赖氨酸核心的树枝状肽（dendrimeric peptide)构建体，其同时 包含口蹄疫病毒（FMDV)的B和T表位。本发明还涉及制备这些构建体的方法、包含这些构 建体的组合物和其在动物口蹄疫预防中的应用。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫病毒（FMDV)是在偶蹄类动物中产生高度传染性和毁灭性疾病的小核糖核 酸病毒。因为口蹄疫高度的传染性，所以其对畜牧业是一种严重的瘟疫。其遏制要求在疫苗 接种、严格监控、贸易限制和检疫方面付出相当大的努力，并且有时要灭杀百万计的动物。
[0003] FMDV颗粒包含大约8500个核苷酸的正链RNA分子，其被包封在二十面体的衣壳 内，所述衣壳包含60个拷贝的四种病毒蛋白VP1-4的每一种。基因组RNA编码单一多蛋白， 由于不同的病毒蛋白酶的作用，通过蛋白水解过程，从该单一多蛋白产生不同的病毒蛋白， 其包括九种成熟的非结构蛋白（NSP)。这些NSP的每一种以及一些前体多肽参与受感染细 胞中与病毒生命周期增加相关的功能。FMDV表现出高遗传和抗原变异性，其反映在现存的 七种血清型（〇、六、(：、5六1'1、5六了2、5六了3或六5从1)和众多变体中。
[0004] 另一方面，被B淋巴细胞识别的FMDV抗原结构已被详细表征。被认为是病毒主免 疫原的主表位B是连续的和免疫显性的（位点A)，且位于VPl蛋白的140-160位置附近的 GH环中（例如Bittle et al，Naturel982, vol. 298, P. 30-33)。在许多研究中，该表位作为 免疫原被广泛使用（例如 fcown F·，Vaccine 1992, vol. 10(14)，ρ· 1022-1026)。在 1986 年， DiMarchi 和同事（DiMarchi et al·，Science 1986, vol. 232, ρ· 639-641)报道在用如此肤 免疫的牛中防护病毒攻击感染，在该肽中，VPl的140-160残基与相应于同一蛋白200-213 位置的残基共线合成（colinearly synthesised)。但是，涉及大量动物的进一步研究指出， 在天然FMDV宿主中，该肽表位提供有限的保护（例如Barteling S. J, Adv. Biotechnol. Processes 1988, vol.10, P.25-60)。
[0005] 此外，从感染FMDV的猪上，几个被淋巴细胞识别的T细胞表位已在非结构蛋白中 被鉴定（例如 Blanco E.et al·，Journal of Virology2001, vol. 75, P. 3164-3174)。在这 些表位中，与VPl的表位B [137-156]共线合成的3A蛋白的表位T [21-35]，能够有效刺激来 自被感染动物的淋巴细胞，并在体外引发显著水平的血清型特异性的抗FMDV活性。
[0006] -方面，口蹄疫病毒的问题--其促使这类的健康关注，是其非常有传染性。被感 染的动物通过其唾液（因该疫病产生大量唾液）、其尿液和粪便释放病毒：当水泡破裂时， 病毒也从中释放出来。奶和肉也含有病毒。这意味着与被感染动物接触的任何事物都将容 易被污染。同样的，该病毒在特定环境下是非常有抗性的。因此，有必要采取严格的预防措 施来避免这种疾病的传染和传播，虽然其对人类健康不危险，但会造成严重的经济损失。
[0007] 当前，口蹄疫主要通过使用基于灭活病毒的疫苗来控制。FMDV感染和基于这些疫 苗的免疫都经常引起高水平的特异性循环抗体，其与相关同源病毒和抗原相关病毒的防护 有关。
[0008] 尽管近几年有所进展，但直至现在，已知和使用中的疫苗显示出数个缺点，例如冷 链以维持其稳定性的需求、定期重复接种疫苗的需要、疫苗生产中传染性病毒释放的风险 以及其不确定的性质，换句话说，即在血清学上区分被感染动物和那些已经接种疫苗的动 物的困难。
[0009] 包含FMDV表位的树枝状肽已经被公开。Francis et al. (Immunology 1991，73, 249-254)涉及具有二聚、四聚或八聚结构的多抗原肽（MAP)系统，其包含FMDV 的B表位（VP1蛋白的141-160氨基酸）。EP2053056描述了基于赖氨酸核心的四聚肽 构建体，其同时包含FMDV的B和T表位。四聚肽在Cubillo等（Journal of Virology 2008, 82 (14)，7223-7229)中也被描述。该参考文献还公开了在制备所述四聚肽时获得的不 确定结构的副产物（命名为B2T和B 3T)。
[0010] 尽管存在上述现有技术，仍需要进一步的FMD疫苗。特别是，免疫原性改进的、容 易合成或容易纯化的系统将是期望的。
【发明内容】
[0011] 发明人发现基于赖氨酸核心并且包含结合至赖氨酸核心的C末端残基的T表位和 结合至赖氨酸核心的N末端残基的两个B表位的二聚肽构建体比相应的四聚肽构建体更容 易获得和纯化。通过一个赖氨酸的α-氨基和另一个赖氨酸的α-羧基间的氨酰键，赖氨 酸核心中的赖氨酸单元相互结合。
[0012] 此外，发明人惊奇地发现，与ΕΡ2053056中公开的相应的四聚肽构建体相比，本发 明的这些二聚肽构建体提高了免疫原性活性（见图1和2)。这是值得注意的，尤其是考虑 到Francis等（Immunology 1991，73, 249-254)，其中公开了四聚结构具有最佳的免疫应 答，比相应的二聚体的免疫原性多五到十倍。
[0013] 因此，在第一方面，本发明涉及一种式（I)的树枝状肽构建体
【权利要求】
1. 一种式（I)的树枝状肽构律体：
其中 T是FMDV的T表位，通过其N末端结合到赖氨酸核心； B是FMDV的B表位； W是连接基团； Z是半胱氨酸，通过其硫原子结合到连接基团W上，或是赖氨酸，通过其e氨基结合到 连接基团W上， 当B通过其N末端结合到Z的a-羧基时，X是不存在的，或当B通过其C末端结合到 Z的a-氨基时，X是酰基。
2. 根据权利要求1所述的树枝状构建体,其中W选自一组式： -(CH2) n-C〇-, -CO-(CH2)n-S-(CH2)m-CO-,或
其中n和m独立地选自1、2、3、4、5和6。
3. 根据前述权利要求任一项所述的树枝状构建体，其中T是所述FMDV的非结构蛋白 3A、3B或3C的T表位。
4. 根据权利要求3所述的树枝状构建体，其中T是所述FMDV的T表位，其包含C血清 型FMDV的3A蛋白的残基21-35,或其它血清型FMDV的相应氨基酸残基。
5. 根据权利要求4所述的树枝状构建体，其中T包含氨基酸序列AAIEFFEGMVHDSIK(SEQ ID NO :1)。
6. 根据前述权利要求任一项所述的树枝状构建体，其中B是所述FMDV的衣壳蛋白 VP1、VP2或VP3的B表位。
7. 根据权利要求6所述的树枝状构建体，其中B是所述FMDV的B表位，其包含VPl蛋 白的抗原位点A。
8. 根据权利要求7所述的树枝状构建体，其中B是所述FMDV的B表位，其包含0血清 型FMDV的VPl蛋白的残基141-159,或A血清型FMDV的VPl蛋白的残基139-158,或C血 清型FMDV的VPl蛋白的残基136-153,或其它血清型FMDV的相应氨基酸残基。
9. 根据权利要求8所述的树枝状构建体，其中B包含选自下述的氨基酸序 列：PVTNVRGDLQVLAQKAART(SEQ ID N0:2)、AVPNVRGDLQVLAQKVVRT(SEQ ID N0:3)、 SGLSRRGDLGSLAARVAKAL(SEQ ID N0:4)、GGSGRRGDMGSLAARVVKQL(SEQ ID N0:5)和 VPNLRGDLQVLAQKVARTLP(SEQ ID NO ：6)〇
10. 根据前述权利要求任一项所述的树枝状构建体，其选自式（Ia)、（Ib)、（Ic)或（Id) 的构建体：
其中B和T如权利要求1-9中任一项所限定的。
11. 根据权利要求10所述的树枝状构建体，其选自式（la)、（lb)、（Ic)或（Id)的构建 体，其中 T 是 SEQ ID NO :1 并且 B 是 SEQ ID NO :2。
12. 制备权利要求1-11中任一项所限定的式（Ia)或（Ib)的树枝状肽构建体的方法， 其包含在6和7. 5之间的pH下使式（II)的化合物与式（III)的化合物反应
其中T、B和X如权利要求10中所限定的。
13. -种兽药组合物，其包含权利要求1-11中任一项所限定的式（I)的树枝状肽构建 体和兽医学上可接受的佐剂、载体或稀释剂。
14. 如权利要求1-11中任一项所限定的式（I)的树枝状肽构建体，其在医学上应用。
15. 如权利要求1-11中任一项所限定的式（I)的树枝状肽构建体，其在动物口蹄疫预 防中应用。
16. 如权利要求15所限定的式（I)所应用的树枝状肽构建体，其中所述动物选自牛和 猪。
17. 如权利要求1-11中任一项所限定的式（I)的树枝状肽构建体在制备药剂中的用 途。
18. 如权利要求1-11中任一项所限定的式（I)的树枝状肽构建体在制备预防动物口蹄 疫的药剂中的用途。
19. 如权利要求18所限定的用途，其中所述药剂用于施用给选自牛和猪的动物。
20. -种预防动物口蹄疫的方法，包含对所述动物施用在权利要求1-11中任何一项所 限定的式（I)的树枝状肽构建体，或在权利要求13所限定的兽药组合物。
21. 如权利要求20所限定的预防口蹄疫的方法，其中所述式（I)的树枝状肽构建体或 所述兽药组合物被施用给选自牛和猪的动物。
【文档编号】A61K47/48GK104363925SQ201380028912
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2013年4月1日 优先权日:2012年4月2日
【发明者】D·安德勒马丁内斯, J·巴尔塞纳德尔里勾, E·布兰科拉维利亚, C·库维略斯萨帕塔, B·加西亚德拉托雷, M·蒙索奥利瓦雷斯, F·索布里偌卡斯特略 申请人:庞培法布拉大学, 高级科学研究委员会, 国家研究所的粮食与农业及Inia技术研究会