淫羊藿多糖及其组分和它们用于疫苗佐剂的用途

淫羊藿多糖及其组分和它们用于疫苗佐剂的用途
【专利摘要】本发明涉及淫羊藿的多糖提取物，具体地，本发明涉及从中药材淫羊藿叶中提取的淫羊藿总多糖及其其中的酸性糖组分和非糖组分，以及它们用于制备疫苗佐剂、疫苗制剂、疫苗组合物或抗体的用途。本发明还涉及包含所述淫羊藿总多糖及其组分的药物组合物、疫苗佐剂、疫苗制剂或疫苗组合物。
【专利说明】淫羊藿多糖及其组分和它们用于疫苗佐剂的用途
[0001]本申请是基于申请号为201110220409.0，申请日为2011年8月3日，发明名称为“淫羊藿多糖及其组分和它们用于疫苗佐剂的用途”的中国专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及淫羊藿的多糖提取物，具体地，涉及从中药材淫羊藿叶提取的淫羊藿总多糖及其其中的酸性糖组分和非糖组分，本发明还涉及所述的淫羊藿总多糖及其其中的酸性糖组分和非糖组分用于疫苗佐剂、疫苗组合物和抗体制备的用途。
【背景技术】
[0003]淫羊藿(Epimedium)为小檗脸科(Berberidaceae)植物,常用于补肾壮阳、祛风除湿和益气。现代药理研究表明淫羊藿具有镇咳、去痰、平喘、抑菌等活性。淫羊藿中主要化学成分有黄酮、木质素、生物碱以及多糖等。近年来有以下文献报道有关淫羊藿多糖对动物免疫功能的影响，具体内容如下:
[0004]徐颖等(沈阳药科大学学报，2000，17 (6):434 一 437)采用淫羊藿水煎、醇沉、洗涤和透析获得淫羊藿多糖。该多糖腹腔注射给予环磷酰胺所致的免疫低下小鼠及荷瘤(S180)小鼠，观察对免疫功能的影响。结果表明该多糖50、25mg/kgX7d，可使脾重量指数上升，使下降的溶血素值及空斑形成细胞的溶血能力回升，使下降的白细胞总数上升。小鼠荷瘤后免疫功能低下，皮下注射该多糖50mg/kgX8d可对抗荷瘤引起的胸腺指数下降，，使荷瘤小鼠的血清溶血素、空斑形成细胞的溶血能力及迟发性超敏反应能力有所提高.[0005]王刚等(武警医学院学报，2003，12 (3):194 - 196)由水煎煮提取、结晶、透析48h方法获得淫羊藿多糖。该多糖12.5、25.0和50.011^/1^连续给予荷瘤小鼠皮下注射8(1。结果表明淫羊藿多糖可显著提高小鼠因荷瘤所导致的胸腺指数下降，溶血素形成减少，溶血空斑值降低以及迟发性超敏反应低下。
[0006]靳录洋等(甘肃畜牧兽医，2004，28 (3):7 一 10)观察不同浓度的淫羊藿多糖(EPS，多糖含量为32.30%)对正常罗曼雏鸡免疫功能的影响。试验结果表明EPS可使外周血淋巴细胞转化率和ND-HI抗体效价明显升高。罗艳等采用相同的淫羊藿多糖，探讨淫羊藿多糖(EPS)对雏鸡免疫功能和禽流感一新城疫重组二联苗免疫效果的影响。结果表明不同浓度EPS均能显著提高淋巴细胞转化率、中性粒细胞吞噬力、A1-HI和ND-HI抗体效价、红细胞-C3b花环率，降低红细胞-1C花环率，且中剂量效果较好
[0007]张述斌等(甘肃畜牧兽医，2004，28 (4):24 — 25)采用Ca (OH) 2水提取工艺制备淫羊藿多糖，苯?)—硫酸法测定糖含量为73.68%。实验结果表明该多糖鸡新城疫疫苗有明显的免疫增强作用，用该多糖免疫后鸡血清中HI抗体效价比对照鸡明显提高，而且维持时间延长。此外，T淋巴细胞ANAE阳性率与HI抗体效价有相应的消长趋势。
[0008]孔祥峰等(畜牧兽医学报，2004，35(4)，468-472)用新城疫IV系疫苗免疫雏鸡，在免疫前、后分别注射高、低剂量淫羊藿多糖(糖含量为66.38%)，均能不同程度地提高抗体效价，且与给药时间、剂量和免疫接种次数有一定关系。寸.fcVf/^蛋膽柃辑铽<-1轺恶靶将坩~宕Vfz 8寸~ZT S~寸_侧呎鞞頰趔_轺戬螂辰癍1/|蚺 〔￡300〕。农资屮农vf/趄癍靼电3呜谍渺_臌左缠诮Ta^戬螂辰癍运蚺扫頰 〔300〕
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[0025](3)步骤I)中，加入水浸提的温度为4~60°C，优选为20~60°C，更优选为20~500C。在此温度范围内，不会破坏糖的性质，且随温度升高，糖的得率增加。
[0026](4)步骤I)中，将浸提后得到的淫羊藿叶按照相同条件进行一次或多次浸提，合并水提液；
[0027]在本发明的一个实施方案中，进行两次浸提。
[0028](5)步骤I)中水的用量为淫羊藿叶的5 — 20倍量(L/Kg)；
[0029](6)步骤I)中，浸提期间进行搅拌；
[0030](7)步骤I)中，将得到的水提液在50°C — 55°C下进行减压浓缩，得到浓缩的水提液；
[0031](8)步骤2)中，乙醇沉淀的条件是:醇沉后乙醇的终浓度为60 - 80%，例如70-75% ;优选地，醇沉的时间大于12小时，例如为48-72小时；
[0032](9)步骤2)中，将乙醇沉淀后离心得到的沉淀再进行一次或多次乙醇沉淀；
[0033](10)步骤2)中，透析所用的透析袋的截留分子量大于1000 ；
[0034](11)步骤2 )中 ，用自来水和/或蒸馏水进行透析；
[0035](12)步骤2)中，透析时间为24~72小时，透析进行一次或多次；
[0036](13)步骤3)中，在冷冻干燥之前，将得到的透析液在50°C — 55°C下进行减压浓缩。
[0037]在本发明的一个实施方案中，所述的淫羊藿多糖是通过以下方法制备的:
[0038]取淫羊藿叶，向其中加入蒸馏水浸泡，期间不时搅拌；过滤，滤液离心；浸提后的淫羊藿叶在同样条件下进行第二次提取；合并两次提取的水提液，减压浓缩，然后加入3~4倍体积的乙醇进行醇沉；醇沉液离心,将沉淀部分加入水中搅拌溶解，离心，沉淀再同样操作二次；合并溶解的上清液，装入透析袋，截留分子量>1000，用水透析；将所得透析液减压浓缩后，装入小瓶进行冷冻干燥，获得所述淫羊藿多糖。
[0039]在另一个实施方案中，本发明所述的淫羊藿多糖是通过如下方法获得的:
[0040]取淫羊藿叶，向其中加入石油醚浸没浸泡；过滤，将滤液减压回收浸膏；浸提后的淫羊藿叶自然挥干后，向其中加入蒸馏水浸泡，期间不时搅拌；然后过滤，滤液离心，浸提后的淫羊藿叶在同样条件下进行第二次提取；合并两次提取的水提液，减压浓缩，然后加入3~4倍体积的乙醇进行醇沉；醇沉液离心，向沉淀部分中加入水搅拌溶解，离心，再将沉淀同样操作二次；合并溶解的上清液，装入透析袋，截留分子量>1000，用水透析；将得到的透析液减压浓缩后，装入小瓶进行冷冻干燥，获得所述淫羊藿多糖。
[0041]本发明的第二方面涉及一种淫羊藿多糖，或者根据本发明第一方面任一项所述的淫羊藿多糖，其特征在于
[0042](I)含糖量为25-45% (以葡萄糖计算)，糖醛酸含量为5_20% (以半乳糖醛酸计算)；和/或
[0043]( 2 )其具有附图1和附图2所示的特征。
[0044]在本发明的一个实施方案中，含糖量为35.60% (以葡萄糖计算)，糖醛酸含量为
7.53% (以半乳糖醛酸计算)。
[0045]本发明的第三方面涉及一种淫羊藿酸性多糖组分，其为根据本发明第一方面或第二方面任一项所述的淫羊藿多糖经DEAE-纤维素柱层析，得到的具有硫酸-苯酚显色、490nm波长吸收的0.25mol/L NaHCO3洗脱部分。
[0046]本发明的第四方面涉及一种淫羊藿酸性多糖组分，或者根据本发明第三方面所述的淫羊藿酸性多糖组分，其特征在于:
[0047]包含鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖以及半乳糖醛酸；以及，其分子量为6000~20000。
[0048]根据本发明第四方面的淫羊藿酸性多糖组分，其特征在于，
[0049](I)含糖量为45-65% (以葡萄糖计算)，糖醛酸含量为5_15% (以半乳糖醛酸计算)；和/或
[0050](2)鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的摩尔比为鼠李糖:岩藻糖:阿拉伯糖:木糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖=1.00:0.33:4.44:0.38:0.64:0.87:5.26。
[0051]在本发明的一个实施方案中，含糖量为58.93% (以葡萄糖计算)，糖醛酸含量为
8.40% (以半乳糖醛酸计算)。
[0052]在本发明的实施方案中，含糖量(以葡萄糖计)的测定方法为硫酸一苯酚法；糖醛酸含量(以半乳糖醛酸计)的测定方法为间羟联苯法。
[0053]本发明的第五方面涉及一种淫羊藿非糖组分，其为本发明第一方面或第二方面任一项所述的淫羊藿多糖经DEAE-纤维素柱层析，得到的具有280nm吸收的0.25mol/LNaHCO3洗脱部分。
[0054]本发明的第六方面涉及一种淫羊藿非糖组分，或者根据本发明第五方面所述的淫羊藿非糖组分，其为淫羊藿多糖的非糖组分，其分子量为2000~10000。
[0055]本发明的第七方面涉及一种药物组合物，其包含本发明第一方面至第六方面任一项的淫羊藿多糖和/或淫羊藿酸性多糖组分和/或淫羊藿非糖组分，以及药学上可接受的辅料。
[0056]本发明的第八方面涉及一种疫苗佐剂，其包含本发明第一方面至第六方面任一项的淫羊藿多糖和/或淫羊藿酸性多糖组分和/或淫羊藿非糖组分。
[0057]本发明的第九方面涉及一种疫苗制剂或疫苗组合物，其包含本发明第一方面至第六方面任一项的淫羊藿多糖和/或淫羊藿酸性多糖组分和/或淫羊藿非糖组分。
[0058]本发明的第十方面涉及本发明第一方面至第六方面任一项的淫羊藿多糖和/或淫羊藿酸性多糖组分和/或淫羊藿非糖组分用于制备疫苗佐剂、疫苗制剂、疫苗组合物或抗体的用途。
[0059]本发明还涉及一种制备抗体的方法，其包括使用有效量的本发明第一方面至第六方面任一项的淫羊藿多糖和/或淫羊藿酸性多糖组分和/或淫羊藿非糖组分的步骤。
[0060]本发明还涉及一种免疫方法或者接种方法，包括给予哺乳动物有效量的疫苗制剂或疫苗组合物的步骤。
[0061]在本发明中，所述淫羊藿多糖组分是指从淫羊藿总多糖中分离得到的不同组分。在本发明的一个实施方案中，为其中的酸性糖组分，例如为YYH-Gl。在本发明的另一个实施方案中，为其中的非糖组分，例如为YYH-G4。
[0062]在本发明中，所述疫苗包括减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、DNA疫苗或多肽疫苗。
[0063] 在本发明中，所述有效量是指给予哺乳动物实现能够免疫效果的疫苗制剂或疫苗组合物的剂量。
[0064]发明的有益效果
[0065]本发明从淫羊藿叶中通过水浸提的方式提取得到淫羊藿总多糖，进而分离得到其中的多糖组分和非糖组分，并对其进行了鉴定，进一步明确了其组成成分。实验证明得到的淫羊藿总多糖及其多糖和非糖组分均能够增强免疫应答，具有良好的佐剂作用，为疫苗和抗体的制备提供了新途径。同时，分离得到了淫羊藿总多糖中具有佐剂作用的多糖组分和非糖组分，为淫羊藿总多糖的佐剂作用机制研究奠定了基础，为找到具有更好佐剂效果的多糖或非糖制剂提供了可能。
【专利附图】

【附图说明】
[0066]图1为总多糖YYH-G的DEAE —纤维素柱层析洗脱曲线，苯酚一硫酸法检测，490nm波长检测糖吸收峰
[0067]图2为总多糖YYH-G的DEAE —纤维素柱层析洗脱曲线，280nm波长检测非糖成分
[0068]图3为OVA抗原配伍多糖YYH-G免疫I次后小鼠血清抗体滴度，mean土SD，n=5
[0069]图4为OVA抗原配伍多糖YYH-G免疫2次后小鼠血清抗体滴度，mean土SD，n=5
[0070]图5为OVA抗原配伍多糖YYH-G免疫3次后小鼠血清抗体滴度，mean土SD，n=5[0071 ] 图6为OVA抗原配伍多糖YYH-Gl或YYH-G4免疫I次后小鼠的抗体滴度，mean 土 SD，n=5
[0072]图7为OVA抗原配伍多糖YYH-Gl或YYH-G4免疫2次后小鼠的抗体滴度，mean 土 SD，n=5
[0073]图8为HlNl病毒抗原配伍多糖YYH-Gl免疫I次后小鼠血清抗体滴度，mean土SD，n=5
[0074]图9为HlNl病毒抗原配伍多糖YYH-G4免疫I次后小鼠血清抗体滴度，mean土SD，n=5
[0075]图10为HlNl病毒抗原配伍多糖YYH-Gl免疫2次后小鼠血清抗体滴度，mean土SD，n=5
[0076]图11为HlNl病毒抗原配伍多糖YYH-G4免疫2次后小鼠血清抗体滴度，mean土SD，n=5
[0077]图12为HlNl病毒抗原配伍多糖YYH-Gl或YYH-G4免疫I次后小鼠血清抗体滴度，mean 土 SD，n=5
【具体实施方式】
[0078]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0079]实施例1:淫羊蕾总多糖的制备[0080]淫羊藿叶1kg,室温下加入石油醚浸没浸泡24小时,过滤,滤液30~35°C减压回收浸膏。经过石油醚浸提后的淫羊藿叶自然挥干后，加入15L蒸馏水，室温下(20~30°C)浸泡48小时，期间不时搅拌；然后过滤，滤液离心IOmin(转速3000r/min)，浸提后的淫羊藿叶在同样条件下进行二次提取。合并二次提取的水提液，50~55°C减压浓缩至1000ml，然后加入3倍体积(3000ml )95%的乙醇进行48小时的醇沉。醇沉液离心IOmin(转速3000r/min)，沉淀部分加入1000ml水搅拌溶解，离心，沉淀再同样操作二次。合并溶解的上清液，装入透析袋(截留分子量>1000)，自来水透析48小时后换蒸馏水再透析24小时。该透析液50~55°C减压浓缩至200ml左右，装入小瓶进行冷冻干燥，获得棕色粉末，即总多糖(得率为 0.74%)。
[0081]实施例2:淫羊蕾总多糖的制备
[0082]淫羊藿叶1kg，室温下加入15L蒸馏水，室温下(20~30°C)浸泡48小时，期间不时搅拌；然后过滤，滤液离心IOmin (转速3000r/min),浸提后的淫羊藿叶在同样条件下进行二次提取。合并二次提取的水提液，50~55°C减压浓缩至1000ml，然后加入3倍体积(3000ml )95%的乙醇进行48~72小时的醇沉。醇沉液离心IOmin(转速3000r/min)，沉淀部分加入1000ml水搅拌溶解，离心，沉淀再同样操作二次。合并溶解的上清液，装入透析袋(截留分子量> 1000 )，自来水透析48小时后换蒸馏水再透析24小时。该透析液50~55 °C减压浓缩至200ml左右，装入小瓶进行冷冻干燥，获得棕色粉末，即总多糖(得率为0.81%)。
[0083]实施例3:淫羊蕾总多糖的制备
[0084]淫羊藿叶1kg，在55~60°C温度下加入15L蒸馏水，浸泡48小时，期间不时搅拌；然后过滤，滤液离心IOmin (转速3000r/min)，浸提后的淫羊藿叶在同样条件下进行二次提取。合并二次提取的水提液，50~55°C减压浓缩至1000ml，然后加入3倍体积(3000ml)95%的乙醇进行48~72小时的醇沉。醇沉液离心IOmin (转速3000r/min)，沉淀部分加A 1000ml水搅拌溶解，离心，沉淀再同样操作二次。合并溶解的上清液，装入透析袋(截留分子量>1000)，自来水透析48小时后换蒸馏水再透析24小时。该透析液50~55°C减压浓缩至200ml左右，装入小瓶进行冷冻干燥，获得棕色粉末，即总多糖(得率为1.9%)。
[0085]实施例4:淫羊蕾多糖组分的制备
[0086]室温浸提的淫羊藿总多糖YYH_G(实施例1制备)lg，加入蒸馏水50ml溶解，溶解液上样 DEAE-纤维素柱(08cmX35cm)，分别采用水、0.25mol/L NaHCO3>0.5mol/L NaHCO3 和
0.lmol/L NaOH进行连续洗脱，流速lml/min，IOml/管，相应获得多糖组分YYH_G0(490nm吸收，H20)、YYH-G1 (490nm 吸收，0.25mol/L NaHCO3)、YYH_G2 (490nm 吸收，0.5mol/L NaHCO3),YYH-G3 (490nm 吸收，0.lmol/L NaOH)以及非糖组分 YYH-G4 (280nm 吸收，0.25mol/LNaHCO3)> YYH-G5 (280nm 吸收，0.5mol/L NaHCO3)、YYH-G6 (280nm 吸收，0.lmol/L NaOH)。
[0087]总多糖YYH-G在DEAE —纤维素柱层析的色谱图如图1和图2所示。
[0088]实施例5:淫羊蕾总多糖、酸性多糖组分和非糖组分的理化性质
[0089]淫羊藿总多糖YYH-G由实施例4制备，酸性多糖组分YYH-Gl和非糖组分YYH-G4由实施例4制备。
[0090]1.淫羊藿总多糖和酸性多糖组分的含糖量(以葡萄糖计)的测定
[0091]I)实验方法
[0092]采用硫酸一苯酹法测定糖含量(参考文献:Dubois M., et al.Colorimetricmethod for detemination of sugars and related substances.Anal.Chem.1956;28:350-56)。
[0093]2)实验结果
[0094]总多糖YYH - G为棕色粉末，含糖量为35.60% (以葡萄糖计算)；
[0095]酸性多糖组分YYH-Gl为淡黄色粉末，含糖量为58.93% (以葡萄糖计算)；
[0096]非糖组分YYH-G4为浅黄色粉末。
[0097]2.淫羊藿总多糖和酸性多糖组分的的糖醛酸含量(以半乳糖醛酸计)的测定
[0098]I)实验方法
[0099]采用间轻联苯法测定糖醒酸含量(参考文献:Blumenkrantz N，et al.New methodfor quantitative determiation of uronic acid.Anal Biocheml973;54:484-89)。
[0100]2)实验结果
[0101]总多糖YYH - G的糖醛酸含量为7.53% (以半乳糖醛酸计算)；
[0102]酸性多糖组分YYH-Gl的糖醛酸含量为8.40% (以半乳糖醛酸计算)。
[0103]3.淫羊藿总多糖中酸性多糖组分和非糖组分的分子量测定
[0104]I)实验方法
[0105]仪器:HPLC，Waters公司；色谱柱:TSKsw4000 ;流动相:0.1M Na2SCM ;流速:0.6ml/min ;检测器:示差。
[0106]2)实验结果
[0107]酸性多糖组分YYH-Gl的分子量为6000~20000 ；
[0108]非糖组分YYH-G4的分子量为2000~10000。
[0109]4.淫羊藿总多糖中酸性多糖组分的单糖组成
[0110]酸性多糖组分YYH-Gl的单糖组成是鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖以及半乳糖醛酸，摩尔比分别为1.00:0.33:4.44:0.38:0.64:0.87:5.26。
[0111]由于药材产地、批次不同，其中的糖含量和糖醛酸含量不可能完全相同，而是在本实施例数值周围波动。例如总多糖YYH - G的含糖量为25-45%，酸性多糖组分YYH-Gl的含糖量为45-65%，总多糖YYH — G的糖醛酸含量为5_20%，酸性多糖组分YYH-Gl的糖醛酸含量为5-15%
[0112]实施例6:淫羊蕾总多糖的生物学试验
[0113]将室温下提取的淫羊藿总多糖YYH_G(实施例1制备)作为佐剂，以卵清蛋白(OVA)为抗原，二者联用肌肉注射小鼠，测定产生的抗体滴度。具体实验方法如下:
[0114]实验动物:Balb/C，6_8周，5只/组，雌性。
[0115]药物浓度:总多糖YYH-G:20mg/ml ；0VA:1.2mg/ml ;招佐剂:2mg/ml ；
[0116]对照溶剂:生理盐水
[0117]给药剂量:0VA-60ii g/50 iil/ 鼠；铝佐剂一100iig/50iil/ 鼠；YYH-G:lmg/50 ii I/ 鼠;
[0118]分组:(I)P 组:PBS+0VA ; (2 )铝佐剂组:铝佐剂 +OVA ；(3) YYH-G 组:YYH_G+0VA ；(4)溶剂对照组:生理盐水。注射前等体积混合，IOOiU/鼠，右后肢肌肉注射。
[0119]免疫方案:动物按照免疫分组首次免疫注射后3周，尾静脉取血，测定血清中抗体滴度。首次免疫注射后第3周检测抗体滴度，第4周加强免疫，二次免疫注射后2周，尾静脉取血，测定血清中抗体滴度，视滴度情况，测定后2周进行第3次免疫。ELISA测定血清中抗体滴度。
[0120]ELISA法所用试剂配制:
[0121]1.抗原包被液:50mmol/L碳酸盐缓冲液pH9.6。称取无水Na2CO3L 696g，NaHC032.8 56g 加水溶解到 1000ml，调节 pH 至 9.6。
[0122]2.洗涤液(10XPBST，pH7.4):称取 NaC180g, KC12g，Na2HP0429g, KH2P042g，Tween-2010ml,双蒸水至1000ml,调节pH7.4,10倍稀释使用。
[0123]3.封闭液:1%BSA，用 50mmol/L PBS pH7.4 溶解。
[0124]4.底物液(TMB-H2O2):使用时将底物液A和B等体积混合，加入30%H202，终浓度
0.5%。
[0125]5.底物液A (TMB),称取TMB200mg,无水乙醇100ml,加双蒸水至1000ml。
[0126]6.底物液 B (0.lmol/L 柠檬酸-0.2mol/L Na2HPO4 缓冲液)，Na2HP0424.8g，柠檬酸19.33g，加双蒸水至1000ml，调节pH5.0~5.4。
[0127]7.2N H2SO4
[0128]8.0VA溶解于抗原包被液，浓度为4 iig/ml，包被96孔板(Costa) IOOyl/孔，4°C过夜。PBST洗3遍，1%BSA-PBS37°C封闭lh。PBST洗3遍后加入以PBST稀释的小鼠血清样品，IOOiU/孔，37°C孵温 lh。PBST 洗 3 遍，加入 HRP-羊抗小鼠 IgGC 1:1000, PBST)100 U I/?L，37°C孵温1，PBST洗6遍，加入IOOiU底物液显色后，加入50iU2N H2SO4终止反应测定
A450。
[0129]实验结果:
[0130]淫羊藿总多糖YYH-G、生理盐水、Al (OH)3分别与OVA等体积混合，免疫小鼠，IOOu I/鼠，免疫3周尾静脉取血，取血清自1:200始至1:12800等比稀释，ELISA方法检测血清抗体滴度。实验结果表明第一次免疫所有测试组抗体滴度均比较低(图3)，而经过第二、三次免疫后YYH-G注射组动物血清滴度明显升高(见图4和图5)，表明YYH-G具有显著促进抗体产生作用。
[0131]实施例7:淫羊蕾多糖组分的生物学试验
[0132]室温下提取的淫羊藿总多糖YYH-G (实施例1制备)经DEAE —纤维素柱层析，获得酸性多糖组分YYH-Gl和非糖组分YYH-G4。YYH-Gl和YYH-G4分别作为佐剂，以卵清蛋白(OVA)为抗原，二者联用肌肉注射小鼠，测定产生的抗体滴度。具体实验同实施例6。
[0133]药物浓度:YYH-GI: 10mg/ml ;YYH_G4:10mg/ml ；0VA:1.2mg/ml ;招佐剂:2mg/ml ；对照溶剂:生理盐水
[0134]给药剂量:YYH-60ii g/50 iil/ 鼠；铝佐剂一100 y g/50 yl/ 鼠；YYH_G1:
0.5mg/50 u I/ 鼠；YYH-G4:0.5mg/50 yl/ 鼠;
[0135]分组:(1)P组:PBS+0VA ; (2)铝佐剂组:铝佐剂 +OVA ; (3)YYH_G1 组:YYH_G1+0VA ；
(4)YYH-G4 组:YYH-G4+0VA ；
[0136]注射前等体积混合，100 U I/鼠，右后肢肌肉注射。
[0137]实验结果:
[0138]淫羊藿总多糖YYH-G经DEAE —纤维素柱层析分离，得到酸性多糖组分YYH-Gl和非糖组分YYH-G4，按照免疫方案进行进一步的佐剂活性功能测定，经第二次免疫后检测，YYH-Gl和YYH-G4组分具有显著的免疫佐剂活性，能够促进抗体的产生(图6和图7)。
[0139]实施例8淫羊蕾多糖组分的生物学试验
[0140]55~60°C下提取淫羊藿总多糖YYH-G (实施例3制备)经DEAE —纤维素柱层析，获得酸性多糖组分YYH-Gl和非糖组分YYH-G4。采用HlNl病毒裂解液为抗原测定两种糖组分的活性。
[0141]YYH-Gl和YYH-G4分别作为佐剂，以HlNl病毒裂解液为抗原，YYH-Gl和YYH-G4按照不同的剂量分别与甲型流感疫苗HlNl病毒裂解液配伍肌肉注射小鼠，测定产生的抗体滴度。具体实验同实施例6。
[0142]混合后药物浓度:YYH-G1:10, 5，2.5，1.25mg/ml ;YYH_G4:5, 2.5，1.25mg/ml ；HlNl:30u g/ml ;铝佐剂:lmg/ml ;对照溶剂:生理盐水
[0143]给药剂量:HlNl:3ug/100u I/ 鼠；铝佐剂一IOOu g/100u I/ 鼠；YYH-GI:
1.0，0.5，0.25，0.125mg/100 u I/ 鼠;YYH_G4:0.5，0.25，0.125，0mg/100 ii I/ 鼠;
[0144]分组:(I)P组:H1N1 (YYH-Glor YYH-G4:0mg/100 u I/ 鼠);(2)铝佐剂组:铝佐剂+HlNl ；(3) YYH-Gl 组:YYH_G1+H1N1 ；(4) YYH-G4 组:YYH_G4+H1N1 ；
[0145]注射前等体积 混合，100 U I/鼠，右后肢肌肉注射。
[0146]实验结果:
[0147]淫羊藿总多糖YYH — G经DEAE —纤维素柱层析分离，得到酸性多糖组分YYH-Gl和非糖组分YYH-G4，与甲型流感疫苗HlNl病毒裂解液配伍免疫，结果显示初次免疫后18天小鼠血清中具有较高HlNl病毒抗体滴度，YYH-Gl免疫剂量每只小鼠为0.125-lmg、YYH-G4免疫剂量每只小鼠为0.125-0.5mg，均具有较高的佐剂活性，剂量组之间没有明显的差异，说明低剂量有效(图8-11)。
[0148]实施例9淫羊蕾多糖组分的生物学试验
[0149]室温下提取淫羊藿总多糖YYH-G (实施例2制备)经DEAE —纤维素柱层析，获得酸性多糖组分YYH-Gl和非糖组分YYH-G4。采用HlNl病毒裂解液为抗原测定两种糖组分的活性。具体方法如实施例8。结果显示室温提取的YYH-Gl和YYH-G4配伍HlNl抗原初次免疫即可产生较高滴度的抗体(图12)。
[0150]尽管本发明的【具体实施方式】已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
【权利要求】
1.一种淫羊藿多糖，其特征在于 (1)含糖量为25-45%，例如35.60%(以葡萄糖计算)，糖醛酸含量为5_20%，例如7.53%(以半乳糖醛酸计算)；和/或 (2)其具有附图1和附图2所示的特征。
2.淫羊藿酸性多糖组分，其为权利要求1所述的淫羊藿多糖经DEAE-纤维素柱层析，得到的利用硫酸-苯酚法显色、具有490nm波长吸收的0.25mol/L NaHCO3洗脱部分。
3.一种淫羊藿酸性多糖组分，或者权利要求2所述的淫羊藿酸性多糖组分，其特征在于: 包含鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖以及半乳糖醛酸；以及，其分子量为6000~20000。
4.权利要求3的淫羊藿酸性多糖组分，其特征在于， (1)含糖量为45-65%，例如58.93%(以葡萄糖计算)，糖醛酸含量为5_15%，例如8.40%(以半乳糖醛酸计算)；和/或 (2)鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的摩尔比为鼠李糖:岩藻糖:阿拉伯糖:木糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖=1.00:0.33:4.44:0.38:0.64:0.87:5.26。
5.淫羊藿非糖组分，其为权利要求1所述的淫羊藿多糖经DEAE-纤维素柱层析，得到的具有280nm吸收的0.25mol/L NaHCO3洗脱部分。
6.一种淫羊藿非糖组分，或者权利要求5所述的淫羊藿非糖组分，其为淫羊藿多糖的非糖组分，其分子量为2000~10000。
7.一种药物组合物，其包含权利要求1-6任一项的淫羊藿多糖和/或淫羊藿酸性多糖组分和/或淫羊藿非糖组分，以及药学上可接受的辅料。
8.一种疫苗佐剂，其包含权利要求1-6任一项的淫羊藿多糖和/或淫羊藿酸性多糖组分和/或淫羊藿非糖组分。
9.一种疫苗制剂或疫苗组合物，其包含权利要求1-6任一项的淫羊藿多糖和/或淫羊藿酸性多糖组分和/或淫羊藿非糖组分。
10.权利要求1-6任一项的淫羊藿多糖和/或淫羊藿酸性多糖组分和/或淫羊藿非糖组分用于制备疫苗佐剂、疫苗制剂、疫苗组合物或抗体的用途。
11.一种制备抗体的方法，其包括使用有效量的权利要求1-6任一项的淫羊藿多糖和/或淫羊藿酸性多糖组分和/或淫羊藿非糖组分的步骤。
【文档编号】A61K39/39GK103613675SQ201310562420
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2011年8月3日 优先权日:2010年11月5日
【发明者】单俊杰, 王玉霞, 朱婷, 贾培媛, 武军华, 赵修南, 刁玉林, 王晨宇, 段丹丹, 王佩瑞 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所