一种纳米脂质超声造影剂及制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种纳米脂质超声造影剂及制备方法，该方法采用脂质薄膜分散加机械振荡法制备了粒径小、可稳定显像的纳米脂质造影剂，其外壳抗压性好，在低机械指数条件下不易破裂，并且在溶液中的溶解度和扩散率极低，可很好的进行微循环灌注，在血液中可以持续较长时间，具有良好的声学性质和稳定性，通过体内造影表明纳米脂质超声造影剂可明显增强心脏、肾脏、肝脏以及肿瘤显像，且造影时间长，可持续30min以上。
【专利说明】一种纳米脂质超声造影剂及制备方法
【技术领域】 [0001]本发明属于纳米材料制备领域，具体涉及一种纳米脂质超声造影剂的制备方法。
【背景技术】
[0002]超声波成像技术是一个广泛应用的，非侵入性及成本低的医疗成像方式，然而，普通超声成像如不借助造影剂，分辨率较低。与常规超声检查相比，超声造影具有动态、实时、连续显示脏器实质和病灶血管构架及组织灌注状况等优势，更重要的是，与其他方法相比，超声造影简便、易重复、廉价、无放射性、无肾毒性、安全性高。如今，超声造影已和增强CT、M一起列入肝脏的三种常规影像诊断方法，而且该技术也已推广至多个脏器的应用，如肾脏、胰腺、脾脏、甲状腺、乳腺、血管等，极大地推动了临床超声诊断的发展。
[0003]肿瘤的生长、侵袭、转移依赖于新生血管的形成。肿瘤血管通过增加氧气和营养供应从而实现快速增长、入侵和转移，然而，肿瘤组织中血管丰富、血管壁间隙较宽、结构完整性差，很多恶性肿瘤的肿瘤血管内皮细胞孔隙范围约380~780nm，这取决于不同的肿瘤细胞，同时，肿瘤组织淋巴回流差，造成大分子类物质和脂质颗粒具有选择性高通透性和滞留性，这种现象被称作实体瘤组织的增强渗透滞留效应(EPR, enhanced permeability andretention effect) ?肿瘤脉管系统的EPR效应可允许脂质体、高分子胶束等大分子药物和基因传递到肿瘤组织当中，可用于肿瘤组织影像诊断和治疗。因此，显像剂或抗癌治疗剂可以通过肿瘤血管用以靶向成像和治疗的基本要求就是要有一个小的粒径。
[0004]然而，目前临床上用的超声造影剂主要是微气泡造影剂，为包裹一定气体形成的壳膜微气泡结构，壳膜可防止微气泡之间的相互融合以及内部气体的释放，从而增强了造影剂的稳定性，微气泡直径1-8 μ m,不能透过血管壁到达位于超出毛细血管的细胞，如许多癌细胞，所以它们只能作为血池内显像剂，限制了对其血管外疾病的诊断与治疗。随着纳米技术研究的进一步深入，新型的亚微米级的超声造影剂正逐渐出现，包括具有与组织不同声学响应性的脂质体、微乳、纳米乳和一些纳米颗粒，这些纳米粒子作为超声造影剂，因为其独特的尺寸效应可同时具有靶向和治疗作用[Rapoport N, Gao Z&KennedyA.Multifunctional Nanoparticles for Combining Ultrasonic Tumor Imaging andTargeted Chemotherapy [J].J Natl Cancer Inst，2007，99 (14): 1095-1106]。实验研究发现，直径小于900um的超声造影剂具有良好的靶向性[Hughes M S，Marsh J N&Hall CS，et al.Acoustic Characterization in Whole Blood and Plasma of Site-TargetedNanoparticle Ultrasound Contrast Agent for Molecular Imaging[J].J Acoust SocAm，2005，117(2):964-972]。目前l_7um的超声造影剂被认为是显影效果较好的尺寸，但如果造影剂的尺寸很小，则能够穿过癌症新生血管的不规则血管壁进入肿瘤组织显影成像。
[0005]近年来，发展了许多新的方法和技术制造以纳米粒子为基础的靶向肿瘤的超声造影剂[Wheatley M A, Forsberg F&Dube N，et al.Surfactant-Stabilized ContrastAgent On the Nanoscale for Diagnostic Ultrasound Imaging[J].Ultrasound MedBiol, 2006, 32(1):83-93]。在几个研究中，制备了各种壳膜(磷脂或聚合物)和核心(气体，液体或固体)的纳米级超声造影剂，并且显示出较好的对比度增强[Marxer EE，Brussler J&Becker A, et al.Development and Characterization of New NanoscaledUltrasound Active Lipid Dispersions as Contrast Agents[J].Eur J PharmBiopharm, 2011, 77 (3):430-437]。纳米级造影剂用于肿瘤成像,主要是由于其高的组织外渗率，在肿瘤区域造影剂的增加可以达到令人满意的成像。脂质体因其具有如无毒，可生物降解，无免疫原性等优点，已被广泛用做治疗药物或基因的运送载体。这些类型的脂质材料也被用于包裹具有声反射的气体，现在有几种脂质膜的造影剂被常规应用于临床超声诊断当中[Goertz D E, de Jong N&van der Steen A F.Attenuation and Size DistributionMeasurements of Definity and Manipulated Definity Populations[J].Ultrasound MedBiol, 2007, 33(9): 1376-1388]。理想的气泡超声造影剂的基本要求包括:可通过毛细血管，有类似红细胞的血流动力学特征；稳定性好，具有良好的渗透性以及适当的表面张力，且进入人体后能够持续足够时间；能产生丰富的谐波；壳膜材料和包裹的气体无刺激、损伤或毒副作用。目前，已有多种材料被用来作为微气泡的包膜材料，主要分为以下几类:脂质类、表面活性剂类、蛋白质类和聚合物类。随着各种新型材料的出现和制备方法的提高，可制备同时装载气体、基因或药物的微气泡造影剂，实现超声显影增强进行诊断的同时，还可进一步达到传输药物、靶向定位和疾病治疗等多种功能，已经逐渐成为超声医学研究的热点。气泡造影剂内的气体成分主要包括氮气、六氟化硫、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷、全氟己烷等。包裹空气的微气泡造影剂静脉注射进入人体内后，空气能很快溶解到血液当中，决定了它持续时间短，容易破裂，导致造影诊断还没有结束，微气泡已消失，从而限制了临床应用中观察和诊断的时间，此外，超声能量作用下由于气泡的收缩和扩展，会进一步加速微气泡的破坏。包裹高密度惰性气体(不易溶于水或血液)为主的外膜薄而柔软的气泡,稳定时间长，振动及回波特性好。[0006]随着纳米材料制备技术的发展，气泡造影剂的尺寸和稳定性已经能够得到控制，成为临床超声造影的有用工具。当微泡的大小被减小到纳米级时，造影剂的分子特性发生重大变化，出现了一些独特的性质，包括半衰期长，高表面反应性，吸附力强，酶抗性退化等。所有这些属性有利于新的纳米级造影剂在医学上的应用。研究显示Pluronic嵌段共聚物可以稳定纳米粒子，控制它们的大小，与脂质膜相互作用，改变脂质的流动性或脂质泡壳的弹性，防止粒子被网状内皮系吞曬等作用。Tianyi M等[Krupka T M, SolorioL&ffilson R E, et al.Formulation and Characterization of Echogenic Lipid-PluronicNanobubbles [J].Mol Pharm, 2010, 7(1):49-59]研究了分子量范围 1100 ~4600 的 5种Pluronic嵌段共聚物(L31，L61，L81，L64和P85)加入到脂质外壳脂质膜中水合，后充入全氟化碳气体，结果表明其余脂质膜的相互作用可显著减少气泡的大小，最重要的是，研究结果表明虽然是一种纳米尺度的气泡，它们的稳定性以及和在体外和体内的回声不受损害，由此产生的纳米气泡更适合用于肿瘤增强成像和后续治疗基因或药物的递送。
[0007]超声造影技术是将超声造影剂经静脉注入人体内后，利用造影剂使后散射回声增强，从而明显提高超声诊断的分辨力、敏感性和特异性的技术。随着超声仪器性能的改进和新型声学造影剂的出现，超声造影已经在心肌、肝、胆、胰、脾、肾、盆腔脏器等疾病和腹腔肿瘤、乳腺肿瘤、甲状腺及浅表淋巴结等领域被广泛应用。超声造影在检出占位性病变、定性诊断和判断肿瘤活性方面，其所获得的增强结果可与增强CT或MRI相媲美，并且其具有所使用剂量小，对人体无明显毒副作用及过敏现象，无辐射，操作简便，实时动态，可重复检查的优点。超声造影技术除了常规的造影谐波成像外，还有低机械指数成像、间歇式超声成像、能量对比谐波成像、造影剂爆破成像、受激声波发射成像、反脉冲谐波成像等方法。低机械指数成像是指当采用发射的超声，其机械指数MI低于0.15时，称为低机械指数。采用这种低于超声造影剂被击破时的能量的超声波进行的造影称为低机械指数造影。这种方法可以实现血流连续谐波成像，也能减少组织谐波的干扰。本研究采用了实时造影匹配成像造影技术(CnTI)进行纳米超声造影剂的体内外超声造影，CnTI使用频域处理的方法，发射时，仅发射“纯的”基波信号，接收时，主要处理二次谐波的信号，在提取造影剂谐波信号的同时并消除组织回波的线性基波成分，可增强造影剂的分辨力，提高信噪比、改善声学图像质量和提升图像的对比度，使得病灶的边界及血管显像比常规影像更加清晰[FrinkingP J, Bouakaz A&Kirkhorn J, et al.Ultrasound Contrast Imaging:Current and NewPotential Methods [J].Ultrasound Med Biol, 2000，26(6):965-975]。超声造影剂对超声波产生的回波信号是超声造影诊断成像的物理基础，其原理在于气泡的可压缩性，造影剂在超声波作用下表现为“膨胀一压缩一再膨胀一再压缩”的非对称共振运动，气体比软组织等生物组织更易压缩，因此当微气泡受到超声脉冲波辐照时，微气泡经历了交替的收缩和膨胀过程，出现基波、二次谐波、次谐波等各种复杂的回波响应，导致复杂的微气泡造影剂超声成像机理，新型超声造影剂及造影技术为超声造影定量研究提供了有力手段。
[0008]目前临床使用超声造影剂平均直径为数微米，而疾病状态中的血管内皮间隙至多允许直径小于700nm的颗粒穿过，因此微米级超声造影剂不能穿透血管内皮间隙，大大减弱了其用于治疗的能力。因此需要制备出不再局限于仅获取组织的血流灌注信息，而是通过提高超声显像的特异性并向治疗领域发展的造影剂。但随着超声造影剂从单一的诊断功能到结合基因或药物进行治疗等多功能的实现，微气泡的研究和应用正变得越来越广泛，因此，制备粒径更小、性质稳定、回声增强效果好的超声造影剂十分重要。纳米级造影剂粒径更小，赋予它们极强的穿透力，因此近年来成为研究的热点。
【发明内容】
[0009]技术问题:本发明提供了一种可实现肿瘤血管外靶向显影，运用于肿瘤组织影像诊断和治疗中的纳米脂质超声造影剂，同时提供了简单、易行的制备上述纳米脂质超声造影剂的方法。
[0010]技术方案:本发明的纳米脂质超声造影剂的制备方法，包括下述步骤:
[0011](I)按照摩尔比80:12:8~85:10:5称取二硬脂酰基卵磷脂、二苯基磷酰基叠氮化物、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，混合后置于容器中；
[0012](2)向步骤(1)制得的混合物中加入氯仿和甲醇的混合液，混合物与混合液的质量体积比为0.0005g/ml~0.001 g/ml,混合液中氯仿与甲醇的体积比为1:1~2:1,然后进行超声震荡，直至容器中的上述混合物质充分溶解；
[0013](3)将放置有步骤(2)制得混合物质的容器安于旋转蒸发器上，在50~55V、转速80~lOOr/min、抽真空条件下运行，使容器中的有机溶剂充分挥发，直至容器瓶壁形成一层白色、均匀的脂质薄膜；
[0014](4)按照质量体积比1.5~2毫克/毫升，向0.01~0.lmol/L的磷酸盐缓冲液中加入嵌段式聚醚F-68，然后将其加入到步骤(2)得到的附着有脂质薄膜的容器中，溶解脂质薄膜后，超声分散直至瓶壁薄膜完全脱落，使其形成磷脂浓度为3~5毫克/毫升的脂质悬液；
[0015](5)将得到的脂质悬液加入到容器中，充入六氟化硫气体后，振荡直至脂质悬液呈乳白色，黏稠，不透明；
[0016](6)静置后弃去上层泡沫，低速离心后使脂质悬液分层，弃去上层粒径较大的微气泡，取下层的乳白色液体漂洗3至5次，重悬即得纳米脂质造影剂。
[0017]本发明的纳米脂质超声造影剂，是按照上述方法制备得到的。
[0018]本发明的纳米脂质超声造影剂，可在超声成像、特别是肿瘤血管外靶向显影以及治疗、特别是肿瘤组织靶向和定位治疗中的应用。
[0019]有益效果:本发明与现有技术相比，具有以下优点:
[0020]本发明采用薄膜分散法加机械振荡法制备了纳米级脂质超声造影剂，并对制备的微气泡进行了结构表征和稳定性考察。通过对大鼠及荷瘤鼠进行超声造影，观察大鼠心、肝、肾实质回声增强情况以及肿瘤的显像情况，并与普通微米级脂质造影剂的显影效果进行了比较。采用机械振荡法制备的纳米级脂质造影剂，电镜下呈圆球形外观，外包被一层脂质膜，内充有透亮的SF6气体，分散度好，粒径测量仪示平均粒径为413.8nm, zeta电位值为-23.39mV。EDS分析结果示纳米级脂质泡中含有包裹的气体成分氟和硫以及组成脂质膜的碳、氮、氧和磷等元素。纳米级脂质造影剂对L-929细胞的细胞毒性为I级，属对细胞无毒性范畴，无溶血发生。体外超声显影显示纳米级脂质造影剂表现出与微米级脂质造影剂以及声诺维的微气泡相类似的超声对比增强能力。体内造影静脉注射纳米级脂质造影剂后，与造影前相比，大鼠心脏、肝脏和肾脏可见明显、持续的增强显像。移植瘤超声造影的时间-强度曲线分析表明，纳米级脂质造影剂与普通脂质微泡造影剂相比较，达峰时间晚，峰值强度略低，但造影增强持续时间更长`。在体循环15min后，普通微泡在肿瘤血管内已基本被清除，而纳米级脂质泡仍有部分位于肿瘤组织区域。该纳米脂质超声造影剂可实现肿瘤血管外靶向显影，可运用于肿瘤组织影像诊断和治疗中。
[0021]本发明方法中采用采用薄膜分散加机械振荡法成功制备了表面带负电荷的纳米级超声造影剂，该方法简单、易行。纳米级超声造影剂具有良好的生物相容性，无细胞毒性及溶血发生。体外超声显影评价实验表明，在相同超声成像条件下，脂质纳泡表现出与微米级脂质造影剂以及商品化的声诺维微气泡相类似的超声对比增强能力。体内造影，静脉注射纳米级造影剂后，与造影前相比，大鼠心脏、肝脏和肾脏可见明显、持续的增强显像。移植瘤超声造影的时间-强度曲线分析表明，纳米级脂质泡与普通脂质微泡造影剂相比较，达峰时间较晚，峰值强度略低，增强持续时间更长。在体循环15min后，普通微泡在肿瘤血管内基本被清除，而纳米级脂质泡仍有部分位于肿瘤组织区域。该纳米级超声造影剂具有良好的影像增强作用，因其粒径小，可穿过肿瘤新生毛细血管内皮间隙，可实现肿瘤血管外靶向显影，可运用于肿瘤组织影像诊断和治疗中。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1是纳米脂质造影剂的透射电镜图。
[0023]图2是超声图像ROI平均灰阶计算结果。[0024]图3是纳米级超声造影剂与微米级超声造影剂肿瘤超声造影时间-强度曲线。【具体实施方式】
[0025]下面通过实施例对本发明方案做进一步具体说明。
[0026]1主要试剂:二硬脂酰基卵磷脂(DSPC) ;二苯基磷酰基叠氮化物(DPPA) ;二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000);六氟化硫气体(SF6) ；PluronicF-68 ；RPMI1640培养基、小牛血清；噻唑蓝(MTT，AMRESC0) ;二甲基亚砜(DMSO, Sigma公司)。
[0027]2纳米脂质造影剂的制备及检测
[0028]2.1纳米脂质造影剂的制备
[0029]实施例1:
[0030]采用脂质薄膜分散加机械振荡法制备纳米脂质造影剂，包括下述步骤:
[0031](1)按照摩尔比80:12:8称取二硬脂酰基卵磷脂、二苯基磷酰基叠氮化物、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，混合后置于容器中；
[0032](2)向步骤(1)制得的混合物中加入氯仿和甲醇的混合液，混合物与混合液的质量体积比为0.0005g/ml，混合液中氯仿与甲醇的体积比为2:1，然后进行超声震荡，直至容器中的上述混合物质充分溶解；
[0033](3)将放置有步骤(2)制得混合物质的容器安于旋转蒸发器上，在50°C、转速lOOr/min、抽真空条件下运行，使容器中的有机溶剂充分挥发，直至容器瓶壁形成一层白色、均匀的脂质薄膜；
[0034](4)按照质量体积比2毫克/毫升，向0.lmol/L的磷酸盐缓冲液中加入嵌段式聚醚F-68，然后将其加入到步骤(2)得到的附着有脂质薄膜的容器中，溶解脂质薄膜后，超声分散直至瓶壁薄膜完全脱落，使其形成磷脂浓度为3毫克/毫升的脂质悬液；
[0035](5)将得到的脂质悬液加入到容器中，充入六氟化硫气体后，振荡直至脂质悬液呈乳白色，黏稠，不透明；
[0036](6)静置后弃去上层泡沫，低速离心后使脂质悬液分层，弃去上层粒径较大的微气泡，取下层的乳白色液体漂洗3至5次，重悬即得纳米脂质造影剂。
[0037]实施例2，基本流程步骤同实施例1，不同之处如下:
[0038]步骤(1)中按照摩尔比83:11:6称取二硬脂酰基卵磷脂、二苯基磷酰基叠氮化物、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000制备纳米脂质造影剂；
[0039]步骤(2)中按照步骤(1)制得的混合物与氯仿甲醇混合液的质量体积比为
0.0008g/ml制备纳米脂质造影剂，氯仿与甲醇的体积比为1.5:1。
[0040]步骤(3)中，将步骤(2)制得混合物安于旋转蒸发器上，在51°C、转速80r/min、抽真空条件下运行。
[0041]步骤(4)中，按照质量体积比1.5毫克/毫升，向0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中加入嵌段式聚醚F-68，然后将其加入到步骤(2)得到的附着有脂质薄膜的容器中，溶解脂质薄膜后，超声分散形成磷脂浓度为4毫克/毫升的脂质悬液。
[0042]本实施例中，其余操作和物质成分之比，均与实施例1相同。
[0043]实施例3，基本流程步骤同实施例1，不同之处如下:
[0044]步骤(1)中按照摩尔比85:10:5称取二硬脂酰基卵磷脂、二苯基磷酰基叠氮化物、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000制备纳米脂质造影剂；
[0045]步骤(2)中按照步骤(1)制得的混合物与氯仿甲醇混合液的质量体积比为
0.001g/ml制备纳米脂质造影剂，氯仿与甲醇的体积比为1:1。
[0046]步骤(3)中，将步骤(2)制得混合物安于旋转蒸发器上，在55°C、转速90r/min、抽真空条件下运行。
[0047]步骤(4)中，按照质量体积比1.8毫克/毫升，向0.05mol/L的磷酸盐缓冲液中加入嵌段式聚醚F-68，然后将其加入到步骤(2)得到的附着有脂质薄膜的容器中，溶解脂质薄膜后，超声分散形成磷脂浓度为5毫克/毫升的脂质悬液。
[0048]本实施例中，其余操作和物质成分之比，均与实施例1相同。
[0049]2.2电镜形态学检测
[0050]取出少量制备的纳米脂质造影剂，滴有膜铜网，制得电镜样品，在H-600型透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM)下观察。自制纳米脂质造影剂为乳白色混悬液，透射电镜下，纳米脂质造影剂呈圆球形外观，外包被一层脂质膜，内充有透亮的SF6气体，分散度好(图1)。血球计数仪测纳米微泡平均浓度为(1.19 ±0.11) X 109/ml。在-4°C冰箱保一周，造影剂粒径、分布仍较均匀，未见明显粘着成团。
[0051 ] 2.3扫描电子显 微镜能谱仪(SEM-EDS)表征分析
[0052]取少量制备的纳米脂质造影剂，取适量悬液滴加在铜网上，在SEM视野下任意选几个视野，用能谱仪对其成份进行分析，可见其中含有包裹的气体氟和硫以及组成脂质膜的碳、氮、氧和磷等元素，证实纳米脂质造影剂已制备成功。
[0053]2.4粒径及zeta电位分析
[0054]分别取2mL用PBS缓冲液(pH7.4)稀释过的纳米脂质造影剂置于比色皿中，用激光粒度分析仪(Brookhaven仪器公司)进行粒径、Zeta电位测定,应用动态光散射软件进行数据处理，记录平均粒径、多分散性指数及表面电位，每个样本重复3次。由激光粒度分析仪检测到纳米脂质造影剂平均直径为413.8±12.0nm，呈单峰状，粒径分布窄；而微米脂质造影剂的平均直径1763.7± 185.4nm。在pH7.4中性环境中，纳米脂质造影剂的zeta电位值为-23.39 ±0.96mV，而微米脂质造影剂的zeta电位为-1.6 ±3.09mV。
[0055]2.5纳米脂质造影剂的稳定性及浓度测定
[0056]4°C冰箱保存，一周后观察其稳定性；应用血球计数仪在光镜下测定纳米脂质造影剂的浓度，计算计数板5个中格纳泡总数，压线纳泡只计左侧和上方的，按以下公式计算:纳泡数/ ml= (5个中格纳泡总数/ 5) X25X稀释倍数XlO4 / ml。
[0057]3纳米脂质造影剂的细胞毒性试验一MTT法
[0058]3.1L-929细胞的培养
[0059]L-929细胞接种于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，在37°C，饱和湿度、5%C02的培养箱中培养，每2-3天传代一次，实验时取对数生长期细胞。
[0060]3.2纳米脂质造影剂的细胞毒性实验(MTT)
[0061]取对数生长期的L-929细胞，常规消化成细胞悬液并调整细胞浓度至5X 104/mL，以100 μ L/孔接种96孔培养板，置37°C，5%C02的培养箱中培养，24小时后弃去原液，加入各种不同磷脂浓度(I μ g/ml,5 μ g/ml、10 μ g/mL和15 μ g/mL) RPMI1640培养液，阴性对照为1640培养液，阳性对照为0.7%的聚丙烯酰胺单体溶液，每组设复孔8个，继续培养72小时后，用倒置显微镜观察L929细胞的形态学变化，接着每孔加入20 μ LMTT,原条件培养4小时，弃去孔内液体，加入DMS0150 μ L/孔，震荡十分钟后，在免疫酶标仪上测定492nm处的吸光度值。按下式计算细胞相对增殖率，计算公式如下(relative growth rate, RGR):RGR%=实验组OD均值/阴性对照组OD均值X 100%,并按表1规定把RGR值转换成6级反应，实验结果为O或I级反应为合格，实验结果为2级反应的结合细胞形态综合评价，实验结果为3-5级反应为不合格。
[0062]表1RGR与毒性分级转换表
[0063]
【权利要求】
1.一种纳米脂质超声造影剂的制备方法，该方法包括下述步骤: (1)按照摩尔比80:12:8^85:10:5称取二硬脂酰基卵磷脂、二苯基磷酰基叠氮化物、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，混合后置于容器中； (2)向所述步骤(1)制得的混合物中加入氯仿和甲醇的混合液，混合物与混合液的质量体积比为0.0005 g/mf0.001g/ml，所述混合液中氯仿与甲醇的体积比为1:广2:1，然后进行超声震荡，直至容器中的上述混合物质充分溶解； (3)将放置有所述步骤(2)制得混合物质的容器安于旋转蒸发器上，在5(T55°C、转速8(Tl00r/min、抽真空条件下运行，使容器中的有机溶剂充分挥发，直至容器瓶壁形成一层白色、均匀的脂质薄膜； (4)按照质量体积比1.5^2毫克/毫升，向0.01~0.lmol/L的磷酸盐缓冲液中加入嵌段式聚醚F-68，然后将其加入到所述步骤(2)得到的附着有脂质薄膜的容器中，溶解脂质薄膜后，超声分散直至瓶壁薄膜完全脱落，使其形成磷脂浓度为3飞毫克/毫升的脂质悬液； (5)将得到的脂质悬液加入到容器中，充入六氟化硫气体后，振荡直至脂质悬液呈乳白色，黏稠，不透明； (6)静置后弃去上层泡沫，低速离心后使脂质悬液分层，弃去上层粒径较大的微气泡，取下层的乳白色液体漂洗3至5次，重悬即得纳米脂质造影剂。
2.—种纳米脂质超声造影剂，其特征在于，该造影剂是根据权利要求1所述方法制备得到的。
【文档编号】A61K49/22GK103638534SQ201310638162
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月2日 优先权日:2013年12月2日
【发明者】张东生, 李宏波 申请人:东南大学