具有抑制酪氨酸酶活性的白僵菌提取物的应用及制备方法
【专利摘要】本发明涉及具有抑制酪氨酸酶活性的白僵菌提取物的应用及制备方法。所述白僵菌提取物在制备防治色素沉着和黑色素瘤的酪氨酸酶抑制剂的应用；所述白僵菌提取物中的主要有效成分为6’-甲基-2’,4’-二羟基苯基-4-氧甲基-β-D-葡萄糖甙（6’-methyl-2’,4’-dihydroxyphenyl-4-O-methyl-β-D-glucopyranoside），含量5~99%；其活性特征在于：对酪氨酸酶的半数抑制浓度（IC50）为：37.6~638.5.μg/mL。具有酪氨酸酶抑制剂的白僵菌提取物用途广泛，可作为日用化学品添加剂，起增白、抗黑化、抗老化、防治色素沉着和黑色素瘤等作用。
【专利说明】具有抑制酪氨酸酶活性的白僵菌提取物的应用及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物制品的提取制备和应用【技术领域】，涉及具有抑制酪氨酸酶活性的白僵菌提取物的应用及制备方法。
【背景技术】
[0002]白僵菌(Beauveria sp.)的分类:丝孢目(Hyphomycetales)丛梗孢科白僵菌属(Beauveria Vuillemin)的真菌；该属在我国常见的有三种，如:球孢白僵菌(Beauveriabassiana)、布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)和多形白僵菌(Beauveriaamorpha)等，是重要的昆虫病原真菌，目前主要用来对害虫进行生物防治。其中蚕在感染白僵菌后被称为白僵蚕。白僵蚕在我国传统中药中的作用主要为“祛风解痉，化痰散结”。白僵蚕的主要活性成分被认为是草酸铵，但白僵菌本身尚无药用报道。
[0003]抑制酪氨酸酶活性:酪氨酸酶兼有加氧酶和氧化酶的双重功能，在黑色素合成过程中起关键作用。它能够把单酚催化成二酚，并把二酚氧化成醌；醌在非酶促条件下形成最终的反应产物黑色素。酪氨酸酶抑制剂就是通过抑制酪氨酸酶活性从而抑制黑色素生成，因而可用来预防和治疗色素沉着和黑色素瘤等，从而在医药、化妆品等领域有着广阔的应用前景，被广泛用于药品及日用化学品等中。
【发明内容】
[0004]为寻找新型天然高效天然酪氨酸酶抑制剂和抗氧化剂，发明人通过对中国的100余株昆虫病原真菌代谢物进行活性研究，发现了白僵菌的提取物具有很强的酪氨酸酶抑制活性。本发明旨在，提供具有抑制酪氨酸酶活性的白僵菌提取物的用途。
[0005]所述白僵菌提取 物在制备增白、防治色素沉着和黑色素瘤的酪氨酸酶抑制剂的应用；
所述白僵菌提取物中的主要有效成分为6’ -甲基-2’，4’ - 二羟基苯基-4-氧甲基-β -D-葡萄糖式(6，-methyl-2，, 4，-dihydroxyphenyl-4-O-methyl- β -D-glucopyranoside)，含量5~99% ;其化学结构见下式:
【权利要求】
1.具有抑制酪氨酸酶活性的白僵菌提取物的应用，其特征在于:所述白僵菌提取物在制备增白、防治色素沉着和黑色素瘤的酪氨酸酶抑制剂的应用； 所述白僵菌提取物中的主要有效成分为6’ -甲基-2’，4’ - 二羟基苯基-4-氧甲基-β -D-葡萄糖式(6，-methyl_2，，-dihydroxyphenyl-4-O-methyl- β -D-glucopyranoside)，含量5~99% ;其化学结构见下式:
2.制备权利要求1所述的具有抑制酪氨酸酶活性的白僵菌提取物的方法，其特征在于:具体操作步骤如下: (1)白僵菌(Beauveriasp.)菌种选择和培养所用的白僵菌(Beauveria sp.)为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)或布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)或多形白僵菌(Beauveriaamorpha)； 具体培养方法如下: (1.1)斜面菌种培养 将白僵菌菌株接种于萨氏(SDAY)斜面培养基，于20~30°C恒温、培养4~7d，得到一级菌种； (1.2) 二级菌种培养 将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养， 液体摇瓶培养基:葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉10g/L，蒸馏水定容；在大于100ml三角瓶中加入30~50%三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种I~3支斜面菌种，接种后置于全温振荡培养箱，温度20~30°C、转速100~200rpm，培养3~7d，即得到二级菌种； (1.3)三级菌种培养 将二级菌种接种到大于等于10L的发酵罐，装液量为罐体积的50~70%，接种量5~10%，通气量按体积比1:1 (v/v)，压力0.1MPa, 20~30°C恒温通气培养2~5天，得到三级菌种；发酵罐中的培养基同液体摇瓶培养基； (1.4)发酵罐发酵 将三级菌种压入100L以上发酵罐，发酵罐的初始装液量为按罐容积的50~70%装液，接种量为装液量的5~10%，通气量按体积比1: l(v/v)，压力0.1MPa, 20~30°C恒温通气培养5~15天，得到发酵物；发酵罐中的培养基同二级菌种培养基； (2)发酵物中有效成分的提取和精制 (2.1)预处理 将发酵物在转速大于1000转/分钟条件下离心过滤；将上清液在低于100°C温度条件下，浓缩到原体积的1/2~1/10，得到浓缩液； (2.2)去杂在浓缩液中按体积比加入I~4倍乙醇，于O~40°C条件下静置沉淀5~24小时，然后在转速大于1000转/分钟离心过滤；去沉淀；将上清在温度小于100°C浓缩到原体积的1/2~1/10，得到浓缩脱醇液，同时回收乙醇； 将浓缩脱醇液按1:0.5~5的体积比，加入预处理剂，所述预处理剂为石油醚或己烷或轻汽油，混匀，萃取，去掉上层，下层的水相在温度小于100°C浓缩原体积1/2~1/10倍，得到去杂浓缩液； (2.3)初步纯化 在去杂浓缩液中，按1:0.5~5的体积比加入萃取剂，萃取剂为丁醇或丁醇和乙酸乙酯混合物，丁醇和乙酸乙酯混合物的体积比为:2-0.5:0.5-2 ;萃取后去掉水层；有机相部分在低于100°C温度下浓缩到到原体积的1/2~1/10，将浓缩物在不高于170°C条件下干燥，得粗制产品；粗制产品的性状:浅黄至棕色无定形粉末； 不同批次的粗制品对酪氨酸酶的半数抑制浓度IC5tl为278.4~638.5 μ g/ml ； 主要有效成分为6’ -甲基-2’，4’ - 二羟基苯基-4-氧甲基-β -D-葡萄糖甙(6’ -methyl_2，，4,-dihydroxyphenyl-4-O-methyl-β -D-glucopyranoside),含量 5 ~15% ;其化学结构见下式:
【文档编号】A61K8/60GK103751030SQ201310672709
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年12月12日 优先权日:2013年12月12日
【发明者】陆瑞利, 胡丰林, 黄勃, 李增智 申请人:安徽农业大学