N-硝基-l-精氨酸甲酯的用途
【专利摘要】本发明公开了一种N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途，属于生物医学【技术领域】。本发明以NMDA诱导皮层神经元损伤，建立兴奋性神经毒性模型，结果显示，N-硝基-L-精氨酸甲酯可通过降低NOS的活性，减少NO的生成，从而降低NO及其衍生物的毒性作用；通过升高Bcl-2mRNA及蛋白的表达，降低Bax?mRNA及蛋白的表达水平，拮抗NMDA的诱导的神经细胞凋亡，进一步说明N-硝基-L-精氨酸甲酯在NMDA诱导的神经细胞凋亡中起重要的保护作用。
【专利说明】N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途，具体涉及N-硝基-L-精氨酸甲酯在制备治疗中枢神经系统神经元兴奋毒性损伤药物方面的应用，属于生物医学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]谷氨酸是哺乳类动物中枢神经系统中主要的神经递质，NMDA受体是中枢神经系统主要的谷氨酸受体之一。NMDA介导的信号途径在神经元生存及突触的可塑性形成中发挥着至关重要的作用。体内外的研究显示高浓度的谷氨酸可促使神经元损伤，谷氨酸的神经毒性通过激活细胞表面不同的谷氨酸受体，从而诱发不同的细胞内信号。在谷氨酸诱发中枢神经系统神经元兴奋毒性损伤中，NMDA受体的过度激活是一个关键的早期步骤。NMDA受体持续性激活，可进一步激活N0S而产生N0。作为合成N0的限速酶，NOS的含量决定着N0对细胞的损伤，当大量NMDA与NMDA受体结合,可导致|丐离子的大量内流，进而激活|丐依赖的N0S，使得N0S合成的N0显著增加，而介导兴奋性毒性作用。 [0003]在神经系统中，N0在学习、记忆和调控基因表达等多种重要生理功能中发挥着重要作用，是一种重要的信使分子。过量的N0具有神经毒性，与其衍生物产生的毒性作用可导致神经细胞死亡。N0通过上调Bax，Bax的移位及对线粒体外膜通透性的改变导致细胞凋亡，N0诱导的细胞凋亡可通过Bcl-2和Bax蛋白表达的变化而发挥作用。
[0004]在多种死亡信号诱导细胞凋亡中Bcl-2家族蛋白都发挥着重要的作用。其中主要调节细胞凋亡是Bcl-2与Bax，Bcl-2是一种具有抑制细胞凋亡作用的因子，其通过中和促凋亡物质、抑制促凋亡物质的释放等抑制神经元凋亡；而Bax可促进细胞凋亡。在凋亡调节过程中Bcl-2蛋白和Bax蛋白通过结合为二聚体而发挥作用，且二者作用相拮抗。Bcl-2蛋白表达减少或Bax蛋白表达增加时，促使细胞发生凋亡；而Bcl-2蛋白表达增加或Bax蛋白表达减少时，则抑制细胞凋亡。例如，在Αβ25_35诱导的PC12细胞凋亡中，Bcl-2mRNA及蛋白表达下降，而Bax mRNA及蛋白表达升高。而CXCL12可通过上调Bcl_2的表达，下调Bax表达而发挥对神经元凋亡的保护作用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途。
[0006]为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是:
[0007]N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途，具体为N-硝基-L-精氨酸甲酯在制备治疗中枢神经系统神经元兴奋毒性损伤的药物方面的应用。
[0008]进一步的，N-硝基-L-精氨酸甲酯在制备治疗由谷氨酸介导的中枢神经系统神经元兴奋毒性损伤的药物方面的应用；N-硝基-L-精氨酸甲酯在制备治疗由N-甲基-D-天门冬氨酸介导的中枢神经系统神经元兴奋毒性损伤的药物方面的应用。
[0009]更进一步的，N-硝基-L-精氨酸甲酯在制备降低N0S活性的药物方面的应用。
[0010]N-硝基-L-精氨酸甲酯在制备提高抗凋亡蛋白Bcl-2抑制凋亡活性的药物方面的应用；具体为N-硝基-L-精氨酸甲酯在制备提高Bcl-2mRNA及蛋白表达水平的药物方面的应用。
[0011]N-硝基-L-精氨酸甲酯在制备降低促凋亡蛋白Bax促进凋亡活性的药物方面的应用；具体为N-硝基-L-精氨酸甲酯在制备降低Bax mRNA及蛋白表达水平的药物方面的应用。
[0012]更进一步的，N-硝基-L-精氨酸甲酯为治疗药物的活性成分，其有效浓度为0.1~99.9%。所述药物的制备方法为:取有效量的N-硝基-L-精氨酸甲酯与常规药剂赋形剂如填充剂(糖醇类如乳糖、淀粉等)、润滑剂(如硬脂酸镁、硬脂酸钙等)、助流剂(如气相二氧化娃等)、稳定剂(如抗氧化剂等)、增塑剂、崩解剂等混合制备成如片剂、胶囊剂、注射液等药物剂型。
[0013]本发明的有益效果:
[0014]本发明以NMDA诱导皮层神经元损伤，建立兴奋性神经毒性模型，结果显示，N-硝基-L-精氨酸甲酯可以降低N0S的活性，减少N0的合成，从而减少NMDA诱导的细胞凋亡。RT-PCR结果显示，与NMDA组相比，L-NAME组Bcl_2mRNA表达升高，Bax mRNA表达降低；Western blot检测结果显示，与NMDA组相比，L-NAME组Bcl_2蛋白的表达升高，Bax蛋白的表达降低(P〈0.01)。
[0015]本发明中N-硝基-L-精氨酸甲酯可通过降低NOS的活性，减少NO的生成，从而降低N0及其衍生物的毒性作用。通过升高Bcl-2mRNA及蛋白的表达，降低Bax mRNA及蛋白的表达水平，拮抗NMDA的诱导的神经细胞凋亡，进一步说明N-硝基-L-精氨酸甲酯在NMDA诱导的神经细胞凋亡中起重要的保护作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为本发明实施例1中各组细胞中N0S浓度的表达变化；
[0017]图2为实施例1中RT-PCR检测各组细胞Bcl_2mRNA表达变化；
[0018]图3为实施例1中Western blot检测各组细胞Bcl_2蛋白表达变化；
[0019]图4为实施例1中RT-PCR检测各组细胞Bax mRNA表达变化；
[0020]图5为实施例1中Western blot检测各组细胞Bax蛋白表达变化。
【具体实施方式】
[0021]下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0022]实施例1
[0023]N-硝基-L-精氨酸甲酯在制备治疗中枢神经系统神经元兴奋毒性损伤药物方面的应用。
[0024] 一、材料与方法
[0025]1、试验动物
[0026]出生ld_3d内的健康清洁级新生SD大鼠，由新乡医学院实验动物中心提供。
[0027]2、主要试剂
[0028]DMEM、胎牛血清(Hyclone)，多聚赖氨酸(美国Sigma公司)，NOS ELISA Kit (北京博奥森生物技术有限公司)，兔抗Bax、Bcl-2抗体、羊抗兔IgG II抗(武汉博士德公司),一氧化氮合酶抑制剂(N-硝基-L-精氨酸甲酯，NG-nitro-L-arginine Methyl ester, L-NAME)(碧云天公司)，Trizol,逆转录及扩增试剂盒(promega公司)。
[0029]3、试验方法
[0030](1)皮层神经元的原代培养:新生SD大鼠皮层神经元的分离、培养参照文献进行(宋海岩等，新生大鼠大脑皮质神经元的原代培养及其鉴定)。取新生72h内的SD大鼠，75%的酒精中浸泡2min，剪刀断头取脑，体视显微镜下剥去脑膜，制备成单细胞悬液，按(1-2)X 108/L的细胞密度接种在12孔板内(预先放入多聚赖氨酸包被的盖玻片),置于培养箱(37°C、5%C02)中培养，24h后加入终浓度为lOymol/L的阿糖胞苷以抑制非神经元的增殖，作用24h后半量换液，以后每2d半量换液，培养8d的细胞用于后续实验。
[0031](2)试验分组:分离培养8d的神经元随机分为3组，每组8个孔，对照组:用DMEM常规培养；NMDA (N-甲基-D-天门冬氨酸)诱导组:培养液中加入终浓度均为100 μ m/L的NMDA诱导2h ；L-NAME组:加入L-NAME (终浓度为100 μ m/L)作用lh后，加入NMDA (其终浓度均为100 μ m/L)毒性诱导2h。
[0032](3)ELLSA检测NOS表达:收集上述3组细胞分别加细胞蛋白裂解液裂解后收集上清，按试剂盒操作说明进行N0S浓度的检测，用酶标仪测定A450值。
[0033](4) RT-PCR检测各组中Bax、Bcl_2mRNA的表达:利用Trizol提取各组细胞总的RNA，分别用紫外分光光度计测定RNA浓度与纯度，样品光密度(0D )比值(0D260/0D280 )在1.8-2.0的样品进行下一步实验。按照试剂盒说明进行逆转录反应生产cDNA，进行RT-PCR 扩增，扩增条件:25μ 1 的反应体系，95°C 2min,95°C 40sec,56°C 40sec,72°C lmin,72°C 5min,30 个循环。
[0034]引物序列参见文献(戴晓春等，转录因子Pax-8基因干扰后线粒体功能对心肌细胞凋亡的影响)，由上海生工合成，如下所示:
[0035]Bcl-2 上游引物:5’ -CTGGTGGACAACATCGCTCTG-3’(如 SEQ ID N0.1 所示)，
[0036]下游引物:5‘-GGTCTGCTGACCTCACTTGTG-3’(如 SEQ ID Ν0.2 所示)，扩增产物大小为228bp ；
[0037]Bax 上游引物:5’ -TTCATCCAGGATCGAGCAGAG-3’(如 SEQ ID N0.3 所示)，
[0038]下游引物:5’-TGAGGACTCCAGCCACAAAGAT-3’(如 SEQ ID N0.4 所示)，扩增产物大小为456bp ；
[0039]β -actin 上游引物:5’ -ATCATGTTTGGGACCTTCAACA-3’(如 SEQ ID N0.5 所示)，
[0040]下游引物:5’-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3’(如 SEQ ID N0.6 所示)，扩增产物大小为 318bp。
[0041]取扩增产物10 μ 1，1.5%的琼脂糖凝胶电泳，紫外投射分析仪观察拍照。
[0042](5) Western blot检测Bax、Bcl-2表达:NMDA组及L-NAME组细胞经毒性诱导2h后，细胞换液，继续培养6h，依次收集正常组、NMDA组及L-NAME组细胞，细胞裂解匀浆后提取蛋白、定量，用10%SDS-PAGE电泳，转膜，加兔抗Bax (1: 300)，兔抗Bcl_2 (1:500),4°C过夜，加生物素化II抗(1:500)，37°C孵育lh, TBST洗10minX3次，显色、曝光。
[0043]4、统计分析
[0044]应用SPSS17.0统计分析软件分析，实验数据以x±s表示，各组数据比较采用t检验及单因素方差分析，P<0.05认为差异显著，具有统计学意义。[0045]二、结果
[0046]1、各组细胞N0S水平检测
[0047]N0S为N0生成的限速酶，作为N0S的抑制剂，L-NAME可通过抑制N0S来减少N0的生成。ELISA检测结果显示， 与正常组相比，L-NAME组中NOS 0D值升高，N0S的生成显著升高(Ρ〈0.01)，而与NMDA诱导组相比，0D值降低，N0S的生成降低(Ρ〈0.01)(见图1，*Ρ〈0.01较正常组，#Ρ<0.01较NMDA组)。
[0048]2、各组细胞中Bcl_2mRNA及蛋白的表达
[0049]Bcl-2是一种具有抑制细胞凋亡作用的因子，可通过多种方式抑制神经元凋亡。RT-PCR及Western blot检测Bcl_2mRNA及蛋白表达结果显示，与正常组相比，L-NAME组Bcl-2mRNA及蛋白表达显著降低，差异有统计学意义(P〈0.01);而与NMDA诱导组相比，L-NAME组Bcl-2mRNA及蛋白表达明显升高，差异有统计学意义(P〈0.01)(见图2、3)。
[0050]3、各组细胞Bax mRNA及蛋白的表达
[0051]Bax是关键的促细胞凋亡因子，与凋亡密切相关，用RT-PCR及Western blot检测BaxmRNA及蛋白的表达，结果显示，与正常组相比，L-NAME组Bax mRNA及蛋白表达显著增多，差异有统计学意义(P〈0.01);而与NMDA诱导组相比，L-NAME组Bax mRNA及蛋白表达明显减少，差异有统计学意义(P〈0.01)(见图4、5)。
[0052]三、结论
[0053]本发明以NMDA诱导皮层神经元损伤，建立兴奋性神经毒性模型，结果显示，N-硝基-L-精氨酸甲酯可以降低N0S的活性，减少N0的合成，从而减少NMDA诱导的细胞凋亡。RT-PCR结果显示，与正常组相比，L-NAME组Bcl_2mRNA表达明显降低，Bax mRNA表达升高，而与NMDA组相比Bcl_2mRNA表达升高，Bax mRNA表达降低；Western blot检测结果显示，L-NAME组与正常组相比，Bcl-2蛋白的表达明显降低，Bax蛋白的表达明显增高(P〈0.01)，而与NMDA组相比，Bcl-2蛋白的表达升高，Bax蛋白的表达降低(P〈0.01)。
[0054]本发明中N-硝基-L-精氨酸甲酯可通过降低N0S的活性，减少NO的生成，从而降低N0及其衍生物的毒性作用。通过升高Bcl-2mRNA及蛋白的表达，降低Bax mRNA及蛋白的表达水平，拮抗NMDA的诱导的神经细胞凋亡，进一步说明N-硝基-L-精氨酸甲酯在NMDA诱导的神经细胞凋亡中起重要的保护作用。
[0055]实施例2
[0056]N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途，包括以下步骤:取有效量的N-硝基-L-精氨酸甲酯与生理盐水混合制备注射液。
【权利要求】
1.N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途，其特征在于:N-硝基-L-精氨酸甲酯在制备治疗中枢神经系统神经元兴奋毒性损伤的药物方面的应用。
2.根据权利要求1所述的N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途，其特征在于:N-硝基-L-精氨酸甲酯在制备治疗由谷氨酸介导的中枢神经系统神经元兴奋毒性损伤的药物方面的应用。
3.根据权利要求1所述的N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途，其特征在于:N-硝基-L-精氨酸甲酯在制备治疗由N-甲基-D-天门冬氨酸介导的中枢神经系统神经元兴奋毒性损伤的药物方面的应用。
4.根据权利要求1-3任一项所述的N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途，其特征在于:N-硝基-L-精氨酸甲酯为药物的活性成分，其有效浓度为0.1~99.9%。
5.根据权利要求4所述的N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途，其特征在于:所述药物的制备方法为:取N-硝基-L-精氨酸甲酯与赋形剂混合即得。
6.N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途，其特征在于:N-硝基-L-精氨酸甲酯在制备降低NOS活性的药物方面的应用。
7.N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途，其特征在于:N-硝基-L-精氨酸甲酯在制备提高抗凋亡蛋白Bcl-2抑制凋亡活性的药物方面的应用。
8.根据权利要求7所述的N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途，其特征在于:N-硝基-L-精氨酸甲酯在制备提高Bcl-2mRNA及蛋白表达水平的药物方面的应用。
9.N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途，其特征在于:N-硝基-L-精氨酸甲酯在制备降低促凋亡蛋白Bax促进凋亡活性的`药物方面的应用。
10.根据权利要求9所述的N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途，其特征在于:N-硝基-L-精氨酸甲酯在制备降低Bax mRNA及蛋白表达水平的药物方面的应用。
【文档编号】A61P25/28GK103720683SQ201310692301
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月16日 优先权日:2013年12月16日
【发明者】宋海岩, 邓晓慧, 连辉, 付洁, 高志涛, 马传飞 申请人:新乡医学院