硼替佐米在制备预防或治疗骨巨细胞瘤药物中的应用的利记博彩app

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【专利摘要】本发明属于医药【技术领域】。本发明提供了硼替佐米在预防或治疗骨巨细胞瘤（giant?cell?tumor?of?bone,GCTB）药物中的应用。本发明从体外细胞培养和体内动物实验两个方面，研究硼替佐米对GCTB的治疗作用，并从分子水平探讨其可能的作用机制，实验结果显示硼替佐米能够抑制GCTB破骨细胞的形成和骨片的吸收，诱导基质细胞凋亡，抑制基质细胞的增殖。
【专利说明】硼替佐米在制备预防或治疗骨巨细胞瘤药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药【技术领域】，具体涉及硼替佐米在预防或治疗骨巨细胞瘤药物中的应用。
【背景技术】
[0002]骨巨细胞瘤(giant cell tumor of bone, GCTB)为骨组织原发性、侵袭性肿瘤，好发生于四肢和脊柱，时常因侵袭性、溶骨性破坏，导致病理性骨折、椎节不稳、神经功能损伤甚至截瘫等临床症状严重损害患者健康(Shikata J., Yamamuro T., Shimizu K., etal.Surgical treatment of giant-cell tumors of the spine[J].Clin Orthop RelatRes, 1992,3(278):29-36.)。GCTB在我国的发病率较高，占全部骨肿瘤的20%左右，其中干飯段是 GCTB 好发部位之一 (Sung H.ff., Kuo D.P., Shu W.P., et al.Giant-cell tumorof bone:analysis of two hundred and eight cases in Chinese patients[J].J BoneJoint Surg Am，1982,64(5):755-761.)。GCTB是由单核细胞、多核的巨细胞以及基质细胞三种细胞共同组成。其中，基质细胞被认为是GCTB的肿瘤成分。它具有在体外无限增殖的能力；并可向多种细胞分化，比如成骨细胞、脂肪细胞等；还可以通过分泌多种细胞因子，如SDF-1、M-CSF、RANKL等募集单核细胞，促进单核细胞向多核的巨细胞分化，进而导致多核巨细胞活化，引起溶骨性的病理损伤。虽然GCTB的致死率不高，但其具有较强的侵袭性和较高的复发性，术后局部复发率高达50-70%，还有少部分患者可出现恶性病变和肺部转移(Hart R.A., Bori ani S., Biagini R., et al.A system for surgical staging andmanagement of spine tumors.A clinical outcome study of giant cell tumors of thespine [J].Spine (Phila Pal976)，1997，22 (15): 1773-1782; discussionl783.)。对于 GCTB术后复发的患者，由于局部解剖结构的改变、肿瘤恶性程度的升级，使得再次手术切除的难度明显加大，甚至无法进行手 术。因此，治疗GCTB已成为肿瘤外科领域的一大难题，亟需探寻新的治疗方法。
[0003]目前用于治疗GCTB的药物有双磷酸盐和地诺单抗，其中地诺单抗正在进行临床2 期实验(Balke M., Campanacci L., Gebert C., et al.Bisphosphonate treatment ofaggressive primary, recurrent and metastatic Giant Cell Tumour of Bone[J].BMCCancer, 2010, 10(462):1-8.Thomas D., Henshaw R., Skubitz K., et al.Denosumab inpatients with giant-cell tumour of bone:an open-label, phase2study[J].LancetOncol, 2010, 11 (3):275-280.)。但以上两种药物仅是针对破骨细胞起作用，而对肿瘤成分的基质细胞并没有明显的抑制作用。
[0004]硼替佐米(英文名:Bortezomib，CAS登记号:179324_69_7)，是哺乳动物细胞中26S蛋白酶体糜蛋白酶样活性的可逆抑制剂，目前主要应用于治疗多发性骨髓瘤的药物。它通过核转录因子-KB (NF-KB)信号通路，抑制肿瘤细胞内蛋白抑制因子1-KBa的泛素化，增加其胞内浓度，从而降低NF- K B活性，抑制肿瘤细胞的生长；其次，硼替佐米还可通过上调P53 (最重要的抑癌基因之一)的表达，从而抑制细胞周期；并上调细胞内前凋亡因子NOXA的表达，同时激活Caspase信号通路，诱导细胞凋亡。硼替佐米还通过阻止细胞因子循环和细胞黏附影响骨髓微环境，抑制多发性骨髓瘤患者骨髓的内皮细胞生长，从而减少月中瘤血管新生(Adams J.The development of proteasome inhibitors as anticancerdrugs[J].Cancer Cell, 2004，5(5):417-421.)。
[0005]多发性骨髓瘤是一种起源于B细胞系的恶性肿瘤，其特征为产生单克隆免疫球蛋白的异常浆细胞增多，并在骨髓内恶性增殖，引起骨折和骨髓功能衰竭，其属于血液性肿瘤。而GCTB是一种由增殖性基质细胞和破骨细胞样多核巨细胞构成的具有局部复发倾向的侵袭性、原发性骨肿瘤。两种肿瘤的发病机制、诊断标准以及临床特征存在较大的差异(Palumbo A, Anderson K.Multiple myeloma[J].N Engl J Med, 2011, 364(11):1046-1060.Salerno M., Avnet S., Alberghini M., et al.Histogenetic characterization of giantcell tumor of bone [J].Clin Orthop Relat Res, 2008，466 (9): 2081-2091.)。已有的文献和诊疗指南报道，用于治疗多发性骨髓瘤的药物主要有:免疫调节剂(沙利度胺)、蛋白酶体抑制剂(硼替佐米、卡非佐米等)、法尼基转移酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、热休克蛋白抑制剂等；而用于治疗GCTB的药物目前只有双磷酸盐和地诺单抗。目前治疗多发性骨髓瘤和GCTB的治疗药物之间没有存在相互通用的文献报道和临床实践。
[0006]目前尚未有任何文献报道硼替佐米具有治疗GCTB中的作用；以及通过体内和体外实验研究，证明硼替佐米能够抑制GCTB细胞的生长、破骨细胞的形成和骨破坏。

【发明内容】

[0007]本发明的目的在于提供硼替佐米的新用途，特别是在预防或治疗骨巨细胞瘤(GCTB)药物中的应用。
[0008]本发明人在前期的实验中，通过血清酶联免疫吸附法检测和免疫组织化学分析，发现GCTB的泛素-蛋白酶体通路(ubiquitin-proteasome pathway, UPP)过度活化；进一步，通过药物筛选，发现硼替佐米(Bortezomib)具有较好的抑制GTCB原代细胞增殖的作用。
[0009]本发明人在药物筛选过程中，同时选择了小菊内酯、硼替佐米、吡咯烷二硫代氨基甲酸等UPP信号通路抑制剂，仅发现硼替佐米具有较好的抑制GTCB原代细胞增殖的作用。
[0010]本发明从体外细胞培养和体内动物实验两个方面，研究硼替佐米对GCTB的治疗作用，并从分子水平探讨其可能的作用机制。
[0011]本发明人通过实验发现，硼替佐米能够抑制GCTB破骨细胞的形成和骨片的吸收，并能诱导基质细胞凋亡，从而抑制基质细胞的增殖。动物实验进一步证明，硼替佐米能明显抑制人GCTB原代细胞在胫骨内的生长和骨质破坏。本发明涉及治疗或/和预防人GCTB及其某些并发症的方法，该方法包含给予需要治疗的患者有效、无毒且药学上可接受量的硼替佐米。硼替佐米对GCTB的破骨细胞形成具有良好的抑制作用，对GCTB基质细胞的增殖抑制作用具有较好的选择性，能明显诱导基质细胞凋亡，对GCTB在骨环境中的骨破坏能力有明显抑制作用。
[0012]本发明提供了硼替佐米在制备预防或治疗骨巨细胞瘤(GCTB)药物中的应用。
[0013]本发明所述的硼替佐米在制备预防或治疗骨巨细胞瘤(GCTB)药物中的应用，具体指硼替佐米能够抑制GCTB破骨细胞的形成和骨片的吸收，诱导基质细胞凋亡，抑制基质细胞的增殖。
[0014]本发明所述的硼替佐米是指各种形式的硼替佐米及其衍生物。
[0015]本发明所述的硼替佐米为注射剂，给药方式包括:静脉、局部给药等。
[0016]本发明所述的GCTB细胞具体指从患者肿瘤组织中分离得到的人GCTB原代细胞。
[0017]本发明为硼替佐米提供了一种新用途。
[0018]本发明也为GCTB的预防和治疗提供了新的思路。
【专利附图】

【附图说明】
[0019]图1:在体外，硼替佐米对不同患者的GCTB原代细胞均具有明显的抑制作用。
[0020]其中A为硼替佐米处理72小时后，GCTB原代细胞的形态和数量改变，B为磺酰罗丹明B (Sulforhodamine B, SRB)比色法检测硼替佐米处理72小时后，GCTB基质细胞和正常人成骨细胞的存活情况。由图可见，GCTB细胞经过硼替佐米处理后，其细胞活性明显下降，并呈现浓度依赖性。
[0021]图2:硼替佐米能明显诱导GCTB基质细胞凋亡。
[0022]其中，A为硼替佐米作用48小时后，基质细胞经Annexin V/PI染色，采用流式细胞仪分析细胞的凋亡情况；B为凋亡细胞百分比的统计结果；由图可见，硼替佐米处理后GCTB基质细胞凋亡发生的比例明显升高(右下和右上象限)；C为免疫印迹法检测凋亡相关蛋白的表达水平，发现硼替佐米处理后GCTB基质细胞凋亡相关的PARP、caspase-3剪切体(cleavage PARP、cleavage caspase-3)表达量升高。
[0023]图3:硼替佐米能明显抑制T`NF- α诱导GCTB基质细胞NF- κ B下游蛋白的表达和Ρ65的入核。
[0024]其中A为硼替佐米抑制TNF- α诱导的I κ B- α的降解；Β为基质细胞经TNF- α诱导和硼替佐米处理后，细胞核和细胞质中Ρ65的分布差异，可见基质细胞经硼替佐米处理后Ρ65的入核明显减少；C为基质细胞经硼替佐米处理后，NF-kB下游凋亡蛋白的表达差异，可见抗凋亡的蛋白表达水平下降；D为基质细胞经TNF-α诱导Ρ65的入核免疫荧光染色及硼替佐米抑制Ρ65入核的作用；Ε为293Τ细胞转染NF- κ B Iuciferase报告基因后，经TNF-α诱导后的表达情况和硼替佐米的抑制作用，进一步证实了，硼替佐米能够抑制TNF- α诱导的NF- κ B信号通路的活化。
[0025]图4:硼替佐米能明显抑制GCTB原代细胞破骨细胞的形成及其在骨片的骨吸收。
[0026]其中A为GCTB原代细胞经不同浓度硼替佐米处理后的TRAP染色、骨片吸收面积及吸收深度为GCTB原代细胞经不同浓度硼替佐米处理48小时后，TRAP阳性细胞数目的统计差异；C为骨片吸收深度的统计学差异。由图可见，硼替佐米能抑制原代GCTB的破骨细胞形成和骨质吸收。
[0027]图5:硼替佐米能明显抑制GCTB条件培养基诱导的破骨细胞形成。
[0028]其中A为经过不同浓度硼替佐米处理后的GCTB基质细胞条件培养基(conditionmedia, CM)诱导小鼠骨髓单核细胞(bone marrow-derived macrophages, BMM)向破骨细胞分化情况为TRAP阳性细胞数目的统计差异。由图可见，经过GCTB基质细胞条件培养基诱导后，BMM向破骨细胞分化的数目增多,而经过硼替佐米处理后其诱导BMM向破骨细胞分化的数目明显减少。[0029]图6:硼替佐米能明显抑制GCTB诱导BMM的迁移和迁移相关基因的表达。
[0030]其中A为GCTB原代细胞诱导BMM迁移实验(transwell实验)；B为transwell实验的迁移细胞计数统计图；C、D、E和F分别为迁移相关基因SDF-1、VEGF、MCP-1和MMP-9的表达情况；由图可见，硼替佐米能抑制GCTB原代细胞诱导的BMM细胞迁移，和GCTB原代细胞的迁移相关基因表达，并呈浓度依赖关系。
[0031]图7:硼替佐米能明显抑制GCTB原代细胞在裸鼠胫骨内的生长和骨破坏。
[0032]其中A为GCTB原代细胞注射到裸鼠胫骨后及药物治疗的骨质破坏和肿瘤细胞凋亡情况为三组裸鼠的体重变化情况；C为X-ray观察后裸鼠胫骨骨损伤面积的统计结果；D STUNEL检测裸鼠胫骨损伤部位的肿瘤细胞凋亡情况。由图可见，将GCTB原代细胞注射到裸鼠胫骨内可引起明显的骨损伤，而硼替佐米能够减少GCTB原代细胞引起的骨损伤，促进肿瘤细胞的凋亡，并且没有明显的毒副作用。
【具体实施方式】
[0033]下面结合附图和实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0034]实施例所用的硼替佐米(Bortezomib,商品名:万河，Velcade),生产厂商为意大利 BSP Pharmaceuticals S.r.1.,分包装企业为比利时 Janssen pharmaceutica N.V.或西安杨森制药有限公司；剂型为注射剂，规格为1.0mg/瓶或3.5mg/瓶。采用二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)将硼替佐米稀释成不同浓度的药物溶液。
[0035]实施例所用的GCTB细胞是从上海长征医院临床确诊为骨巨细胞瘤患者的肿瘤组织中分离得到的人GCTB原代细胞。GCTB破骨细胞和基质细胞的分离方法参考Smink 等提供的方法(Smink JJ, Tunn PU, Leutz A.Rapamycin inhibits osteoclastformation in giant cell tumor of bone through the C/EBPbeta-MafB axis[J].J MolMed(Berl).2013, 90(1):25-30.)。
[0036]实施例1.硼替佐米对人骨巨细胞瘤基质细胞体外生长的抑制作用。
[0037]将处于对数生长期的GCTB基质细胞以5X IO3细胞/孔的密度接种于96孔板中，贴壁24小时后更换为含有不同浓度硼替佐米的完全培养基(GIBC0公司的α-ΜΕΜ，10%胎牛血清，1%的青-链霉素)，以未加硼替佐米组为空白对照，硼替佐米分别设5nM、IOnM,20nM.40nM.80nM五个浓度组，于药物干预72小时后，采用磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B, SRB)比色法检测细胞的增殖情况(Voigt ff.Sulforhodamine B assayand chemosensitivity[J].Methods in molecular medicine.2005;110:39-48.X
[0038]结果如图1所示，硼替佐米对不同患者GCTB基质细胞的增殖，均具有明显的抑制作用；而且随着硼替佐米浓度的升高，其对GCTB基质细胞的增殖抑制作用逐渐增强。该实验结果表明，在体外硼替佐米对GCTB基质细胞的增殖具有明显抑制作用。
[0039]实施例2.硼替佐米诱导GCTB基质细胞凋亡的作用。
[0040]一、流式细胞仪检测基质细胞凋亡情况:
[0041]将处于对数生长期的不同人GCTB基质细胞，以IX IO4个/ml的细胞密度接种于6孔板中，贴壁24小时后更换为含有硼替佐米(设10nM、20nM和40nM三个浓度)的完全培养基，以未加任何刺激的细胞组为空白对照。细胞培养箱中培养48小时，0.25%胰酶细胞消化液(Trypsin-EDTA Solution)消化细胞，1000rpm离心5min,经膜联蛋白A5-绿色突光素/碘化丙啶(Annexin V/PI)细胞凋亡检测试剂盒避光染色15min后，采用流式细胞仪检测GCTB基质细胞的凋亡情况。结果如图2A、B所示:流式细胞仪结果显示，经硼替佐米处理后凋亡的基质细胞百分比明显升高(右侧上、下两个象限之和)。
[0042]二、凋亡相关蛋白的表达情况:
[0043]将处于对数生长期的GCTB基质细胞，以I X IO4个/ml的细胞密度接种于6孔板中，贴壁24小时后更换为含有硼替佐米(设10nM、20nM和40nM三个浓度)的完全培养基，以未加任何刺激的细胞组为空白对照。细胞培养箱中培养48小时，采用RIPA (放射免疫测定法，radio immunoprecipitation assay,购自碧云天生物技术有限公司)裂解细胞,收集细胞蛋白，通过蛋白印迹法(western blot)检测凋亡蛋白PARP和caspase-3切割形式(cleaved PARP and cleaved caspase-3)的表达情况。结果如图 2C 所不:cleaved PARP和cleaved caspase-3的表达量随着硼替佐米浓度的升高而逐渐增加。
[0044]流式细胞仪分析的细胞凋亡数目和蛋白印迹法检测的凋亡蛋白表达结果，均表明硼替佐米能够诱导基质细胞凋亡和促进凋亡蛋白的表达，证明硼替佐米具有诱导GCTB基质细胞凋亡的作用，并呈浓度依赖性。
[0045]实施例3.硼替佐米抑制TNF- α诱导GCTB基质细胞NF- κ B下游蛋白表达和Ρ65入核的作用。
[0046]一、NF- κ B信号通路关键蛋白I κ B- α和ρ65的表达情况:
[0047]将处于对数生长期的GCTB基质细胞以I X IO4个/ml的细胞密度接种于6孔板中，贴壁24小时后更换为含有20nM硼替佐米，以未加任何刺激的细胞组为空白对照，其他组给予0.2nM TNF-α刺激，于TNF-α刺激后的0、5、10、15、30、60分钟后，采用RIPA裂解细胞，收集细胞蛋白，以及按“核质分离”方法分别收集细胞质和细胞核内的蛋白，通过蛋白印迹法检测I κ B- α和Ρ65的分`布，观察硼替佐米抑制TNF- α诱导NF- κ B下游蛋白表达的时间梯度关系。结果如图3Α、Β所示，硼替佐米能抑制ΙκΒ-α的降解，减少Ρ65入核。
[0048]二、NF- κ B信号通路下游凋亡蛋白的表达情况:
[0049]将处于对数生长期的人骨巨细胞瘤基质细胞以I X IO4个/ml的细胞密度接种于6孔板中，贴壁24小时后更换为含有20nM硼替佐米，以未加任何刺激的细胞组为空白对照，其他组给予0.2nM TNF-α刺激，于TNF-α刺激后的12、24、36、48小时后，采用RIPA裂解细胞，收集细胞蛋白，通过蛋白印迹法检测NF-κ B下游抑制凋亡相关蛋白的表达。结果如图3C所示，硼替佐米能减少抗凋亡蛋白XIAP、c-1AP-l、c-1AP-2、C-FILP、BCL-xl、BCL-2的表达。
[0050]三、P65的入核情况:
[0051]将处于对数生长期的GCTB基质细胞以5 X IO3个/孔的细胞密度接种于预先铺有盖玻片的24孔板中，贴壁24小时后更换为含有硼替佐米的培养基(设10nM、20nM和40nM三个浓度)，以未加任何刺激的细胞组为空白对照，单加TNF- α刺激的为阳性对照，其他组给予0.2nM TNF-α刺激5分钟，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定10分钟，0.l%Triton X-100通透5分钟，封闭液封闭30分钟，P65 一抗孵育过夜，二抗37°C孵育I小时，DAPI复染，荧光显微镜拍照观察。结果如图3D所示，GCTB基质细胞经TNF- α刺激后Ρ65的入核明显增加，经硼替佐米处理后Ρ65入核数量明显减少。
[0052]四、NF-κ B Iuciferase报告基因的表达情况:[0053]将NF-κ B Iuciferase报告基因转染到293T细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)上，贴壁24小时后更换为含有硼替佐米(设5nM、10nM、20nM、40nM和80nM五个浓度)的培养基预处理4小时，以未加任何刺激的细胞组为空白对照，单加TNF-α刺激的为阳性对照，其他组给予0.2nM TNF-α刺激5分钟，采用luciferase assay kit(promega)裂解、检测荧光素梅的表达差异。结果如图3E所示，293T细胞经TNF- α刺激后NF-kB luciferase报告基因明显升高，硼替佐米能显著抑制NF-κ B luciferase报告基因的表达，而且随着硼替佐米浓度的增加，其抑制作用逐渐增强。
[0054]实施例4.硼替佐米能明显抑制GCTB原代细胞中破骨细胞的形成和在骨片的骨吸收。
[0055]一、破骨细胞形成数目的影响:
[0056]将从新鲜肿瘤标本中分离得到的GCTB原代细胞，按2X IO4个/孔的细胞密度接种于48孔板，并给予不同浓度的硼替佐米(0、2.5、5、7.5、IOnM)处理48小时后，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定10分钟，经0.l%TritonX-100通透5分钟，PBST处理20分钟，TRAP染液(抗酒石酸酸性憐酸酶，tartrate-resistant acid phosphate,购自Sigma公司)37°C染色60分钟，去除TRAP染液，PBS清洗2次，倒置显微镜拍照计数，统计TRAP阳性的细胞数目。
[0057]二、骨吸收面积和骨吸收深度分析:
[0058]将从新鲜肿瘤标本中分离得到的GCTB原代细胞，按I X IO4个/孔的细胞密度接种于预先铺好骨片的96孔板，并给予不同浓度的硼替佐米(0、2.5、5、7.5、10nM)处理48小时后，采用IM氨水破裂细胞I分钟，4%戊二醛固定5分钟，1%甲苯胺蓝染色5分钟，倒置显微镜和激光共聚焦显微镜拍照、测量。
[0059]结果如图4所示，GCTB原代细胞经硼替佐米处理后，破骨细胞的形成数目明显减少，而且在骨片上形成的蚀骨面积和深度减轻。该实验结果，表明硼替佐米具有抑制GCTB破骨细胞形成和骨质吸收的作用。
[0060]实施例5.硼替佐米能明显抑制GCTB条件培养基诱导的破骨细胞形成。
[0061]收集经过不同浓度硼替佐米(0、2.5、5、7.5、10nM)处理48小时后的GCTB基质细胞条件培养基(condition medium，CM)，-80°C冰箱保存备用。按5X IO3个/孔的细胞密度，将BMM (Bone Marrow-Derived Macrophages,骨髓单核细胞)接种于96孔板，贴壁24小时后换成含10%CM的培养基，每两天换液一次，诱导培养4-5天后，4%多聚甲醛固定lOmin，经
0.l%Triton X-100通透5分钟，PBST处理20分钟，采用TRAP染液37°C染色60分钟，去除TRAP染液，PBS清洗2次，倒置显微镜拍照计数。结果如图5所示:GCTB基质细胞条件培养基可明显诱导BMM细胞向TRAP阳性的破骨细胞分化，而硼替佐米处理后的条件培养基能减少破骨细胞的形成，并呈浓度梯度依赖性。该实验结果，进一步证明硼替佐米具有抑制GCTB诱导破骨细胞形成的作用。
[0062]实施例6.硼替佐米能明显抑制GCTB诱导BMM的迁移和迁移相关基因的表达。
[0063]将GCTB原代细胞或人成纤维细胞系(hFOBl.19)按2 X IO4个/孔的细胞密度接种于24孔板，贴壁24小时后换成含有硼替佐米的培养基(设2.5nM、5nM、7.5nM和IOnM四个浓度)，以未加任何刺激的细胞组为空白对照，预处理24小时后，在transwell小室上层加入5X IO4个/孔的BMM，培养箱培养20小时后，经4%多聚甲醛固定10分钟，2%结晶紫染色10分钟后，倒置显微镜拍照、计数统计穿过小室的BMM数目。结果如图6A、B所示:GCTB原代细胞能明显促进BMM细胞迁移；而经硼替佐米处理后，GCTB原代细胞诱导BMM迁移的作用明显减弱。
[0064]将GCTB原代细胞按5X IO4个/孔的细胞密度接种于12孔板，贴壁24小时后换成含有硼替佐米的培养基(设2.5nM、5nM、7.5nM和IOnM四个浓度)，以未加任何刺激的细胞组为空白对照，硼替佐米处理24小时后，采用Trizol抽提细胞的总RNA，经逆转录和real-time PCR检测迁移相关基因SDF-1、VEGF、MCP-1和MMP-9的表达情况。结果如图6C、
D、E、F所示:硼替佐米能抑制骨巨细胞瘤细胞迁移相关基因SDF-1、VEGF、MCP-1和MMP-9的表达。该实验结果，表明硼替佐米能够抑制GCTB原代细胞表达募集单核细胞的细胞因子。
[0065]实施例7.硼替佐米能明显抑制GCTB原代细胞在裸鼠胫骨内的生长和骨破坏。
[0066]收集新鲜的GCTB肿瘤标本，采用胶原酶消化法分离GCTB原代细胞，经滤网(直径=40um)过滤收集单细胞悬液，800rmp离心5分钟，血细胞计数器计数后，采用PBS重悬，使细胞终浓度为5XlO4AAil GCTB原代细胞。采用眼科剪剪开裸鼠膝关节处皮肤，暴露胫骨，在X线观察下将显微注射器针头插入裸鼠胫骨内，缓慢地将20ul上述GCTB原代细胞注射到裸鼠的胫骨髓腔内。经X-ray观察模型成功后，按胫骨损伤面积排序，随机分为模型组、唑来膦酸组和硼替佐米组，分别给予0.lmg/kg的唑来膦酸和0.3mg/kg的硼替佐米。唑来膦酸每周给药一次，硼替佐米每3天给药一次，定期采用X-ray观察胫骨的骨损伤情况和肿瘤大小以及肿瘤细胞的凋亡情况。连续给药3个月后取出胫骨，经micro-CT、HE及TUNEL染色观察骨损伤体积、肿瘤大小、肿瘤细胞的凋亡数目。
[0067]结果如图7所示 :将GCTB原代细胞注射到裸鼠胫骨髓腔内可引起明显的溶骨性损伤；经过硼替佐米治疗后可减轻骨损伤程度，而且肿瘤细胞凋亡数目明显增多。该实验结果表明硼替佐米具有治疗GCTB的作用。
[0068]以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
【权利要求】
1.硼替佐米在制备预防或治疗骨巨细胞瘤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的硼替佐米在制备预防或治疗骨巨细胞瘤药物中的应用，其特征在于，该应用是指硼替佐米能够抑制骨巨细胞瘤破骨细胞的形成和骨片的吸收，诱导基质细胞凋亡，抑制基质细胞的增殖。
3.根据权利要求1所述的硼替佐米在制备预防或治疗骨巨细胞瘤药物中的应用，其特征在于，所述的硼替佐米是指各种形式的硼替佐米及其衍生物。
4.根据权利要求1所述的硼替佐米在制备预防或治疗骨巨细胞瘤药物中的应用，其特征在于，所述的硼替佐米为注射剂。
5.根据权利要求4所述的硼替佐米在制备预防或治疗骨巨细胞瘤药物中的应用，其特征在于，所述的硼替佐米的给药方`式为静脉给药或局部给药。
【文档编号】A61K31/69GK103690927SQ201310717855
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月23日 优先权日:2013年12月23日
【发明者】肖建如, 刘明耀, 罗剑, 金蓉蓉, 徐乐勤, 杨兴海, 吴志鹏, 万维, 蔡小攀 申请人:中国人民解放军第二军医大学, 华东师范大学