一种玫瑰叶中抗氧化活性物质的提取方法
【专利摘要】本发明公开一种玫瑰叶中抗氧化活性物质的提取方法。该方法包括如下步骤：（1）新鲜的玫瑰叶经晒干后经粉碎过筛得到玫瑰叶颗粒；（2）用提取溶剂提取所述玫瑰叶颗粒，得到提取液；（3）所述提取液经离心得到上清液；所述上清液经浓缩得到浓缩液；（4）将所述浓缩液依次用乙醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇溶液进行萃取，分别得到乙醚萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液和水萃取液，再分别经浓缩得到乙醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物，分别标记为Fa、Fb、Fc和Fd，即提取得到了玫瑰叶中的抗氧化物质。本发明提供的抗氧化活性物质筛选方法采用自由基溶液与液相色谱柱分离后产物在线反应，分离筛选连续进行，能快速的检测出具有抗氧化活性成分。
【专利说明】一种玫瑰叶中抗氧化活性物质的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种玫瑰叶中抗氧化活性物质的提取方法。
【背景技术】
[0002]人体正常代谢或在各种应激条件下都会产生自由基，过量的自由基会导致癌症、衰老、糖尿病等一系列疾病，这时就需要补充外源性抗氧化剂来维持体内自由基平衡。抑制自由基的产生，使其快速猝灭，修复其对肌体造成的氧化伤害对人体健康有重要意义，寻找天然抗氧化活性成分以及抗氧化活性的测定已成为当前的热点。
[0003]玫瑰叶是蔷薇科蔷薇属落叶灌木玫瑰的叶，玫瑰叶含有大量的黄酮类化合物。该类化合物在抗氧化反应中不仅能清除链引发阶段的自由基，而且可以直接捕获自由基反应链中的自由基，阻断自由基链式反应，起到预防和断链的双重作用。目前，已有从植物中提取黄酮类化合物的提取技术，但国内外对于从玫瑰叶中提取黄酮类化合物的报道不多，仅发现贾长虹等采用微波提取玫瑰叶黄酮，但是该方法对仪器设备要求高，运行成本高，且应用范围较窄，不能大范围推广，因此目前市场上还没有标准化的产品出现。
[0004]在抗氧化活性的测定方面，目前可以采用提取物对ABTS自由基和DPPH自由基清除能力来快速测定其抗氧化活性，但是，这些方法测定的是提取物的总活性，而非单一组分，并且该方法采用比色法进行测定，容易受到底物的干扰。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种玫瑰叶中抗氧化活性物质的提取方法。
[0006]本发明所提供的一种玫瑰叶中抗氧化活性物质的提取方法，包括如下步骤:
[0007]( I)新鲜的玫瑰叶经晒干后经粉碎过筛得到玫瑰叶颗粒；
[0008](2)用提取溶剂提取所述玫瑰叶颗粒，得到提取液；所述提取溶剂为水或乙醇水溶液；
[0009](3)所述提取液经离心得到上清液；所述上清液经浓缩得到浓缩液；
[0010](4)将所述浓缩液依次用乙醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇溶液进行萃取，分别得到乙醚萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液和水萃取液，再分别经浓缩得到乙醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物，分别标记为Fa、Fb、Fc和Fd，即提取得到了玫瑰叶中的抗氧化物质。
[0011]所述方法还包括对所述Fa、Fb、Fe和Fd中的抗氧化物质进行提取的步骤:
[0012]将所述Fa、Fb、Fc和Fd分别进行液相色谱分离，依次在检测波长为270nm和350nm的条件下得到萃取物的液相色谱图1 ;经分离后的各组分与自由基溶液进行反应，然后进入检测器进行检测，在检测波长为270nm、350nm和747nm的条件下得到各萃取物与所述自由基溶液反应后的化学成分图谱II ;对比所述化学成分图谱II中270nm、350nm和747nm条件下的吸收峰，在相同的保留·时间下，若270nm和350nm条件下的吸收峰在747nm条件下为负吸收峰时，则该保留时间对应的组分即为抗氧化活性物质，收集该保留时间下的组分即为抗氧化活性物质。
[0013]上述的方法中，步骤(1)中，经所述晒干后的玫瑰叶的含水率可为4%~8% ；
[0014]所述玫瑰叶颗粒的粒度可为20~80目。
[0015]上述的方法中，步骤(2)中，所述乙醇水溶液中乙醇的体积含量可为10%~90% ；
[0016]所述提取的温度可为40~80°C，所述提取的时间可为60~80min ；
[0017]所述提取溶剂与所述玫瑰叶颗粒的质量比可为5~30:1 ;
[0018]所述提取的次数可为I~3次。
[0019]上述的方法中，步骤(3)中，所述离心的转速可为3000~4800r/min，所述离心的时间可为5~30min ；
[0020]所述浓缩的温度可为40~80°C ;
[0021]所述浓缩液的浓度可为5~8° Brix0
[0022]上述的方法中，步骤(4)中，所述浓缩液与所述乙醚的体积比可为1:2~3 ;
[0023]乙醚萃余液与所述乙酸乙酯的体积比可为1:2~3 ;
[0024]乙酸乙酯萃余液与所述水饱和正丁醇的体积比可为1:2~3 ;
[0025]所述提取的次数可为I~2次；
[0026]所述浓缩的温度可为40~70°C。
[0027]上述的方法中，所述自由基溶液可为2，2-联氮-二( 3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)的水溶液；
[0028]所述自由基溶液在747nm处的吸光度值可为0.65~0.75 ；
[0029]所述液相色谱图1I中的负峰是所述自由基溶液与提取物中的抗氧化活性成分反应产生褪色，吸光度值降低引起的。
[0030]上述的方法中，所述反应的温度可为25~35°C。
[0031]上述的方法中,所述液相色谱分离的条件如下:色谱柱为Agilent Zorbax AQ柱；流动相A相为水(含质量浓度2%的甲酸)，流动相B相为乙腈；梯度洗脱程序:0~15min，0%~10% B ；15 ~20min，10% B ；20 ~30min，10%~15% B ；30 ~40min，15% B ；40 ~50min, 15%~20% B ；50 ~60min,20% B ；60 ~65min,20%~30% B。
[0032]上述的方法中，可通过液质联用检测筛选出的所述抗氧化活性物质。然后可通过标准品对鉴定出的抗氧化成分进行定量，参考标准抗氧化物建立的清除自由基能力的标准曲线，对不同抗氧化成分的清除自由基能力进行定量比较。
[0033]本发明具有如下有益效果:
[0034]1、本发明提供的方法中，玫瑰叶来源广泛，生产技术简单，工艺参数合理，设备投入成本低，具有较高的社会经济效益和广阔的工业化前景。
[0035]2、本发明提供的抗氧化活性物质筛选方法，可解决常用方法只能测定总萃取物的抗氧化能力，不能测定单体的抗氧化能力的不足。
[0036]3、本发明提供的抗氧化活性物质筛选方法采用自由基溶液与液相色谱柱分离后产物在线反应，分离筛选连续进行，能快速的检测出具有抗氧化活性成分。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1为本发明的方法的工艺流程图。[0038]图2为本发明方法中在线筛选抗氧化成分(步骤(6))的方法的流程图。
[0039]图3为实施例1中乙醚萃取液的液相色谱的对比图。
[0040]图4为实施例1中乙酸乙酯萃取液中液相色谱的对比图。
[0041]图5为实施例1中正丁醇萃取液中液相色谱的对比图。
[0042]图6为实施例1中水萃取液中液相色谱的对比图。
【具体实施方式】
[0043]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0044]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0045]ABTS自由基溶液配制:取7mmol/L的ABTS(Sigma公司，上海)水溶液与2.45mmol/L的过硫酸钾溶液混合，避光反应12h以上，实验前用甲醇将ABTS储备液稀释至747nm处吸光度值为0.65~0.75。
[0046]实施例1、
[0047]将新鲜玫瑰叶晒干后(其含水量为5%)，粉碎过20目筛得到玫瑰叶颗粒。称取50g玫瑰叶颗粒加入三角瓶后，加入500g去离子水，在70°C下提取3次，每次提取60min，合并得到的提取液。将合并后的提取液在4500r/min离心15min后得到1.5° Brix上清液，60°C减压浓缩，得到6° Brix浓缩液。将该浓缩液以1:2体积比依次加入乙醚、乙酸乙酯和水饱和正丁醇溶液，均萃取2次依次得到乙醚萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液和水萃取液。将上述各萃取液分别在50°C下减压浓缩至干，得到乙醚萃取物(Fa)2.36g，乙酸乙酯萃取物(Fb) 3.85g，正丁醇萃取物(Fe) 3.94g，和水萃取物(Fd) 2.97g，用甲醇溶液分别溶解定容至200mL,分别过0.45 μ m膜,经高效液相色谱分离,分离条件为:Agilent ZorbaxAQ柱(250mmX4.6mm 1.d.,5ym);流动相A相为水(含浓度2%甲酸)，流动相B相为乙腈；梯度洗脱程序:0 ~15min，0%~10% B ；15 ~20min，10% B ；20 ~30min，10%~15% B ；30 ~40min, 15% B ；40 ~50min, 15%~20% B ;50 ~60min, 20% B ；60 ~65min, 20%~30% B。进样量10 μ L ;流速为0.8ml/min ;柱温25°C;检测波长270nm和356nm。经检测器检测，得到四种萃取物的液相色谱图，记作成分图谱，并收集分离得到的各组分。
[0048]将配制好的ABTS自由基溶液以0.5mL/min流速泵入柱后反应系统，控温器温度为30°C,ABTS溶液流经反应系统后进入检测器，在747nm处吸光度值平衡后，基线调零。按上述条件将四种萃取物溶液分别进样，液相色谱分离得到的各组分与ABTS自由基溶液在柱后反应系统反应后进入检测器，记录270nm、356nm和747nm下的保留时间，分别得到相应的图谱，记作反应后图谱；对比反应后图谱中在270nm、350nm和747nm条件下的吸收峰，在相同的保留时间下，若270nm和350nm条件下的吸收峰在747nm条件下为负吸收峰时，则该保留时间对应的组分即为抗氧化活性物质，收集该保留时间下的组分即得到抗氧化活性物质。
[0049]其中，乙醚萃取物(Fa)的对比图如图3所示，乙酸乙酯萃取物(Fb)的对比图如图
4所示,正丁醇萃取物(Fe)的对比图如图5所示,水萃取物(Fd)的对比图如图6所示,筛选出具有负峰的组分即为抗氧化活性物质。
[0050]对各萃取物中筛选出的抗氧化活性物质采用液质联用技术进行定性分析。
[0051]结合各抗氧化物质的标准图谱，可以得知，乙醚萃取物中总共检测出槲皮素、槲皮素3-β -D-葡萄糖甙、牡荆苷等10种抗氧化物质；乙酸乙酯萃取物中检测出儿茶素、芦丁等14种抗氧化物质；正丁醇萃取物中检测出绿原酸等15种抗氧化物质；水萃取物中检测出中奎宁酸等11种抗氧化物质。
[0052]实施例2、
[0053]将新鲜玫瑰叶晒干后(其含水量为6%)，粉碎过20目筛得到玫瑰叶颗粒。称取50g玫瑰叶颗粒加入三角瓶后，加入1000g乙醇体积百分含量50%的乙醇水溶液，在70°C下提取2次，每次提取60min，合并得到1.2。Brix的提取液。将该提取液在4500r/min离心15min后得到上清液，再于55°C下减压浓缩，得到6° Brix的浓缩液。将该浓缩液以1:3体积比依次加入乙醚、乙酸乙酯和水饱和正丁醇溶液，萃取I次依次得到乙醚萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液和水萃取液。将各萃取液分别在45°C下减压浓缩至干，得到乙醚萃取物(Fa) 2.12g，乙酸乙酯萃取物(Fb) 3.89g，正丁醇萃取物(Fe) 3.57g，和水萃取物(Fd)
2.84g，用甲醇溶液分别溶解定容至200mL，分别过0.45 μ m膜，经高效液相色谱分离，分离条件为:Agilent Zorbax AQ 柱(250mmX4.6mm 1.d., 5 μ m);流动相 A 相为水(含浓度 2%甲酸)，流动相B相为乙腈；梯度洗脱程序:0~15min，0%~10% B ;15~20min，10% B ；20 ~30min, 10%~15% B ；30 ~40min, 15% B ；40 ~50min, 15%~20% B ；50 ~60min,20% B ；60 ~65min，20%~30% B。进样量 10 μ L ;流速为 0.8ml/min ;柱温 25°C ;检测波长270nm，356nm。经检测器检测，得到四种萃取物的液相色谱图，记作成分图谱，并收集分离得到的各组分。
[0054]将配制好的ABTS自由基溶液以0.7mL/min流速泵入柱后反应系统，控温器温度为35°C,ABTS溶液流经反应系统后进入检测器，在747nm处吸光度值平衡后，基线调零。按上述条件将四种萃取物溶液分别进样，液相色谱分离得到的各组分与ABTS自由基溶液在柱后反应系统反应后进入检测器，记录270nm、356nm和747nm下的保留时间，分别得到相应的图谱，记作反应后图谱；对比·反应后图谱中270nm、350nm和747nm条件下的吸收峰，在相同的保留时间下，若270nm和350nm条件下的吸收峰在747nm条件下为负吸收峰时，则该保留时间对应的组分即为抗氧化活性物质，收集该保留时间下的组分即得到抗氧化活性物质。
[0055]对各萃取物中筛选出的抗氧化活性物质采用液质联用技术进行定性分析。
[0056]结合各抗氧化物质的标准图谱，可以得知，乙醚萃取物中总共检测出槲皮素、槲皮素3-β -D-葡萄糖甙、牡荆苷等10种抗氧化物质；乙酸乙酯萃取物中检测出儿茶素、芦丁等14种抗氧化物质；正丁醇萃取物中检测出绿原酸等15种抗氧化物质；水萃取物中检测出中奎宁酸等11种抗氧化物质。
【权利要求】
1.一种玫瑰叶中抗氧化活性物质的提取方法，包括如下步骤: (1)新鲜的玫瑰叶经晒干后经粉碎过筛得到玫瑰叶颗粒； (2)用提取溶剂提取所述玫瑰叶颗粒，得到提取液；所述提取溶剂为水或乙醇水溶液； (3)所述提取液经离心得到上清液；所述上清液经浓缩得到浓缩液； (4)将所述浓缩液依次用乙醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇溶液进行萃取，分别得到乙醚萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液和水萃取液，再分别经浓缩得到乙醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物，分别标记为Fa、Fb、Fe和Fd，即提取得到了玫瑰叶中的抗氧化活性物质。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于:所述方法还包括对所述Fa、Fb、Fc和Fd中的抗氧化物质进行提取的步骤: 将所述Fa、Fb、Fe和Fd分别进行液相色谱分离，依次在检测波长为270nm和350nm的条件下得到萃取物的液相色谱图1 ;经分离后的各组分与自由基溶液进行反应，然后进入检测器进行检测，在检测波长为270nm、350nm和747nm的条件下得到各萃取物与所述自由基溶液反应后的化学成分图谱II ;对比所述化学成分图谱II中270nm、350nm和747nm条件下的吸收峰，在相同的保留时间下，若270nm和350nm条件下的吸收峰在747nm条件下为负吸收峰时，则该保留时间对应的组分即为抗氧化活性物质，收集该保留时间下的组分即为抗氧化活性物质。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:步骤(1)中，经所述晒干后的玫瑰叶的含水率为4%~8% ； 所述玫瑰叶颗粒的粒度为20~80目。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于:步骤(2)中，所述乙醇水溶液中乙醇的体积含量为10%~90% ；` 所述提取的温度为40~80°C，所述提取的时间为60~80min ； 所述提取溶剂与所述玫瑰叶颗粒的质量比为5~30:1 ; 所述提取的次数为I~3次。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于:步骤(3)中，所述离心的转速为3000~4800r/min,所述离心的时间为5~30min ； 所述浓缩的温度为40~80°C ; 所述浓缩液的浓度为5~8。Brix0
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于:步骤(4)中，所述浓缩液与所述乙醚的体积比为1:2~3; 乙醚萃余液与所述乙酸乙酯的体积比为1:2~3 ; 乙酸乙酯萃余液与所述水饱和正丁醇的体积比为1:2~3 ; 所述提取的次数为I~2次； 所述浓缩的温度为40~70V。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的方法，其特征在于:所述自由基溶液为2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐的水溶液； 所述自由基溶液在747nm处的吸光度值为0.65~0.75。
8.根据权利要求2-7中任一项所述的方法，其特征在于:所述反应的温度为25~35。。。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于:通过液质联用鉴定筛选出的所述抗氧化活性物质。`
【文档编号】A61P39/06GK103655802SQ201310646234
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月4日 优先权日:2013年12月4日
【发明者】高彦祥, 王媛莉, 袁芳 申请人:中国农业大学