迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株及其应用的利记博彩app

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【专利摘要】本发明提供野生迟缓爱德华氏菌的4株基因缺失突变株及其衍生菌株，分别为EvpC基因丧失功能的E.tardaΔEvpC菌株及其衍生菌株，包括有EsrB基因丧失功能的E.tardaΔEvpCΔEsrB菌株及其衍生菌株，PstB基因丧失功能的E.tardaΔEvpCΔEsrBΔPstB菌株及其衍生菌株，PstC基因丧失功能的E.tardaΔEvpCΔEsrBΔPstC菌株及其衍生菌株。上述弱毒株的EvpC、EsrB、PstB和PstC等1—3个基因存在引起其功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入。较野生1101菌株或其他强毒株，E.tarda△EvpC、E.tarda△EvpCΔEsrB、E.tardaΔEvpCΔEsrBΔPstB和E.tardaΔEvpCΔEsrBΔPstC菌株的毒力分别不超过野生迟缓爱德华氏菌1101株或其他强毒株的1/40、1/400、1/4000和1/4000。上述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株可作为爱德华氏菌的弱毒疫苗株、基因工程载体或益生菌得到应用。
【专利说明】迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉水产养殖动物的微生物基因工程技术及免疫学领域，具体涉及迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株及其应用。
【背景技术】
[0002]迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)由 Hoshina (1962)首次从獲鲡(Anguillajapanica)中分离，与鲇鱼爱德华氏菌(E.1ctaluri)和保科爱德华氏菌(E.hoshinae)同属于肠杆菌科爱德华氏菌属。迟缓爱德华氏菌对多种鱼类具有致病性，已报道可感染的鱼类有:斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、大口黑 S卢(Micropterus salmoides)、獲鱼Β0(Α.japonica)、鲻鱼(Mugil cephalus)、犁齿鲷(Evynnis japonica)、罗非鱼(Tilapianilotica)、奇努克鲑鱼(Oncorhynchus tshawytscha)、红鲷(Chrysophrys major)、五条飾(Seriola quinqueradiata)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、鲤鱼(Cyprinus carpio)、海鱼卢(Morone saxatilis)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)、古月It (Clarias batrachus)、锦鲤(Anabas testudineus)、欧洲獲(Anguilla anguilla)、黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)、丝足鱼(Trichogaster trichopterus)、地图鱼(Astronotus ocellatus)、剑尾鱼(Xiphophorus helleri)和斑马鱼(Danio rerio)等。该菌株另也有感染两栖类(蟾蜍、牛蛙等)、爬行类(蜥蜴、蛇、海龟、中华鳖等)、鸟类(企鹅、秃鹰、鸵鸟及一些水鸟等)、哺乳类(海狮、海牛、猪、狗、牛、猴子等)的报道。除以上动物外，该菌株可感染人类，引起人的肠胃炎、流行性腹泻和败血症等症状。该菌呈世界性分布，普遍存在于淡水和海水环境中，主要分布在中国、澳大利 亚、日本、印度、以色列、马来群岛、美国、巴拿马等热带和亚热带国家和地区，该菌是当前水产养殖业中的有着极大危害的病原菌之一。从首次报道至今，该病原对多种鱼类养殖业造成了巨大损失。较抗生素等药物防治方法，采用疫苗为主的免疫防治技术因具有安全高效无公害等优点，已成为国际上鱼病防控技术发展的趋势。在不同类型疫苗研究中，利用基因工程技术构建的基因工程弱毒株可通过感染宿主的方式诱发机体产生与自然感染接近的免疫应答，从而可产生较为持久的免疫力，与传统疫苗相比，其免疫接种中，具有用量小、成本低及操作方便等优点，另外弱毒株也可开发成为基因工程菌株或作为益生菌而加以应用，因此具有极高的开发应用价值。
[0003]早期研究中，有学者利用转座子或基因插入失活的方法对迟缓爱德华氏菌加以改造，但上述方法制备的弱毒株携带有抗生素及外源的基因片段，具有潜在的生物风险。针对这一现状，近年来，人们更多的采用细菌毒力相关基因的无标记缺失技术进行弱毒突变株的构建，该弱毒突变株因其不携带任何抗性标记和外源基因，具有较高的生物安全性，其中双基因或多基因缺失突变株较单基因缺失株又可有效降低因多次传代可能产生的返祖现象，因而更具有开发应用的价值。
[0004]病原材料的种株差异会直接影响其基因工程菌株的应用效果，进而也影响其所制备的弱毒疫苗的免疫保护效果。我们在早期研究中从分离到的多株迟缓爱德华氏菌中筛选出1101菌株作为弱毒疫苗开发候选株,该菌株分离自海水养殖鱼类大菱鲆成鱼体中，是一种具有较强毒力的野生菌株，其保藏编号为:CGMCCN0.7197，该菌株制备的灭活疫苗可获得60%以上的免疫保护力的结果，说明该1101菌株具有迟缓爱德华氏菌的免疫保护性抗原。以上述的1101菌株为基础，我们构建了迟缓爱德华氏菌VI型分泌系统中的毒力蛋白EvpC基因丧失功能的E.tarda'EvpC菌株及其衍生菌株，对鱼类的半致死剂量(LD5tl)可提高40—4000倍以上，用其作为活疫苗的免疫应用中，受试鱼也可获得较好的免疫保护效果，这一结果也表明E.tarda'EvpC菌株及其衍生菌株作为基因工程弱毒株，具有良好的开发应用前景。

【发明内容】

[0005]本发明的目的是提供一种迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株及其应用方法。
[0006]本发明以野生迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)菌株1101为基础(保藏编号为:CGMCC N0.7197)，利用基因同源重组的原理，采用基因工程技术构建了VI分泌系统毒力蛋白EvpC基因丧失功能的E.，包括此菌株的衍生菌株，其特征在于该株与野生迟缓爱德华氏菌1101株或其他强毒株相比，存在引起EvpC基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入，即存在引起与SEQ ID NO:1 (EvpC基因上游核苷酸序列)和SEQ ID NO: 2 (EvpC基因下游核苷酸序列)相同或相近的序列所编码的基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入。上述的点突变、移位或插入指受内在及外界因素诱导而引起的的该核苷酸序列的错义突变、无义突变、移码突变以及包括转座子标签在内的外源基因插入诱变等，以下同。以斑马鱼为模式动物对其毒力分析结果表明，E.株的毒力不超过野生迟缓爱德华氏菌1101株或其他强毒株的1/40，其对鱼的半致死量至少需要I X 105cfu/g (菌落形成单位/鱼体重)。
[0007]E.tarda"Evpe菌株的衍生菌株中包括迟缓爱德华氏菌III型分泌系统调节蛋白基因EsrB丧失功能的E.tardaAEvpMtoB菌株，包括此菌株的衍生菌株，其特征在于E.tardaΔΕνρεΔΕ3Β株存在引起E.tardaΔΕνρε株的EsrB基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入，即存在引起除了与SEQ ID Ν0:1和SEQ ID NO:2相同或相近的序列之外，还有与SEQ ID NO:3 (EsrB基因上游核苷酸序列)和SEQ ID NO:4 (EsrB基因下游核苷酸序列)相同或相近的序列所编码的基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入。以大菱鲆为模式动物对其进行的两次毒力分析的结果表明，Ε.tardaΛε-ΛΕ3Ι.β菌株毒力不超过野生迟缓爱德华氏菌1101株或其他强毒株的1/400，其对鱼的半致死量至少需要lX106cfu/g (菌落形成单位/鱼体重)。以E.tardaAE—B菌株作为弱毒株的初步免疫试验结果表明，对爱德华氏菌感染具有较好的免疫保护效果，受试大菱鲆在注射、浸泡和口服免疫后，可分别获得76%、50%和42%免疫保护力。E.tarda'EvpC'EsrB菌株所述衍生菌株中包括的PST操纵子系统基因PstB丧失功能的E.tarda'EvpC'EsrB'PstB株，包括此菌株的衍生菌株，其特征于E.tardaΔΕνρεΔΕ3ΒΔΡ3?Β株存在引起E.tardaΔΕν?ΛΔΕ31:Β株的PstB基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入，即存在引起除了与SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2, SEQ ID Ν0:3和SEQ ID Ν0:4相同或相近的序列之外，还有与SEQ ID NO:5(PstB基因上游核苷酸序列)和SEQ ID NO:6 (PstB基因下游核苷酸序列)相同或相近的序列所编码的基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入。以牙鲆为模式动物对其毒力分析结果表明，Ε.tarda'EvpC'EsrB'PstB菌株毒力不超过野生迟缓爱德华氏菌1101株或其他强毒株的1/4000，其对鱼的半致死量至少需要lX108cfu/g (菌落形成单位/鱼体重)；E.tarda'EvpC'EsrB菌株所述衍生菌株中也包括PST操纵子系统基因PstC丧失功能的E.tardaΔΕνρεΔΕ3ΒΔΡ3?ε株，包括此菌株的衍生菌株，其特征于E.tarda"EvpC'EsrB'Pstc株存在引起E.tarda"EvpC"EsrB株的PstC基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入，即存在引起除了与SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4相同或相近的序列之外，还有与SEQ ID NO:7 (PstC基因上游核苷酸序列)和SEQ ID NO:8 (PstC基因下游核苷酸序列)相同或相近的序列所编码的基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入。以牙鲆为模式动物对其毒力分析结果表明，E.tardaAEvpME—Pste菌株毒力不超过野生迟缓爱德华氏菌1101株或其他强毒株的1/4000，其对鱼的半致死剂量(LD5tl)至少需要I X I O8Cf u/g(菌落形成单位 / 鱼体重)。上述的 E.tar da △EvpG Δ EsrB Δ PstB 和 Ε.tar da △EvpC Δ EsrB Δ Pstc菌株作为弱毒株的初步试验结果表明，对爱德华氏菌感染也可提供较好的免疫保护效果，受试牙鲆注射免疫2周后，可分别获得70%和85%免疫保护力。
[0008]以上结果也表明E.tarda'EvpC菌株及其衍生菌株已具备适宜用于制备弱毒疫苗的能力及疫苗开发的应用前景。
[0009]本发明的E.tardallOlAEvpG株(迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda),其中一个菌株于2013年8月21日保藏于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.8061。
[0010]E.tardaAEvpCAEsrB 菌株(迟缓爱德华氏菌 Edwardsiella tarda),于 2013 年 8 月 21日保藏于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.8062 ；
[0011]E.tarda"EvpG?PstB株，于2013年8月21日保藏于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC N0.8063 ；
[0012]E.tarda'EvpC'EsrB'Pstc株，于2013年8月21日保藏于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC N0.8064 ；
[0013]本发明的迟缓爱德华氏菌E.tarda AEvpC、E.tarda AEvpC'EsrB, E.tarda'EvpC'EsrB'PstB和E.tardaAE—Pste菌株及其衍生菌株可培养于Luria-Bertani (LB)、胰大豆蛋白胨培养基(TSB)或2216E海水培养基，培养方法如下:从_80°C保存的菌种中挑取少量划线于上述培养基的固体平板，培养温度范围为28— 37 °C，24— 48h后，取上述单菌落接种于上述培养基的培养液中，28— 37°C，180r/min摇瓶培养至0D_为0.5—0.6，即可获得该菌株的新鲜菌液。迟缓爱德华氏菌弱毒株作为疫苗菌株可以有多种应用方式，生产的疫苗可以是使用该弱毒株的活菌，也可以使用该弱毒株的灭活菌、菌蜕成分及部分抗原；可以制备源于该弱毒株的单一疫苗，可以制备该菌株与源于其他病原的联合疫苗，也可以将制备的单一或联合疫苗再添加佐剂生产疫苗产品，还可以是将弱毒株作为表达一种或多种外源抗原的活菌载体中的疫苗应用。弱毒株与佐剂配伍应用中，佐剂可与疫苗抗原混合制成疫苗制剂，也可以不与疫苗抗原制成单一制剂但同时使用，也可以与疫苗抗原不同时使用。由本发明迟缓爱德华氏菌弱毒株生产的疫苗在接种应用中，可以采用浸泡免疫、口服免疫、创伤免疫(即将受免疫鱼体表进行无菌人工轻微创伤处理，增强鱼体对抗原的吸收)和注射免疫等多种不同的免疫接种方式。抗原的剂量与免疫效果密切相关，剂量过低，不能诱导足够强的免疫应答，剂量过高，也可能会导致机体的免疫耐受。因此，为取得较好的免疫效果，在抗原接种前，应先确定疫苗接种的有效剂量范围，其中，弱毒株作为活疫苗或活菌载体应用中，因其潜在的毒力并未完全丧失，还应事先确定其免疫应用中的安全接种剂量范围。此外，抗原在应用中也应考虑诸如动物生长阶段、抗原种类、疫苗剂型及接种次数等因素对其剂量需求的影响。本发明的迟缓爱德华氏菌弱毒株作为活疫苗应用中，注射免疫接种时，可采用腹腔或肌肉注射两种方式，使用的剂量为IO4 — 107CFU/g(菌落形成单位/鱼体重)；创伤免疫或浸浴免疫接种时，浸泡水体中活疫苗的浓度为IO6 — 109CFU/mL (菌落形成单位/浸泡体积)，浸泡时间2min — 12h ; 口服免疫接种时，配合饲料中活疫苗的添加剂量为IO6 — IO9CFU/g(菌落形成单位/饲料重量)，连续投喂2— 7天。以上活疫苗在使用中，还可根据实际情况对受免疫鱼实施加强免疫2— 3次，两次免疫的时间间隔为14一30天。
[0014]本发明的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株，其所制备疫苗抗原可应用于鱼类、两栖类和爬行类的免疫接种，用于预防经免疫接种的水生动物发生爱德华氏菌病，包括海水养殖鱼类(如牙鲆、大菱鲆、半滑舌鳎、石斑鱼、鲈鱼、真鲷、军曹鱼、大西洋鲑、河飩等)、半咸水养殖鱼类(如罗非鱼、 虹鳟、鲻鱼等)、洄游鱼类(如鳗鲡、小黄鱼等)、淡水养殖鱼类(如青鱼、鲢鱼、鳙鱼、鲤鱼、鲫鱼、鲶鱼、鳜鱼、鲟鱼、澳洲宝石鲈、黄颡鱼等)、观赏鱼类(如金鱼、锦鲤等)、两栖类(如牛蛙、大鲵等)和爬行类(如鳖、龟、蛇等)的疫苗接种。不同的水生动物的抗原的免疫剂量有所不同，对于特定水生动物及特定抗原的在使用中的具体剂量，应该进行单独测试。
[0015]迟缓爱德华氏菌为一种胞内寄生菌，可在上皮细胞及巨噬细胞等胞内生长繁殖，具有多种逃避机体的免疫杀伤的能力，其弱毒株在安全性具有保证的前提下，具有进一步开发成为基因工程菌株的潜在价值，其应用包括可以作为在质粒转化、噬粒转染、外源基因整合、DNA疫苗等方面所需的基因工程菌株，也可以在克隆特定的核酸序列，表达特定基因编码的外源蛋白、多肽，转录特定基因编码的单链或双链RNA等方面获得应用。迟缓爱德华氏菌弱毒株作为载体在应用前，有必要进行对该载体系统的安全性及外源基因遗传稳定性的评估，应用中的接种方式也可采用浸泡、口服、创伤和注射等接种方式。
[0016]本发明的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株也可作为益生菌加以应用，可以作为陆生动物或水生动物肠道、体表定植或体内暂存的益生菌，用于刺激动物非特异性免疫力的提高或抑制致病微生物的存在与繁殖。弱毒株作为益生菌，其应用的接种方式也可采用浸泡、口服、创伤和注射等接种方式，为确保应用中的安全性，应用前，也应确定不同接种方式中使用的安全剂量范围。
[0017]本发明的积极效果在于:本发明的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株无任何抗性标记及外源基因，其中的双基因和三基因缺失弱毒株及其衍生株可有效降低了减毒株在使用中可能发生的返祖现象，进一步提高了疫苗的安全性。免疫接种后，弱毒株可通过感染宿主的方式，通过在机体中的繁殖生长，进而诱发机体产生与自然感染接近的免疫应答，这对于可在胞内感染并具有免疫逃避能力的爱德华氏菌感染的有效免疫防控具有重要意义，使用中具有用量小、成本低及接种方便等优点。对鱼类初步免疫试验结果，已证实本发明的弱毒株一次注射、浸泡或口服途径接种均对爱德华氏菌感染具有较好的免疫保护作用。本发明的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株也可用于包括重组活疫苗在内的不同基因工程菌株的开发，也可作为水生生物的有益菌而加以应用。本发明的应用也可有效减少或消除由于爱德华氏菌病发生所致的消毒剂、抗生素等化学药物的滥用，因此也具有显著的经济及生态效益。
[0018]以下通过实施例对本发明作进一步说明。
[0019]实施例1:迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株的培养
[0020]迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株E.tarda Δ EvpC, E.tarda Δ EvpC'EsrB,Ε.tardaΔΕνρεΔΕ3rΒΔΡ3rΒ 和 Ε.tarda"EvpC'EsrB'Pstc 可培养于 LB 培养基(胰化蛋白胨 10g，酵母提取物5g，NaCllOg，去离子水定容至1L，pH7.0)、TSB培养基(北京陆桥技术有限责任公司)或2216E培养基(根据培养基成分中海水的有无，该培养基分为两种，其一:酵母提取物lg，胰化蛋白胨5g，FePO40.lg，海水定容至1L，pH7.6—7.8 ;其二:酵母提取物lg，胰化蛋白胨5g，FePO40.lg, NaC134g，去离子水定容至1L，pH7.6—7.8)，上述培养基的固体平板的配制中则需要另外添加2%琼脂。菌株培养方法如下:从_80°C保存的菌种中挑取少量划线于上述培养基的固体平板，在28— 37°C培养24— 48h，即可在平板上获得单克隆菌落，取一单菌落接种于上述培养基的培养液中，28— 37°C，180r/min摇瓶培养至0D_为0.5—0.6，即可获得该菌株的新鲜菌液。
[0021]实施例2:迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒疫苗E.tardaΔΕνρε菌株的构建方法
[0022](1)EvpC基因上、下游核苷酸序列扩增及连接
[0023]以迟缓爱德华氏菌1101菌株(保藏编号为=CGMCC N0.7197) DNA为模板，用引物EvpC-up-for/EvpC-up-rev进行EvpC基因上游片段Fl(826bp)扩增,所获序列记为SEQ IDNO:1。用引物 EvpC-down-for/EvpC-down-rev 进行 EvpC 基因下游片段 F2 (583bp)扩增，所获序列记为SEQ ID N0:2。对SEQ ID NO:1和2进行测序及系统发育学分析，结果表明以上两序列具备了迟缓爱德华氏菌菌株的EvpC基因上、下游的序列特征。
[0024]上述引物序列如下:
[0025]EvpC-up-for:AAGGTACCGGTCGAGTCATTCAATTTT
[0026]EvpC-up-rev:ACCAATTTTGCCGCCATCAACCTTATCCAGTT
[0027]EvpC-down-for:GGCGGCAAAATTGGTCCTG
[0028]EvpC-down-rev:AAGGTACCCCGTCGAGGTTGAAAAGG
[0029]以上述纯化后的F1、F2为模板,用引物EvpC-up-f or/EvpC-down-r e V进行Over I apPCR扩增，所获片段即为EvpC基因上、下游核苷酸连接序列F1-F2 (1409bp)。
[0030](2)重组自杀质粒的构建及电转
[0031]用Kpn I内切酶(Takara生物工程有限公司，大连)，对上述的F1-F2产物和PRE112自杀质粒进行酶切，获得酶切后的F1-F2产物及线性pRE112片段再用T4DNA连接酶(NEB有限公司，北京)16°C连接过夜，构建重组自杀质粒pRE112-DEvpC。再将该重组自杀质粒电转化入事先制备的大肠杆菌(Escherichia coli)SM10菌株的电转感受态细胞中，加入适量的LB培养基，37°C振荡培养60min，取适量菌液涂布含有氯霉素(34 μ g/mL,以下浓度同)的LB固体平板上，以筛选含有pRE112-DEvpC重组自杀质粒的大肠杆菌SMlO菌株。
[0032](3)两次同源重组构建E.tardaAEvpG菌株
[0033]取0D600 值约为 0.5 左右的 160 μ L SMlO (pRE112_DEvpC)和 40 μ LllOl 新鲜菌
液，混匀，离心并用200 μ L新鲜LB培养基洗2次，转移至TSA平板中央，28°C静置培养24h进行第一次同源重组。用PBS冲洗菌液并涂布含有氯霉素和粘菌素(12.5 μ g/mL，以下浓度同)的TSA平板，28 °C静置培养48h后，用EvpC-up-for/EvpC-down-rev进行菌落PCR以筛选正确的第一次同源重组子。将第一次正确同源重组的菌落接种至5mL新鲜LB培养基中，280C，振荡培养48h，进行2次同源重组后，涂布于含有粘菌素和含有10—20%蔗糖的TSA平板上，28°C静置培养48h后，将同一单菌落分别划线于含有粘菌素的TSA及含有氯霉素和粘菌素的TSA平板，选取在含有上述粘菌素的TSA平板上生长但在上述含有氯霉素和粘菌素TSA平板上不生长的菌落进行PCR检测，PCR阳性检测结果中含有单一 F1-F2条带的菌落即是E.tardaAEvpG菌株，该菌株于2013年8月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.8061。
[0034]除以上方法外，也可采用其他的基因工程技术，通过SEQ ID N0:1和SEQ IDNO:2相同或相近的序列所编码的基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入的方式来构建EvpC丧失功能的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株及其衍生菌株。 [0035]实施例3:迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒疫苗E.tardaAEvpC'EsrB菌株的构建方法
[0036](I) EsrB基因上、下游核苷酸序列扩增及连接
[0037]以迟缓爱德华氏菌1101菌株DNA为模板,用引物EsrB-up-for/EsrB-up-rev进行EsrB基因上游片段F3(860bp)扩增，所获序列记为SEQ ID NO:3。用引物EsrB-down-for/EsrB-down-rev进行EsrB基因下游片段F4 (765bp)扩增,所获序列记为SEQ ID NO:4。对SEQ ID NO:3和4进行测序及系统发育学分析，结果表明以上两序列具备了迟缓爱德华氏菌菌株1101的EsrB基因上、下游的序列特征。上述引物序列如下:
[0038]EsrB-up-for:AAGGTACCGGCGACAATCCCGATCTG
[0039]EsrB-up-rev:ATCCGTAATCTCTTGGCGGAGCTGAGCAACTGGG
[0040]EsrB-down-for:CAAGAGATTACGGATGCCATC
[0041]EsrB-down-rev:AAGGTACCGAAAGGCTCTCCGTTGA
[0042]以上述纯化后的F3、F4为模板，用引物EsrB-up-for/EsrB-down-rev进行OverlapPCR扩增，所获片段即为EsrB基因上、下游核苷酸连接序列F3-F4 (1625bp)。
[0043](2)重组自杀质粒的构建及电转
[0044]参加实施例2的方法构建重组自杀质粒pRE112_DEsrB和含有该重组自杀质粒的大肠杆菌SMlO菌株。
[0045](3)两次同源重组构建E.tardaΔΕνρεΔΕ3 Β菌株
[0046]用0D600值约为0.5左右的160 μ L含有pRE112_DEsrB质粒的大肠杆菌SMlO(实施例3)和40 μ L迟缓爱德华氏菌Ε.tardaΔΕνρε的新鲜菌液，混匀，离心并用200 μ L新鲜LB培养基洗2次，转移至TSA平板中央，28°C静置培养24h进行第一次同源重组。另参见实验例2中的方法进行二次同源重组及筛选确认，最终获得E.tardaAEvpC'EsrB菌株，该菌株于2013年8月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.8062。
[0047]除以上方法外，也可采用其他的基因工程技术，在已有EvpC丧失功能的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株基础上，通过SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4相同或相近的序列所编码的基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入的方式来构建EvpC和EsrB基因丧失功能的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株及其衍生菌株。
[0048]实施例4:迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒疫苗E.tarda'EvpC'EsrB'PstB菌株构建方法[0049]( I) PstB基因上、下游核苷酸序列扩增及连接
[0050]以迟缓爱德华氏菌1101菌株DNA为模板,用引物PstB-up-for/PstB-up-rev进行PstB基因上游片段F5(822bp)扩增，所获序列记为SEQ ID NO:5。用引物PstB-down-for/PstB-down-rev进行PstB基因下游片段F6 (648bp)扩增，所获序列记为SEQ ID NO:6。对SEQ ID NO:5和6进行测序及系统发育学分析，结果表明以上两序列具备了迟缓爱德华氏菌菌株1101的PstB基因上、下游的序列特征。
[0051]上述引物序列如下:
[0052]PstB-up-for:5’AAGGTACCATCCTGCTATCCACCTTT3’
[0053]PstB-up-rev:5’AGGGGCGGTAAACAGGTTGGTCGGGTCTGTCAC3’
[0054]PstB-down-for:5’ CTGTTTACCGCCCCTGC3’
[0055]PstB-down-rev:5’AAGGTACCAATACGCTGGGAATGGT3’
[0056]以上述纯化后的F5、F6为模板，用引物PstB-up-for/PstB-down-rev进行OverlapPCR扩增，所获片段即为PstB基因上、下游核苷酸连接序列F5-F6 (1470bp)。
[0057](2)重组自杀质粒的构建及电转
[0058]参加实施例2的方法构建重组自杀质粒pRE112_DPstB和含有该重组自杀质粒的大肠杆菌SMlO菌株。
[0059](3)两次同源重组构建 E.tarda'EvpC'EsrB'PstB 菌株
[0060]用0D600值约为0.5左 右的160 μ L含有pRE112_DPstB质粒的大肠杆菌SMlO和
40 μ L迟缓爱德华氏菌E.tardaΔΕνρεΔΕ31~Β的新鲜菌液，混匀，离心并用200 μ L新鲜LB培养基洗2次，转移至TSA平板中央，28°C静置培养24h进行第一次同源重组。另参见实验例2中的方法进行二次同源重组及筛选确认，最终获得E.tarda'EvpC'EsrB'PstB菌株，该菌株于2013年8月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCN0.8063。
[0061]除以上方法外，也可采用其他的基因工程技术，在已有EvpC和EsrB基因丧失功能的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株基础上，通过SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6相同或相近的序列所编码的基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入的方式来构建EvpC、EsrB和PstB基因丧失功能的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株及其衍生菌株。
[0062]实施例5:迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒疫苗E.tarda'EvpC'EsrB'Pstc菌株构建方法
[0063](I)PstC基因上、下游核苷酸序列扩增及连接
[0064]以迟缓爱德华氏菌1101菌株DNA为模板,用引物PstC-up-for/PstC-up-rev进行PstC基因上游片段F7(332bp)扩增，所获序列记为SEQ ID NO:7。用引物PstC-down-for/PstC-down-rev进行PstC基因下游片段F8 (657bp)扩增，所获序列记为SEQ ID NO:8。对SEQ ID NO:7和8进行测序及系统发育学分析，结果表明以上两序列具备了迟缓爱德华氏菌菌株1101的PstC基因上、下游的序列特征。
[0065]上述引物序列如下:
[0066]PstC-up-for:5’AAGGTACCAAGGACAGCGGCGGCAA3’
[0067]PstC-up-rev:5’ CTCAGCAAACTCATTGATAGGCACCAGCGCG3’
[0068]PstC-down-for:5’AATGAGTTTGCTGAGGCGGAGTC3’
[0069]PstC-down-rev:5’AAGGTACCGTGGTGCGGATAACG3’[0070]以上述纯化后的F7、F8为模板,用引物PstC-up-for/PstC-down-rev进行OverlapPCR扩增，所获片段即为PstC基因上、下游核苷酸连接序列F7-F8 (989bp)。
[0071](2)重组自杀质粒的构建及电转
[0072]参加实施例2的方法构建重组自杀质粒pRE112_DPstC和含有该重组自杀质粒的大肠杆菌SMlO菌株。[0073](3)两次同源重组构建 E.tarda'EvpC'EsrB'Pstc 菌株
[0074]用0D600值约为0.5左右的160 μ L含有pRE112_DPstC质粒的大肠杆菌SMlO和
40 μ L迟缓爱德华氏菌E.tardaΔΕνρεΔΕ3Β的新鲜菌液，混匀，离心并用200 μ L新鲜LB培养基洗2次，转移至TSA平板中央，28°C静置培养24h进行第一次同源重组。另参见实验例2中的方法进行二次同源重组及筛选确认，最终获得E.tarda'EvpC'EsrB'Pstc菌株，该菌株于2013年8月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCN0.8064。
[0075]除以上方法外，也可采用其他的基因工程技术，在已有EvpC和EsrB基因丧失功能的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株基础上，通过SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8相同或相近的序列所编码的基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入的方式来构建EvpC、EsrB和PstC基因丧失功能的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株及其衍生菌株。
[0076]实施例6:迟缓爱德华氏菌E.tardaΔΕνρε菌株对斑马鱼半致死剂量(LD5tl)测定
[0077](I)迟缓爱德华氏菌Ε.tardaΔΕνρε菌株的培养:将对数生长期的迟缓爱德华氏菌Ε.tardaΔΕνρε (约IX 105CFU/mL)以1:100的比例接种至TSB液体培养基中，28°C恒温培养箱，180rpm振荡培养5h，6000rpm，4°C离心IOmin收集菌体，以无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤菌体三次，并用PBS重悬菌体，制成I X 109CFU/mL菌悬液。
[0078](2)试验鱼饲养及管理:选用健康斑马鱼(0.29±0.07g),置于斑马鱼养殖设备(上海海圣水族设备厂)中，水温为(28± I) °C。每日灯光照明12h。试验期间按鱼体重3%投喂配合饲料日投喂2次，定期对滤网进行清洗消毒，试验前暂养2周。斑马鱼注射前用MS222 (1:10000稀释)进行浸泡麻醉处理。
[0079](3)试验分组:将新鲜培养的菌液(IX 109cells/mL)用PBS (pH7.2) 10倍系列稀释，分为7组，另设一组只注射PBS作为对照。每组15尾，置于IOL槽内。MS222进行麻醉后，分别注射 10 μ L 的 IO8、ΙΟ7、ΙΟ6、ΙΟ5、ΙΟ4、103、102CFU/mL 及 PBS (ρΗ7.2)，实验重复 2 次。
实验观察2周，每日记录死亡鱼数。
[0080](4)统计与分析:实验观察14天，各组斑马鱼死亡数见表1，注射PBS的对照组中斑马鱼无死亡。实验中对各组中濒死鱼随机取I一3尾，浸泡于MS222( 1:5000)过量麻醉致死后,加入适量TSB匀衆后涂布EIM培养基(Edwardsiella Ictaluri Medium,北京陆桥技术有限责任公司定制)，28°C培养48h，参照Pressley等(2005)的方法进行斑马鱼感染迟缓爱德华氏菌致死认定。迟缓爱德华氏菌菌株对斑马鱼的LD5tl的计算方法采用Reed-Muench法。
[0081]表1.迟缓爱德华氏菌1101和E.tardaΛΕνρε菌株对斑马鱼LD5tl实验死亡鱼记录表
[0082]
【权利要求】
1.迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株及其应用，其特征是迟缓爱德华氏菌的VI型分泌系统毒力蛋白基因EvpC丧失功能的菌株(E.包括此菌株的衍生菌株。
2.如权利要求1所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株，其特征在于该弱毒株与野生迟缓爱德华氏菌1101株或其他强毒株相比，存在引起EvpC基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入，即存在引起与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相同或相近的序列所编码的基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入。
3.如权利要求1所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株，其特征在于所述的E.tardaAEvpC的毒力不超过野生迟缓爱德华氏菌1101株或其他强毒株的1/40，其对鱼的半致死量至少需要I X 105cfu/g (菌落形成单位/鱼体重)。
4.如权利要求1所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株，其特征在于E.tardaAEvpe株III型分泌系统的调节蛋白基因EsrB丧失功能的菌株(E.tarda—Mw株)，包括此菌株的衍生菌株。
5.如权利要求4所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株，其特征在于所述的E.tardaΔEvpGΔEslB株存在引起E.tarda"EvpG株的EsrB基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入，即存在引起除了与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相同或相近的序列之外，还有与SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4相同或相近的序列所编码的基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入。
6.如权利要求4所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株，其特征在于所述的E.tardaAEvpMEslrB毒力不超过野生迟缓爱德华氏菌1101株或其他强毒株的1/400，其对鱼的半致死量至少需要lX106cfu/g (菌落形成单位/鱼体重)。
7.如权利要求4所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株，其特征在于在E.tar da Δ EvpG Δ EsrB株的PST操纵子系统基因Ps tB丧失功能的菌株(Ε.tar da Δ EvpC Δ EsrB Δ PstB株)，包括此菌株的衍生菌株。
8.如权利要求7所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株，其特征在于所述的E.tarda'EvpC'EsrB'PstB株存在引起E.tardaΔΕνρΕΔΕ3rΒ株的PstB基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入，即存在引起除了与SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2,SEQ ID ΝΟ:3和SEQID Ν0:4相同或相近的序列之外，还有与SEQ ID ΝΟ:5和SEQ ID ΝΟ:6相同或相近的序列所编码的基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入。
9.如权利要求7所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株，其特征在于所述的Ε.tarda"E—PstB株毒力不超过野生迟缓爱德华氏菌1101株或其他强毒株的1/4000，其对鱼的半致死量至少需要lX108cfu/g (菌落形成单位/鱼体重)。
10.如权利要求4所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株，其特征在于在E.tar da Δ EvpG Δ EsrB株的PST操纵子系统基因Ps tC丧失功能的菌株(E.tar da Δ EvpC Δ EsrB Δ Pstc株)，包括此菌株的衍生菌株。
11.如权利要求10所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株，其特征在于所述的E.tarda'EvpC'EsrB'Pstc株存在引起E.tardaΔΕνρΕΔΕ3rΒ株的PstC基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入，即存在引起除了与SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2,SEQ ID ΝΟ:3和SEQID Ν0:4相同或相近的序列之外，还有与SEQ ID ΝΟ:7和SEQ ID ΝΟ:8相同或相近的序列所编码的基因功能丧失的部分或全部缺失、点突变、移位或插入。
12.如权利要求10所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株，其特征在于所述的E.tarda"E—PstG株毒力不超过野生迟缓爱德华氏菌1101株或其他强毒株的1/4000，其对鱼的半致死剂量(LD5tl)至少需要lX108cfu/g (菌落形成单位/鱼体重)。
13.如权利要求1所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株的应用，其特征在于上述迟缓爱德华氏菌弱毒株可作为疫苗菌株、基因工程菌株、有益菌株等应用。
14.如权利要求13所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株的应用，其特征在于该弱毒株作为的疫苗菌株的应用，可以是使用该弱毒株的活菌，也可以使用该弱毒株的灭活菌、菌蜕成分、部分抗原；可以制备源于该弱毒株的单一疫苗，可以制备该菌株与源于其他病原的联合疫苗，也可以将制备的单一或联合疫苗再添加佐剂生产疫苗产品，还可以是将弱毒株作为表达外源抗原的活菌载体的疫苗应用。
15.如权利要求14所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株的应用，其特征在于所生产的疫苗可采用浸泡免疫、口服免疫、创伤免疫和注射免疫等免疫接种方式。
16.如权利要求14所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株的应用，其特征在于注射免疫接种时，可采用腹腔或肌肉注射两种方式，使用的剂量为IO4 — 107cfu/g(菌落形成单位/鱼体重)；创伤免疫或浸浴免疫接种时，浸泡水体中活疫苗的浓度为IO6 — 109cfu/mL(菌落形成单位/浸泡体积)，浸泡时间2min — 12h ； 口服免疫接种时，配合饲料中活疫苗的添加剂量为IO6 — 109cfu/g(菌落形成单位/饲料重量)，连续投喂2— 7天。
17.如权利要求14所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株的应用，其特征在于免疫接种的对象包括海水养殖鱼类、半咸水养殖鱼类、洄游鱼类、淡水养殖鱼类、观赏鱼类和淡水养殖的两栖类和爬行类，用于预防经免疫接种的水生动物发生爱德华氏菌病。
18.如权利要求13所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株的应用，其特征在于该弱毒株可以作为基因工程菌株的应用，可以在质粒转化、噬粒转染、外源基因整合、DNA疫苗等方面所需的基因工程菌株，在克隆特定的核酸序列，表达特定基因编码的外源蛋白、多肽，转录特定基因编码的单链或双链RNA等方面获得应用。
19.如权利要求13所述的迟缓爱德华氏菌基因工程弱毒株的应用，其特征在于该弱毒株作为有益菌株的应用，可以作为陆生动物或水生动物肠道、体表定植或体内暂存的益生菌，用于刺激动物非特异性免疫力的提高或抑制致病微生物的存在与繁殖。
【文档编号】A61P37/04GK103667145SQ201310674468
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月11日 优先权日:2013年12月11日
【发明者】黄倢, 谢国驷, 莫照兰, 王秀华, 许华, 张庆利, 隋虎辰, 杨春志, 李晨 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所