工程化的抗体-干扰素突变体融合分子的利记博彩app

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【专利摘要】本发明领域涉及基因工程融合分子，制备所述融合分子的方法，及其在抗肿瘤免疫疗法中的用途。更具体而言，本发明涉及融合分子构建体，其中为了杀伤肿瘤细胞或抑制其生长或增殖的目的，将肿瘤相关抗原（TAA）抗体（Ab）充当靶向部分以选择性地递送细胞因子至所述肿瘤细胞。在多个实施方案中，工程化的融合分子包含融合至干扰素-α(IFN-α)突变体分子的TAA Ab。本发明的工程化的Ab-IFN-α突变体融合分子相比于Ab-野生型IFN-α融合分子显示改进的治疗指数和保留的或增加的效力，和/或相比于Ab-野生型IFN-α融合分子显示改进的PK特性。
【专利说明】工程化的抗体-干扰素突变体融合分子
[0001] 相关申请的夺叉引用 本申请要求于2012年3月3日提交的美国临时申请号61/634, 565的优先权和权益， 其对于所有目的以其整体通过引用并入本文。
[0002] 政府支持声明 本发明用美国政府支持根据基金号1R43CA162762-01A1，由National Institutes of Health资助完成。美国政府在本发明中具有某些权利。

【技术领域】
[0003] 本发明领域涉及基因工程融合分子，制备所述融合分子的方法，及其在抗肿瘤免 疫疗法中的用途。

【背景技术】
[0004] 干扰素是重要的细胞因子，其对免疫应答具有多种作用（Theofilopoulos 等，Annu. Rev. Immunol.，23:307-336，2005)。干扰素包括1型干扰素（例如，干扰 素 -a (IFN- α )和干扰素-MIFN- β ))和2型干扰素(例如，干扰素 -Y (IFN- Y ))。所有 1型IFN由共同的受体（IFN-a R)识别，所述受体由两个跨膜蛋白IFN-a Rl和IFN-a R2 构成。已知 IFN-a ' s 抑制血管发生（Sidky YA 和 EC Borden, Cancer Res., 47:5155, 1987)，介导树突细胞的刺激和分化（Santini等，J Exp Med, 191:1777，2000)，并且对于 抗原特异性⑶8+ T细胞的体内增殖、扩展和长期存活是重要的（Tough DF等，Science， 272:1947，1996)。尽管首先描述了它们抑制病毒复制的能力，但IFN-α' s具有多种特 性，展示出抗增殖性作用，诱导凋亡（Rodriguez-Villanueva J和TJ McDonnell, Int J Cancer, 61:110，1995)和诱导肿瘤细胞中的肿瘤抑制基因 P53(Takaoka A等，Nature, 424:516，2003)。因此，IFN-α' s是用于治疗多种癌症的第一重组蛋白。
[0005] 不幸的是，使用IFN-a治疗癌症已受其半衰期短和伴随的全身性毒性而受限 (Weiss K，Semin Oncol, 25:9，1998; Jones GJ和Itri LM, Cancer, 57:1709，2006)。 由于IFN-α的体内半衰期短，所以需要频繁施用。药代动力学（PK)研究已显示仅0.01%的 皮下注射的 IFN-α 到达靶肿瘤部位（Suzuki K 等，Gene Ther.，10(9):765-773, 2003)。 与IFN-α疗法相关的最常见的不利事件是流感样症状、疲劳、厌食、中枢神经系统和精神 病反应，并且这些副作用中的一些可以变为剂量限制性的（Jones GJ和Itri LM，Cancer, 57:1709，2006)。由于这些限制，因此难以在恶性疾病部位实现有效的IFN-α浓度而不 引起全身性毒性。全身性IFN-a疗法的限制已导致探寻安全且有效地向肿瘤附近递送 IFN-α的替代策略。


【发明内容】

[0006] 在一方面，本发明提供新型基因工程肿瘤相关抗原（TAA)抗体（Ab)-干扰素 a (IFN-α)突变体分子。
[0007] 在一方面，本发明提供包含连接至IFN-α突变体分子的TAA Ab的基因工程融 合分子，其中所述抗体直接连接至所述IFN-α突变体分子，其中所述融合分子相比于TAA Ab-野生型（wt) IFN- α融合分子显示出改进的PK特性。
[0008] 在一方面，本发明提供包含连接至IFN-α突变体分子的TAA Ab的基因工程融合 分子，其中所述抗体直接连接至所述IFN-α突变体分子，其中所述融合分子当与肿瘤细胞 接触时导致杀伤所述肿瘤细胞或抑制其生长或增殖。
[0009] 在本发明的多个实施方案中，基因工程融合分子的干扰素 α突变体分子包含 突变的人IFN-α 2分子，其在SEQ ID NO: 13中包含至少一个突变，其中所述突变选自 H57Y, E58N. Q61S, H57S. E58S. H57A, E58A, Q61A, R149A. RΙ62Λ, D35E, EI65D,L2(? 夂 F27AJJ35A, AI45V ;及其组合。
[0010] 在多个实施方案中，融合分子包含TAA抗体，其选自抗-HER2/neu、抗-HER3、 抗-HER4、抗-CD4、抗-CD19、抗-CD20、抗-CD22、抗-CD25、抗-CD33、抗-CD138、抗-CD200、 抗-CD276、抗-CXCR3、抗-CXCR5、抗-CCR3、抗-CCR4、抗-CCR9、抗-CRTH2、抗-PMCH 和抗-内 质蛋白抗体。
[0011] 在一个实施方案中，融合分子包含抗-HER2/neu抗体和在SEQ ID NO: 13中含有 突变F27A的突变的人IFN- α 2分子。
[0012] 在一个实施方案中，融合分子包含抗-⑶20抗体和在SEQ ID NO: 13中含有突变 F27A的突变的人IFN- α 2分子。
[0013] 在一个实施方案中，融合分子包含抗-⑶138抗体和在SEQ ID NO: 13中含有突变 F27A的突变的人IFN- α 2分子。
[0014] 在一个实施方案中，融合分子包含抗-内质蛋白抗体和在SEQ ID NO: 13中含有 突变F27A的突变的人IFN- α 2分子。
[0015] 在一个实施方案中，融合分子包含抗-⑶33抗体和在SEQ ID NO: 13中含有突变 F27A的突变的人IFN- α 2分子。
[0016] 在一个实施方案中，融合分子包含抗-⑶276抗体和在SEQ ID NO: 13中含有突变 F27A的突变的人IFN- α 2分子。
[0017] 在一个实施方案中，融合分子包含抗_HER2/neu抗体和在SEQ ID NO: 13中含有 两个突变R149A和R162A的突变的人IFN- α 2分子。
[0018] 在一个实施方案中，融合分子包含抗-⑶20抗体和在SEQ ID NO: 13中含有两个 突变R149A和R162A的突变的人IFN- α 2分子。
[0019] 在一个实施方案中，融合分子包含抗-⑶138抗体和在SEQ ID NO: 13中含有两个 突变R149A和R162A的突变的人IFN- α 2分子。
[0020] 在一个实施方案中，融合分子包含抗-内质蛋白抗体和在SEQ ID NO: 13中含有 两个突变R149A和R162A的突变的人IFN- α 2分子。
[0021] 在一个实施方案中，融合分子包含抗-⑶33抗体和在SEQ ID NO: 13中含有两个 突变R149A和R162A的突变的人IFN- α 2分子。
[0022] 在一个实施方案中，融合分子包含抗-⑶276抗体和在SEQ ID NO: 13中含有两个 突变R149A和R162A的突变的人IFN- α 2分子。
[0023] 在另一个实施方案中，融合分子包含抗体，其选自完全人抗体、人源化抗体、嵌 合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、抗原结合抗体片段、Fab、Fab'、Fab2、Fab'2、 IgG、IgM、IgA、IgE、scFv、dsFv、dAb、纳米抗体（nanobody)、单抗体（unibody)、和双价抗体 (diabody)〇
[0024] 本发明的另一方面涉及药物组合物和制备所述药物组合物的方法，其中所述组合 物在药学上可接受的载体中包含本发明的基因工程融合分子作为活性成分。
[0025] 本发明的另一方面涉及治疗患者中的肿瘤或肿瘤转移的方法，其包括向所述患者 施用治疗有效量(作为单一疗法或作为联合治疗方案的部分）的在药学上可接受的载体中 的本发明的基因工程融合分子，其中所述施用促进肿瘤消退和/或肿瘤死亡。
[0026] 本发明的另一方面涉及本发明的基因工程融合体制备用于治疗有需要的患者中 的肿瘤或肿瘤转移的药物的用途。
[0027] 本发明的其他方面涉及编码本发明的基因工程融合分子的核酸；包含编码本发 明的融合分子的核酸分子，任选地，其可操作地连接至被载体转化的宿主细胞识别的控制 序列上；宿主细胞,其包含含有编码本发明的融合分子的核酸分子的载体；产生本发明的 融合分子的方法，其包括培养包含含有编码本发明的融合分子的核酸分子的载体的宿主细 胞，使得所述核酸表达，并且任选地，从宿主细胞培养基中回收融合分子。在多个实施方案 中，核酸编码包含连接至干扰素突变体分子的肿瘤相关抗原抗体的融合分子。在多个实施 方案中，核酸编码将抗体连接至干扰素突变体分子的肽接头(例如，如本文所述的)。
[0028] 附图简沭 图1描绘了一种提出的本发明的基因工程融合分子的设计。在图1中，标识为VH、 Q、CH1、CH2和CH3的椭圆形代表如本文定义的全长抗体(Ab)。标识为C的椭圆形代表细胞因 子，例如IFN-α突变体。接头由扭曲的线表示。如图1中所示，C经接头在两个C h3位点处 连接至Ab。在一个可选的实施方案中，C经接头在两个'位点处连接至Ab。在仍另一个可 选的实施方案中，C经接头在两个V h位点处连接至Ab。在仍另一个可选方案中，C经接头 在内部位点而非在Ch3、'或V h位点处连接至Ab。
[0029] 图2描绘了另一种提出的本发明的基因工程融合分子的设计。在图3中，标识为 '、VH、Q、CH、Chi和Ch2的椭圆形代表如本文定义的Fab 2。椭圆形标识C代表细胞因子。接 头由扭曲的线表示。如图3中所示，C经接头在两个Ch2位点处连接至Fab2。在一个可选的 实施方案中，C经接头在两个 '位点而非Ch2位点处连接至Fab 2。在仍另一个可选方案中，C 经接头在两个Vh位点而非两个V 两个C H2位点处连接至Fab 2。在仍另一个可选方案中， C经接头在内部位点而非在Ch2、'或V H位点处连接至Fab 2。
[0030] 图3描绘了另一种提出的本发明的基因工程融合分子的设计。在图4中，标识为 '、VH、(^和C hi的椭圆形代表如本文定义的Fab。椭圆形标识C代表细胞因子。接头由扭曲 的线表示。如图3中所示，C经接头在C m位点处连接至Fab。在一个可选的实施方案中，C 经接头在'位点而非Chi处连接至Fab。在仍另一个可选方案中，C经接头在Vdi点而非 '或Chi位点处连接至Fab。在仍另一个可选方案中，C经接头在内部位点而非在C H1、'或 Vh位点处连接至Fab。
[0031] 序列表 列于所附的序列表中的氨基酸序列使用氨基酸的标准三字母编码显示，如在37 ^.1?.1.822中定义的。
[0032] SEQ ID NO: 1为抗-Her2/neu抗体的重链的氨基酸序列，其中氨基酸残基1-19代 表信号肽。SEQ ID N0:2为编码抗-Her2/neu抗体的轻链的氨基酸序列，其中氨基酸残基 1-19代表信号肽。
[0033] SEQ ID NO:3为抗-⑶20抗体的重链的氨基酸序列，其中氨基酸残基1-19代表信 号肽。SEQ ID N0:3为编码抗-CD20抗体的轻链的氨基酸序列，其中氨基酸残基1-19代表 信号肽。
[0034] SEQ ID N0:5为抗-⑶138抗体的重链的氨基酸序列，其中氨基酸残基1-19代表信 号肽。SEQ ID N0:6为编码抗-CD138抗体的轻链的氨基酸序列，其中氨基酸残基1-22代表 信号肽。
[0035] SEQ ID NO:7为抗-内质蛋白抗体的重链的氨基酸序列，其中氨基酸残基1-19代 表信号肽。SEQ ID N0:8为编码抗-内质蛋白抗体的轻链的氨基酸序列，其中氨基酸残基 1-20代表信号肽。
[0036] SEQ ID N0:9为抗-⑶33抗体的重链的氨基酸序列，其中氨基酸残基1-19代表信 号肽。SEQ ID N0:10为编码抗-CD33抗体的轻链的氨基酸序列，其中氨基酸残基1-20代表 信号肽。
[0037] SEQ ID NO: 11为抗-⑶276抗体的重链可变区的氨基酸序列，其中氨基酸残基 1-19代表信号肽。SEQ ID NO: 12为编码抗-CD276抗体的轻链可变区的氨基酸序列，其中 氨基酸残基1-20代表信号肽。
[0038] SEQ ID NO: 13为人野生型IFN- α 2分子的氨基酸序列。
[0039] SEQ ID NO: 14为肽接头的氨基酸序列。
[0040] SEQ ID NO: 15为肽接头的氨基酸序列。
[0041] 讲行本发明的方式 美国专利号8, 258, 263 (Morrison等）证实祀向的野生型（wt) IFN-α可以比非祀向的 wtIFN-α具有高得多的治疗指数，使得以有效剂量施用它成为可能。具体而言，Morrison 等证实相比于非融合的wtIFN-a，多种肿瘤相关抗原Ab-wtIFN-a嵌合构建体显示出显著 改进的治疗效力（更有效?100倍)，并具有全身性毒性的明显降低。
[0042] 在本发明的多个实施方案中，制备包含经接头连接至IFN-a突变体分子的肿瘤 相关抗原抗体的基因工程融合分子用于利用所述抗体将IFN-a突变体分子靶向肿瘤分子 的特异性的目的。
[0043] 用于制备本发明的融合分子的IFN-a突变体分子对IFNa R复合体具有不同的亲 和力。本发明人评价了 IFNa R亲和力和体外治疗指数之间的关系，和融合蛋白体内的抗肿 瘤效力，并鉴定了相比于Ab-wtIFN-a融合分子显示出改进的治疗指数、和保持的或改进 的体内效力的Ab-IFN-a突变体融合分子。本发明人还鉴定了相比于Ab-wtIFN-a融合分 子显示出改进的PK特性的Ab-IFN-a突变体融合分子。治疗指数定义为：Ab-IFNa突变体 融合分子对表达由Ab识别的抗原且表达IFNa R的细胞("靶向的"）的EC5J余以Ab-IFNa 突变体融合分子对仅表达IFNa R的细胞("非靶向的"）的EC5tl。效力定义为融合分子杀伤 表达抗原(所述融合分子的Ab部分与其结合）的癌细胞的效能。
[0044] 用于鉴定此类Ab-IFN-a突变体融合分子的方法如下：1)制备IFN-a突变体；2) 制备结合肿瘤相关抗原的抗体；3)经化学缀合或经接头的直接连接构建包含IFN-a突变 体和来自步骤1)和2)的抗体的几个Ab-IFN-α突变体融合分子；4)以不同剂量在几种体 外功能测定中系统地检测得到的化学缀合物或融合分子，以鉴定具有改进的治疗指数的那 些；和5)进行使用显示出最佳治疗指数的化学缀合物或融合分子的体内研究来测定治疗 体内肿瘤的效力。具体与步骤4)相关，使用体外功能测定来测定：a)融合分子在非靶向细 胞上结合IFN-a R复合体的能力；b)融合分子结合表达IFN-a R复合体和由Ab靶向的抗 原的细胞的能力；c)融合分子结合FcRn受体的能力；d)融合分子对非祀向细胞的IFN-α 生物活性；e)融合分子对靶向细胞的抗增殖活性；和f)融合分子诱导凋亡的能力。具体与 步骤5)相关，使用体内测定来：a)确定给定的融合体治疗肿瘤的效力；和b)确定给定的融 合分子的改进的PK特性。
[0045] 定义 除非本文另有定义，否则在本发明上下文中使用的科技术语均具有本领域普通技术人 员通常理解的含义。此外，除非上下文另外需要，否则单数术语也应该包括复数形式并且复 数术语也应该包括单数形式。通常，本文描述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微 生物学、遗传学和蛋白和核酸化学和杂交相关使用的命名法及其技术是众所周知的且本领 域中通常使用的。本发明的方法和技术通常根据本领域中众所周知的和如描述于多个一般 性的和在整个本说明书中引用并讨论的更具体的参考文献中的常规方法进行，除非另有说 明。参见，例如 Sambrook 等 Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)和 Ausubel 等， Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), 和 Harlow 和 Lane Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)，其通过引用并入本文。酶反应和纯化技术根据 制造商说明书进行，如同本领域中通常进行的或如本文所描述的。本文描述的与分析化学、 合成有机化学、和医学和药物化学相关使用的术语学和实验室程序及技术是众所周知的且 在本领域中经常使用。标准技术可以用于化学合成、化学分析、药物制备、组合物、和递送、 及患者的治疗。
[0046] 术语"多肽"、"肽"和"蛋白"本文中可以互换使用来指氨基酸残基的聚合物。优 选的"肽"、"多肽"和"蛋白"为氨基酸的链，其α碳经肽键连接。因此在链的一端(氨基末 端）的末端氨基酸具有游离的氨基，而在碳的另一端(羧基末端）的末端氨基酸具有游离的 羧基。如本文所用，术语"氨基末端"（缩写为N-末端）指在肽的氨基末端处的氨基酸上的 游离α-氨基或在肽内任何其他位置处的氨基酸的α-氨基(当参与肽键时为亚氨基)。类 似地，术语"羧基末端"指肽的羧基末端上的游离羧基或在肽内任何其他位置处的氨基酸的 羧基。肽还包括基本上任何聚氨基酸，包括但不限于肽模拟物，诸如相对于酰胺键由醚连接 的氨基酸。
[0047] 如本文所用的术语"多肽片段"指相比于对应的全长蛋白具有氨基末端和/或羧 基末端缺失的多肽。例如，片段长度可以为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、50、70、 80、90、100、150或200个氨基酸。例如，片段长度还可以为至多1000、750、500、250、200、 175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、14、13、12、11 或 10 个氨基酸。片段可以 进一步在其任一端或两端包含一个或多个另外的氨基酸，例如，来自不同的天然存在蛋白 (例如，Fc或亮氨酸拉链结构域）或人工氨基酸序列(例如，人工接头序列）的氨基酸序列。
[0048] 本发明的多肽包括这样的多肽，其已经以任何方式和任何原因进行修饰例如来： (1)降低对蛋白水解的易感性，（2)降低对氧化的易感性，（3)改变对形成的蛋白复合体的 结合亲和力，（4)改变结合亲和力，和（5)赋予或修饰其他物理化学或功能特性。例如，单 个或多个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代）可以在天然存在的序列中（例如，在形成分子 间接触的结构域外部的多肽的部分中）进行。"保守的氨基酸取代"是基本上不会改变亲本 序列（parent sequence)的结构特性的氨基酸取代(例如，取代氨基酸应该趋于不打破在 亲本序列中形成的螺旋，或不破坏为亲本序列的特征的或对其功能性是必需的其他类型的 二级结构)。本领域技术公认的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton,编辑，ff. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden 和 J. Tooze,编 辑，Garland Publishing, New York, N.Y. (1991));和 Thornton 等（1991) Nature 354:105)。
[0049] 多肽的"变体"包含这样的氨基酸序列，其中相对于另一个多肽序列，一个或多个 氨基酸残基被插入到氨基酸序列中，从其中缺失和/或取代入其中。本发明的变体包括融 合蛋白。
[0050] 多肽的"衍生物"为已经化学修饰的例如缀合至另一化学部分诸如例如聚乙二醇、 白蛋白（例如人血清白蛋白）、磷酸化和糖基化的多肽。
[0051] 术语"分离的分子"（其中所述分子例如为多肽、多核苷酸、或抗体)为这样的分子， 由于其起源或衍生的来源，所述分子（1)不和在其天然状态中伴随它的天然相关组分在一 起，（2)基本上不含来自相同物种的其他分子（3)由来自不同物种的细胞表达，或（4)天然 中不存在。因此，化学合成的分子、或在与从中它天然产生的细胞不同的细胞系统中表达的 分子，将是从其天然相关组分中"分离的"。分子还可以使用本领域中熟知的纯化技术通过 分离使得基本上不含天然相关组分。分子纯度或同质性可以通过多种本领域中熟知的方法 测定。例如，多肽样品的纯度可以使用本领域中熟知的技术用聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶 染色以显色多肽来测定。对于某些目的，更高的分辨率可以通过使用HPLC或本领域中熟知 的用于纯化的其他方法来提供。
[0052] 如本文所用，"抗体"指包含一种或多种多肽的蛋白，所述多肽基本上或部分地由 免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段所编码并具有对肿瘤抗原的特异性或对在病理 状态中过表达的分子的特异性。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、 Υ、δ、ε、和μ恒 定区基因，以及这些基因的亚型和众多的免疫球蛋白可变区基因。将轻链分为κ或λ。将 重链分为Y、μ、a、S或ε，其继而分别确定免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。 典型的免疫球蛋白（例如抗体）结构单元包含四聚体。每一四聚体由相同的两对多肽链构 成，每一对具有一条"轻"链(约25 kD)和一条"重"链(约50-70 kD)。每一链的N-末端确 定主要负责抗原识别的约100-110或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链（VJ和可变 重链（V h)分别指这些轻链和重链。
[0053] 在全长抗体中，每一重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或Vh)和重链恒定区构 成。重链恒定区由三个结构域C H1、CH2和Ch3 (并在某些情况下为CH4)构成。每一轻链由轻链 可变区(本文缩写为')和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域Q构成。区 可以进一步细分为称为互补性决定区域（CDR)的高变的区域，其散布于由称为框架区（FR) 的更保守的区域。每一 ％和八由三个CDR和四个FR构成，从氨基端向羧基端按以下顺序 排列：FR1,⑶札、FR2、CDR2、FR3、CDR 3、FR4。框架区和CDR的范围已经确定(参见，Kabat等， Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Department of Health and Human Services, 1991，其通过参考并入本文XKabat数据库目前在线维护，并且⑶R序列 可以被确定，例如，参见頂GT/V-QUEST程序版本：3.2. 18.，2011年3月29日，在互联网 上可得和 fcochet, X.等，Nucl. Acids Res.，36:503-508，2008)。不同轻链和重链的 框架区的序列在物种内例如人中是相对保守的。抗体的框架区(其为组成的轻链和重链的 组合的框架区)在三维空间中提供位置并排列CDR。免疫球蛋白分子可以为任何类型(例如 IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 和 IgY)、类别（例如，IgGl、IgG2、IgG 3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或亚 类。
[0054] ⑶R主要负责结合至抗原的表位上。每一链的⑶R通常称为⑶R1、⑶R2、⑶R 3，从 N-末端顺序编号，并且还通常由具体的⑶R位于其中的链所确定。因此，Vh⑶馬位于其中 发现它的抗体的重链的可变域中，而\ CDR1为来自其中发现它的抗体的轻链的可变域中的 CDR1。具有不同特异性（即对不同的抗原的不同的组合位点）的抗体具有不同的CDR。尽管 是CDR使得抗体与抗体有所不同，但在CDR中仅为有限数目的氨基酸位置直接参与抗原结 合。⑶R内的这些位置被称为特异性决定残基（SDR)。
[0055] 术语"Fc区"用于定义免疫球蛋白重链的C-末端区域，其可以通过完整抗体的木 瓜蛋白酶消化来产生。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区。免疫球蛋白的Fc区通常 包含两个恒定区，C h2结构域和C H3结构域，并任选包含C H4结构域。抗体的Fc部分介导几种 重要的效应子功能，例如细胞因子诱导、ADCC吞噬作用、补体依赖性细胞毒性（⑶C)和抗体 和抗原-抗体复合体的半衰期/清除速率(例如，新生FcR (FcRn)在酸性pH下在内体中结 合IgG的Fc区，并保护IgG免于降解，由此促成IgG的长的血清半衰期)。在Fc部分中替 换氨基酸残基以改变抗体的效应子功能是本领域中已知的(例如参见Winter等，美国专利 号 5, 648, 260 和 5, 624, 821)。
[0056] 抗体作为完整的免疫球蛋白或作为许多良好表征的片段而存在。此类片段包括 ?813片段，？313'片段、？313 2、？(313)'2片段、单链？￥蛋白（"8〇?￥"）和二硫化物稳定的？￥蛋 白（"dsFv")，其结合靶抗原。scFv蛋白为这样的融合蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可变区 和免疫球蛋白的重链可变区通过接头连接，而在dsFv中，将链突变以引入二硫键来稳定链 的结合。尽管多种抗体片段以消化完整片段的方式确定，但技术人员将理解此类片段可以 化学地或利用重组DNA方法重新合成。因此，术语抗体如本文所用还包括通过修饰完整抗 体产生的或使用重组DNA方法重新合成的抗体片段，包括但不限于Fab、Fab'、Fab 2、Fab' 2、 IgG、IgM、IgA、IgE、scFv、dsFv、dAb、纳米抗体、单抗体、和双价抗体。在多种实施方案中，抗 体包括但不限于Fab 2、IgG、IgM、IgA、IgE和单链Fv (scFv)抗体，其中可变重链和可变轻 链连接在一起(直接或经过肽接头）以形成连续多肽。
[0057] 双价抗体为二价抗体，其包含两条多肽链，其中每一多肽链包含由接头连接的Vh 和'区，所述接头非常短使得在同一链上的两个区域之间无法配对，因此允许每一区与 另一多肽链上的互补区配对(例如，参见Holliger等，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48 (1993)，和 Poljak 等，Structure 2:1121-23 (1994))。如果双价抗体的两 条多肽链是相同的，则由它们的配对产生的双价抗体将具有两个相同的抗原结合位点。具 有不同序列的多肽链可以用于产生具有两个不同抗原结合位点的双价抗体。类似地，三价 抗体（tribodies)和四价抗体（tetrabodies)是分别包含三条和四条多肽链的抗体，并且 分别形成三个和四个抗原结合位点，其可以是相同的或不同的。
[0058] 在某些实施方案中，在本发明的构建体中使用的抗体和抗体片段可以是双特异性 的。双特异性抗体或片段可以具有几种构型。例如，双特异性抗体可以类似单一抗体(或 抗体片段）但具有两个不同的抗原结合位点（可变区)。在多个实施方案中，双特性抗体可 以通过化学技术（Kranz 等，Proc.Natl.Acad.Sci·，USA, 78:5807，1981)、通过"多瘤 (polydoma) "技术（例如，参见美国专利号4, 474, 893)、或通过重组DNA技术产生。在某些 实施方案中，本发明的双特异性抗体可以具有对至少两种不同表位(其中至少一种为肿瘤 相关抗原)具有结合特异性。在多个实施方案中，抗体和片段还可以为异种抗体。异种抗体 是连接在一起的两种或多种抗体、或抗体结合片段(例如Fab)，每一抗体或片段具有不同的 特异性。
[0059] 如本文所用的术语"单克隆抗体"指获自基本上同质性抗体的群（即包含群的各个 抗体除了可能的可以以少量存在的天然发生突变外均是相同的）的抗体。单克隆抗体是高 度特异的，针对单一抗原。此外，与多克隆抗体制剂(其一般包括针对不同决定簇(表位）的 不同抗体）不同，每一单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语"单克隆"不应解释为 需要通过任何特定的方法产生抗体。
[0060] 如本文所用的术语"嵌合抗体"指这样的抗体，其具有来自一种物种诸如人的框架 残基，和来自另一物种诸如特异性结合靶向的抗原的鼠抗体的CDR(其通常赋予抗原结合)。
[0061] 如本文所用，术语"人抗体"旨在包括具有源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和 恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括例如在CDRs中并具体在CDR 3中不由人种系免疫 球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点定向诱变或通过体内体细胞突 变引入突变)。然而，如本文所用，术语"人抗体"并不旨在包括这样的抗体，其中来源于另 一哺乳动物物种诸如小鼠的种系的CDR序列已经连接至人框架序列上。
[0062] 如本文所用的术语"人源化抗体"指包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的 抗体。人源化抗体结合与提供CDR的供体抗体结合的相同抗原。人源化免疫球蛋白或抗体 的受体框架可以具有由取自供体框架的氨基酸的有限数目的取代。人源化或其他单克隆 抗体可以具有另外的保守的氨基酸取代，其对抗原结合或其他免疫球蛋白功能基本上无影 响。人源化的免疫球蛋白可以通过基因工程来构建(例如参见美国专利号5, 585, 089)。
[0063] 如本文所用，术语"重组人抗体"旨在包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的 所有的人抗体，诸如使用转染入宿主细胞内的重组表达载体表达的抗体；从重组、组合的人 抗体文库分离的抗体；从其为人免疫球蛋白基因转基因的动物分离的抗体；或通过涉及人 免疫球蛋白基因序列剪切为其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。 此类重组人抗体具有源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。在某些实施方案中， 然而，将此类重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用对人Ig序列转基因的动物时，为体内 体细胞诱变)，并因此该重组抗体的％和^区域的氨基酸序列是这样的序列，尽管来源于人 种系％和列或与其相关，但其并不天然存在于在体内人抗体种系所有组成成分中。所 有此类重组方法对于本领域普通技术人员是熟知的。
[0064] 如果包括抗体的抗原结合蛋白以高结合亲和力如测定为至少I X KT6 M、或至少1 X 10_7 Μ、或至少I X 10_8 Μ、或至少I X 10_9 Μ、或至少I X 10_1Q Μ、或至少I X 10_n M的 离解常数（Kd，或对应的Kb，如下文定义的）值结合抗原，则它"特异性地结合"抗原。特异 性结合目的人抗原的抗原结合蛋白还可以能够以相同或不同的亲和力结合来自其他物种 的相同的目的抗原。
[0065] "表位"是由抗原结合蛋白（例如由抗体）结合的分子的部分。表位可以包含分子 的非连续的部分(例如，在多肽中，在多肽的一级序列中不连续的但在所述多肽的三级或四 级结构的情况下彼此足够靠近使得被抗原结合蛋白所结合的氨基酸残基)。
[0066] 术语"多核苷酸"、"寡核苷酸"和"核酸"可以在全文中互换使用并且包括DNA分子 (例如，cDNA或基因组DNA )、RNA分子(例如，mRNA )、使用核苷酸类似物(例如，肽核酸和非天 然存在的核苷酸类似物)产生的DNA或RNA的类似物、及其杂化物。核酸分子可以为单链的 或双链的。在一个实施方案中，本发明的核酸分子包含编码本发明的抗体、或片段、衍生物、 突变蛋白、或其变体的连续的可读框。
[0067] 如果两条单链多核苷酸的序列可以以反平行方向排列从而使得一条多核苷酸中 的每一核苷酸与另一多核苷酸中的其互补核苷酸相对而不引入缺口并且在任一序列的5' 或3'端无未配对的核苷酸，则它们是"互补的"。如果两条多核苷酸可以在中等严格条件下 彼此杂交，则多核苷酸与另一条多核苷酸是"互补的"。因此，多核苷酸可以与另一多核苷酸 是互补的，而不是其补体。
[0068] "载体"是可以用于将与其连接的另一核酸引入细胞中的核酸。一种类型的载体是 "质粒"，其指另外的核酸区段可以连入其中的线性或环状双链的DNA分子。另一类型的载 体是病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其中另外的DNA区段 可以引入病毒基因组中。某些载体可以在它们导入其中的宿主细胞(例如包含细菌复制起 点的细菌载体和附加型哺乳动物载体）中自主复制。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载 体）在引入宿主细胞中时整合入宿主细胞的基因组中，并由此随宿主基因组进行复制。"表 达载体"是可以指导所选的多核苷酸表达的一类载体。
[0069] 如果调节序列影响核苷酸序列的表达(例如，表达的水平、时机或位置)，则所述和 核苷酸为"可操作地连接"至该调节序列。"调节序列"为影响与其可操作地连接的核酸的 表达(例如，表达的水平、时机或位置）的核酸。调节序列例如可以对被调节的核酸直接或 经过一种或多种其他分子的作用（例如，结合调节序列和/或该核酸的多肽）施加其作用。 调节序列的实例包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。调节 序列的进一步的实例描述于例如 Goeddel, 1990，Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif?和 Baron 等，1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06。
[0070] "宿主细胞"是可以用于表达核酸例如本发明的核酸的细胞。宿主细胞可以是原核 生物，例如大肠杆菌，或者它可以是真核生物，例如，单细胞的真核生物(例如酵母或其他真 菌)、植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如，人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大 鼠细胞、小鼠细胞、或昆虫细胞）或杂交瘤。通常，宿主细胞为培养的细胞，其可以用编码多 肽的核酸转化或转染，其可以随后在宿主细胞中表达。可以使用短语"重组宿主细胞"来表 示已用待表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞还可以是这样的细胞，其包含核酸， 但不在期望的水平上表达它，除非向宿主细胞中引入调节序列使得它变为与该核酸是可操 作地连接的。应理解术语宿主细胞不仅指具体的本发明的细胞还指此类细胞的后代或潜在 后代。因为由于例如突变或环境影响，某些修饰可以在继代中发生，所以此类后代实际上可 能与母细胞不相同，但仍包括在如本文所用的术语的范围内。
[0071] 肿瘤相关抗原和抗体 如本文所用的术语"抗原"指化合物、组合物、或物质，其可以刺激动物中抗体产生或T 细胞应答，包括注射入或吸收入动物中的组合物。抗原与特异性体液或细胞免疫的产物(包 括由异源免疫原诱导的那些）反应。术语"抗原"包括所有相关的抗原表位。表位可以由连 续的氨基酸或由于蛋白的三级折叠而紧靠的非连续氨基酸形成。由连续的氨基酸形成的表 位通常对变性溶剂保持暴露，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丧失。表 位通常包括至少三个、至少五个、或至少八至十个处于独特的空间构象的氨基酸。测定表位 的空间构型的方法包括例如X射线晶体学和二维核磁共振。
[0072] 至于"靶向的抗原"，事实上任何抗原可以被本发明的分子靶向。某些靶向的抗原 包括与特征在于细胞的过度增殖的病理学（即，过度增生性病症）相关的那些。示例性的 过度增生性病症包括但不限于银屑病、中性白细胞增多症、红细胞增多症、血小板增多和癌 症。表征为癌症的过度增生性病症包括但不限于实体瘤、乳腺癌、呼吸道癌、脑癌、生殖器官 癌、消化道癌、尿道癌、眼癌、肝癌、皮肤癌、头颈癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌及它们的远端转 移。这些病症还包括淋巴瘤、肉瘤、多发性骨髓瘤和白血病。乳腺癌的实例包括但不限于浸 润性导管癌、浸润性小叶癌、原位导管癌和原位小叶癌。呼吸道癌的实例包括但不限于小细 胞和非小细胞肺癌、以及支气管腺瘤和胸膜肺母细胞瘤。脑癌的实例包括但不限于脑干和 下丘脑（hypophtalmic)胶质瘤、小脑和大脑星形细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤以及神经 外胚层和松果体瘤。男性生殖器官肿瘤包括但不限于前列腺和睾丸癌。女性生殖器官肿瘤 包括但不限于子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌、阴道癌、和外阴癌、以及子宫肉瘤。消化道肿瘤 包括但不限于肛门癌、结肠癌、结肠直肠癌、食管癌、胆囊癌、胃癌、胰腺癌、直肠癌、小肠癌、 和唾液腺癌。尿道肿瘤包括但不限于膀胱癌、阴茎癌、肾癌、肾盂癌、输尿管癌、和尿道癌。目艮 癌包括但不限于眼内黑素瘤和视网膜母细胞瘤。肝癌的实例包括但不限于肝细胞癌（具有 或不具有纤维板层变体的肝细胞癌)、胆管癌(肝内胆管癌)、和混合型肝细胞胆管癌。皮肤 癌包括但不限于鳞状细胞癌、卡波济氏肉瘤、恶性黑素瘤、Merkel细胞皮肤癌和非黑素瘤皮 肤癌。淋巴瘤包括但不限于AIDS相关淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金 病、和中枢神经系统的淋巴瘤。肉瘤包括但不限于软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞 瘤、淋巴肉瘤、和横纹肌肉瘤。白血病包括但不限于急性髓细胞性白血病、急性成淋巴细胞 性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病和毛细胞白血病。
[0073] 在本发明的多个实施方案中，靶向部分是结合癌症标志物例如肿瘤相关抗原 (TAA)的部分。许多种癌症标志物是本领域技术人员已知的。癌症标志物对于癌细胞 需要不仅是独特的，而且还是有效的，其中癌症标志物的表达在癌细胞中（相比于正常健 康细胞）升高或者其中癌症标志物不以相当的水平存在于周围组织中（尤其是其中融合 分子局部递送)。在多种实施方案中，癌症标志物包括：Her2/neu (Lewis等，Semin. Cancer Biol.，6(6) :321-327, 1995)、Her3、EGF、Her4、B7 家族成员（Collins 等， Genome Biol.，6:223. 1-223. 7，2005)、TNF 超家族成员（参见例如 "Therapeutic Targets of the TNF SuperfamiIy^,由 Iqbal S. Grewal 编辑，Landes Bioscience/ Springer Science+Business Media, LLC dual imprint / Springer series:Advances in Experimental Medicine and Biology, 2009)、CD1、CD2、CD3、CD5、CD7、CD13、CD14、CD15、 CD19、CD20 (Cragg等，Curr. Dir. Autoimmun·, 8:140-174，2005)、CD21、CD23、CD25、CD33 (Nakase 等，Am J Clin Pathol·, 105(6):761-768, 1996)、CD34、CD38、CD46、CD55、CD59、 CD123、CD138 (O'Connell,等，Am. J. Clin. Pathol·，121(2):254-263, 2004)、CD200、 CD276 (Hofmeyer 等，Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S. A. ) 105 (30) :10277-10278, 2008)、 5E10、CEA、内质蛋白（美国专利申请号 US20120009194 (Ferrone 等））、HLA-DR、HM 1.24、 HMB 45、Ia、Leu-Ml、MUCl、PMSA、EGFR、鞘糖脂⑶2、SLAM家族成员、gpl00、酪氨酸酶、MAGE、 TAG-72、SE10、磷脂酰丝氨酸抗原等。本发明的基因工程融合分子可以结合一种抗原或多种 癌症标志物。
[0074] 针对这些和其他癌症标志物的抗体是本领域技术人员已知的并且可以商购获得 或容易地产生。例如，抗体可以通过用靶抗原或其免疫原性片段免疫动物并在该动物中 产生抗体来产生，并且单链抗体可以根据本领域技术人员熟知的方法使用噬菌体展示技术 来产生。考虑用作本发明的融合分子中的靶向部分的抗体包括针对特定肿瘤相关抗原的 消耗性抗体（depleting antibodies)，包括但不限于抗 _HER2/neu、抗-HER3、抗-HER4、 抗-CD20、抗-CD19、抗-CD22、抗-CD33、抗-CXCR3、抗-CXCR5、抗-CCR3、抗-CCR4、抗-CCR9、 抗-CRTH2、抗-PMCH、抗-CD4、抗-CD25、抗-CD200、抗-CD138、抗-CD276 和抗-内质蛋白抗 体。所述此类肿瘤和炎症细胞特异性的、消耗性抗体已充分描述于文献中。
[0075] 在多个实施方案中，抗体是抗-Her2/neu抗体，其包含具有如SEQ ID NO: 1中描 述的氨基酸序列的重链：

【权利要求】
1. 基因工程融合分子，其包含连接至干扰素α(IFN-α)突变体分子的肿瘤相关抗原 (TAA)抗体（Ab)，其中所述抗体直接连接至所述IFN-α突变体分子。
2. 权利要求1的融合分子，其中所述融合分子相比于TAAAb-野生型IFN-α融合分子 显示改进的PK特性。
3. 权利要求1的融合分子，其中所述融合分子当接触肿瘤细胞时，导致杀伤所述肿瘤 细胞或抑制其生长或增殖。
4. 权利要求1-3中任一项的融合分子，其中所述干扰素突变体分子包含在 SEQIDNO: 13中含有至少一个突变的突变的人IFN-a2分子，其中所述突变选自 H57Y.E58N.Q61S. II57S. E58S. Ι157Λ. Ε58Λ.〇C>IA.RlMA.RlfOA,IMA.P35K. HI65D. Ι.26Λ. 1.Ι35Λ. A145V;及其组合。
5. 权利要求1-4中任一项的融合分子，其中所述TAA抗体为选自以下的抗体： 抗-HER2/neu、抗-HER3、抗-HER4、抗-CD4、抗-CD19、抗-CD20、抗-CD22、抗-CD25、抗-CD33、 抗-CD138、抗-CD200、抗-CD276、抗-CXCR3、抗-CXCR5、抗-CCR3、抗-CCR4、抗-CCR9、 抗-CRTH2、抗-PMCH、和抗-内质蛋白抗体。
6. 权利要求1-5中任一项的融合分子，其中所述TAA抗体为选自以下的抗体：完全人 抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、抗原结合抗体片段、Fab、 Fab'、Fab2、Fab' 2、IgG、IgM、IgA、IgE、scFv、dsFv、dAb、纳米抗体、单抗体、和双价抗体。
7. 权利要求1的融合分子，其中所述TAA抗体为抗-HER2/neu抗体，并且其中所述突变 的人IFN-α2分子在SEQIDNO: 13中包含突变F27A。
8. 权利要求1的融合分子，其中所述TAA抗体为抗-CD20抗体，并且其中所述突变的人 IFN-α2分子在SEQIDNO: 13中包含突变F27A。
9. 权利要求1的融合分子，其中所述TAA抗体为抗-CD138抗体，并且其中所述突变的 人IFN-α2分子在SEQIDNO: 13中包含突变F27A。
10. 权利要求1的融合分子，其中所述TAA抗体为抗-内质蛋白抗体，并且其中所述突 变的人IFN-α2分子在SEQIDNO: 13中包含突变F27A。
11. 权利要求1的融合分子，其中所述TAA抗体为抗-CD33抗体，并且其中所述突变的 人IFN-α2分子在SEQIDNO: 13中包含突变F27A。
12. 权利要求1的融合分子，其中所述TAA抗体为抗-CD276抗体，并且其中所述突变的 人IFN-α2分子在SEQIDNO: 13中包含突变F27A。
13. 权利要求1的融合分子，其中所述TAA抗体为抗-HER2/neu抗体，并且其中所述突 变的人IFN-α2分子在SEQIDNO: 13中包含两个突变R149A和R162A。
14. 权利要求1的融合分子，其中所述TAA抗体为抗-CD20抗体，并且其中所述突变的 人IFN-α2分子在SEQIDNO: 13中包含两个突变R149A和R162A。
15. 权利要求1的融合分子，其中所述TAA抗体为抗-CD138抗体，并且其中所述突变的 人IFN-α2分子在SEQIDNO: 13中包含两个突变R149A和R162A。
16. 权利要求1的融合分子，其中所述TAA抗体为抗-内质蛋白抗体，并且其中所述突 变的人IFN-α2分子在SEQIDNO: 13中包含两个突变R149A和R162A。
17. 权利要求1的融合分子，其中所述TAA抗体为抗-CD33抗体，并且其中所述突变的 人IFN-α2分子在SEQIDNO: 13中包含两个突变R149A和R162A。
18. 权利要求1的融合分子，其中所述TAA抗体为抗-CD276抗体，并且其中所述突变的 人IFN-α2分子在SEQIDNO: 13中包含两个突变R149A和R162A。
19. 权利要求1-18中任一项的融合分子，其中所述抗体用肽接头直接连接至所述干扰 素突变体分子。
20. 权利要求19的融合分子，其中所述肽接头选自SGGGGS和AEAAAKEAAAKAGS。
21. 药物组合物，其包含在药学上可接受的载体中的权利要求1-20中任一项的融合分 子。
22. 权利要求21的药物组合物，其中配制所述组合物用于经选自以下的途径来施用： 口服施用、肌内施用、静脉内施用、直接肿瘤施用、吸入、经皮施用、和皮下储存施用。
23. 治疗患者中的肿瘤或肿瘤转移的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量(作为单 一疗法或作为联合治疗方案的部分）的权利要求21的药物组合物，其中此类施用促进肿瘤 消退和/或肿瘤死亡。
24. 权利要求1-20中任一项的融合分子在制造用于杀伤癌细胞或抑制其生长或增殖 的药物中的用途。
【文档编号】A61K38/21GK104470536SQ201380023287
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年3月4日 优先权日:2012年3月3日
【发明者】伊克巴尔·格雷沃, 桑杰伊·D·卡雷, 迈克尔·格雷瑟, 拉希德·赛伊德 申请人:免疫基因公司