表达新型鸭呼肠孤病毒外衣壳蛋白的重组杆状病毒及其构建方法
【专利摘要】本发明涉及一种表达新型鸭呼肠孤病毒NDRV外衣壳蛋白的重组杆状病毒，所述重组杆状病毒为vAcNDRV-σB／σC，该病毒高效双表达NDRV外衣壳蛋白σB和σC。同时，涉及该重组杆状病毒的构建方法，即，通过RT-PCR扩增，分别得到σB和σC基因的特异片段；通过基因克隆筛选获得双表达载体pFbDNDRV-σB／σC；将筛选得到的重组双表达载体转化DH10Bac细胞，得到转座的AcNDRV-σB／σC?Bacmid；并将其转染sf9昆虫细胞，在sf9昆虫细胞中获得重组病毒vAcNDRV-σB／σC。
【专利说明】表达新型鸭呼肠孤病毒外衣壳蛋白的重组杆状病毒及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及病毒学领域，特别是一种新型鸭呼肠孤病毒外衣壳蛋白的重组杆状病毒及其构建方法。本发明所用病毒株为新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus，缩写NDRV)安徽太湖11株。
【背景技术】
[0002]鸭出血性坏死性肝炎是由呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus, NDRV)引起的各种品种鸭的一种以肝脏不规则坏死和出血混杂为主要特征的疫病。不同品种鸭均易感，日龄愈小或并发感染时其发病率死亡率愈高，以5~10日龄居多，病程5~7d，发病率5%~20%、死亡率2%~15%。
[0003]2005年以来，四川、广东、安徽等省份陆续报道鸭群中出现一种新的病毒病，威胁着水禽养殖业的健康发展，后经鉴定病原为新型鸭呼肠孤病毒。NDRV宿主相对ARV和MDRV要广泛，自然状态下对各种品种鸭(番鸭、半番鸭、北京鸭、麻鸭)均有致病性，人工感染亦可引起SPF鸡的发病甚至死亡，给水禽养殖业带来了一定得威胁。与其他禽源呼肠孤病毒相似，该病毒基因组由分节段的10个基因片段组成。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是:NDRV外衣壳蛋白O B和o C均为抗原蛋白，能刺激机体产生保护性中和抗体，O B为群特异性抗原，0 C为型特异性抗原，而通过纯化病毒得到的抗原蛋白十分有限，且原核表达无法对蛋白表达修饰加工，表达产物与天然蛋白有一定得差距，故有必要运用真核表达系统对该病毒蛋白在体外进行高效重组表达，进而为制备NDRV基因工程疫苗及开`展抗病毒机理研究丌辟新的有效途径。
[0005]本发明解决其技术问题采用以下的技术方案:
[0006]本发明提供了高效双表达NDRVA外衣壳蛋白o B和o C的重组病毒vAcNDRV-O B / o C。
[0007]本发明还提供了上述重组病毒AcNDRV-oB / o C的构建方法，具体是:通过RT-PCR扩增，分别得到2条编码NDRV外衣壳蛋白oB和o C基因的特异片段，通过克隆筛选获得了插入NDRV外衣壳蛋白oB和O C基因的重组pPastBacDual双表达载体pFbDNDRV O B / o C ;将筛选得到的重组双表达载体转化DHlOBac细胞，得到转座的AcNDRV- O B / O C Bacmid ;将 AcNDRV- o B / o C Bacmid 转染 sf9 昆虫细胞，在 sf9 中获得重组病毒vAcNDRV- O B / o C。
[0008]所述方法具体为:
[0009]①用于扩增NDRV-o B / o C蛋白基因的新型鸭呼肠孤病毒毒株为NDRV THll株。
[0010]②以NDRV THll基因组dsRNA SI和S3片段为模板，采用RT-PCR方法扩增NDRVO C和O B基因片段，SI和S3 ；[0011]③扩增的NDRV O B和O c DNA片段与pFastBacDual双表达载体连接，获得重组质粒 pFbDNDRV oB / o C ；
[0012]④将筛选得到的重组质粒转化DHlOBac细胞，获得转座的AcNDRV-oB / o CBacmid ；
[0013]⑤采用cellfectin脂质体,将纯化的AcNDRV-O B / o C Bacmid转染sf9昆虫细胞，获得在sf9昆虫细胞中高效表达的重组病毒AcNDRV- oB/ o C。
[0014]具体而言，
[0015](I)根据NDRV O B和o C基因的GenBank序列以及pFastBacDual供体质粒的多克隆位点设计含酶切位点的引物，NDRV O B和O C基因的GenBank序列分别为JX826588和JX826587.[0016](2)采用逆转录酶系统与高保真Taq酶，进行oB和0 C编码基因片段的RT-PCR扩增；
[0017](3)将O C基因插入到pFastBacDual多角体启动子下游，o B基因插入到PlO启动子下游。
[0018]本发明可采用以下的引物扩增NDRV O B和O C编码基因序列
[0019](I)用于扩增NDRV O B的引物序列是:
[0020]上游引物O B-F:TCCCCCGGGATGGAAATGCGTGTGCCAAACT(SEQ ID N0.1)
[0021]下游引物O B-R:GGGGTACCTTACCACCTACACTCCAG(SEQ ID N0.2)
[0022](2)用于扩增NDRV o C基因的引物序列是:
[0023]上游引物O C-F:CGGGATCCATGGATCGCAACGAGGTGATACGC(SEQ ID N0.3)
[0024]下游引物O C-R:GCTCTAGACTAGCCCGTGGCGACGGTGAA(SEQ ID N0.4)
[0025]O B编码基因与载体连接的酶切位点分别是Sma I和Kpn I，o C编码基因与载体连接的酶切位点分别是Bam I和Xba I。
[0026]本发明与现有技术相比，具有以下主要优点:
[0027]①在体外同时表达2种NDRV外衣壳蛋白oB和o C。
[0028]②表达的蛋白产量高，保持天然蛋白活性。
[0029]③表达的蛋白产物为非融合蛋白，具有良好的免疫原性。
[0030]总之，本发明通过杆状病毒表达系统，在体外成功构建了同时表达NDRV O B和O C外衣壳蛋白双表达载体，并获得在sf9中的高效表达，子代病毒的增殖培养证实其重组病毒高效表达的稳定特性；其表达蛋白能用于研究NDRV外衣壳蛋白功能及制备基因工程疫苗。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1为蓝白斑筛选重组Bacmid
[0032]图2为重组Bacmid的PCR鉴定，其中:
[0033]M:核酸 Marker ;1:空 Bacmid ；2:重组 Bacmid
[0034]图3为western-blot鉴定o B和o C蛋白在重组杆状病毒中的表达，其中:
[0035]M:蛋白Marker ；NC:野毒株2: o B(以兔抗NDRV o B血清为一抗);
[0036]3: O C (以兔抗NDRV o C血清为一抗)[0037]图4为IFA检测O B和o C蛋白在重组杆状病毒中的表达，其中:
[0038]A:感染重组杆状病毒sf9细胞(以兔抗NDRV o B血清为一抗)
[0039]B:感染重组杆状病毒sf9细胞(以兔抗NDRV o C血清为一抗)
[0040]NC:感染野毒株sf9细胞(以兔抗NDRV oB / oC血清为一抗)
[0041]图5为空斑实 验
【具体实施方式】
[0042]下面结合实例对本发明作进一步说明，但不限定本发明。
[0043]一、细胞与病毒毒株
[0044]采用Sf9昆虫细胞的培养进行重组NDRV衣壳蛋白杆状病毒质粒的转染
[0045]l)Sf9 细胞培养液为 SF-900II SFM(Invitrogen 公司、货号 10902-088)
[0046]2)细胞培养方法为:取液氮中保存的sf9细胞，37°C水浴快速融化，在超净台内转移至细胞培养瓶内，加入适量培养基，放入27°C培养箱，培养2~3天，待铺满培养瓶底后，进行传代培养。
[0047]3) NDRV毒株为太湖11株(陈宗艳，朱英奇，王世传，李传峰，李露，王玢缤，付玉志，高景鹏，王超，刘光清.一株新型鸭源呼肠孤病毒(TH11株)的分离与鉴定.中国动物传染病学报，2012，1:10-15.12.)
[0048]二、目的基因片段扩增与克隆
[0049]采用RT-PCR方法进行NDRV外衣壳蛋白o B和o C基因片段扩增。基于GenBank序列进行NDRV O B和O C基因片段设计引物,根据pFast BacDual donor plasmid提供的多克隆位点，以及插入片段的序列特征设计针对其含酶切位点的引物。
[0050]用于扩增NDRV O B 的引物序列是:上游引物 o B_F:TCCCCCGGGATGGAAATGCGTGTGCCAAACT (SEQ ID N0.1);下游引物 o B-R:GGGGTACCTTACCACCTACACTCCAG (SEQ ID N0.2)；
[0051]用于扩增NDRV O C基因的引物序列是:上游引物O C_F:CGGGATCCATGGATCGCAACGAGGTGATACGC(SEQ ID N0.3)下游引物 o C-R:GCTCTAGACTAGCCCGTGGCGACGGTGAA(SEQ IDN0.4), oB编码基因与载体连接的酶切位点分别是Sma I和Kpn I，o C编码基因与载体连接的酶切位点分别是Bam I和Xba I。
[0052]取NDRV THll分离株种毒经尿囊腔途径接种于9日龄SPF鸡胚，37°C温箱孵育，收集48h-72h之间尿囊液，离心后取上清备用；NDRV RNA提取按Trizol试剂盒说明书进行；提取的RNA用于RT-PCR ;在PCR反应管中分别加入7 ii L已制备的RNA，加A I u LNDRV-THll-o C-R 下游引物(IOuM) ,94 °C IOmin,冰浴 IOmin,继续加入 5XM-MLVBuffer4 u L, IOmM dNTPsl iiL，0.5iiL 反转录酶(M-MLV) 0.5u L,0.5u L RNA 酶抑制剂(40u)，用无RNA酶水调至总体积20uL，瞬时离心混匀；反应程序:42°C 2h ;获得的cDNA用于PCR扩增，PCR反应体系(50 ii L体系):以制备好的cDNA 2 y L作模版，加入相应的上、下游引物(IOuM)各 I ii L，2.5mM dNTPs8u L, 10XBuffer5 u L, rTaql u L，灭菌水 32 u L, PCR 扩增条件为:94°C 5min ；94°C 45s,55°C 45s,72°C lmin，30 个循环；最后 72°C延伸 IOmin 结束。PCR扩增的O B和O C基因片段与pFastBacDual进行连接。采用DH5 a感受态细胞进行转化，于Ampicillin平板上进行筛选，37°培养15h，对经鉴定正确的菌液进行质粒提取，提取的质粒经双酶切和测序鉴定。[0053]三.重组Bacmid的鉴定
[0054]经鉴定正确的重组子pFbDNDRV-oB / o C转化DHlOBac感受态细胞，在含有50ug / ml Kanamycin ；7ug / ml Gentamicin ；IOug / ml Tetracycline ；200ug / mlX-gel ；40ug / ml IPTG的LB板上挑选白斑涂板划线(如图1所示)，然后挑斑接种于含有同样浓度的Gent，K+和Tet的LB液体培养基中进行小量培养，用试剂盒提取重组BacmidDNA，提取质粒用M13正反向引物进行PCR鉴定(如图2所示)，证明获得正确的重组子。
[0055]四? Sf9细胞转染与重组病毒鉴定
[0056]1.将鉴定正确的重组质粒用cellfectin转染试剂进行转染，同时转染空Bacmid作对照，具体转染方法按试剂盒步骤进行。转染3天后在光学显微镜下观察转染细胞的变化，直至转染细胞与正常细胞相比出现病变，收集细胞上清，为第一代Pl重组病毒，将Pl病毒进行传代培养获得高效价病毒悬液。Pl子代病毒的增殖培养证实重组病毒vAcNDRV- oB / oC具有稳定高效表达NDRV o B和o C蛋白的特性。
[0057]2.病毒滴度测定(如图5所示):根据噬斑数计算病毒滴度，具体步骤:
[0058]①无菌条件下，2ml /孔细胞(5X IO5Cells / ml)种入6孔板,室温孵育Ih使其贴壁，孵育后镜检其贴壁程度
[0059]②将4% agarose gel放入70°C水浴锅融解，空100ml无菌瓶与SF-900II SFM放A 40°C水浴锅预热
[0060]③将杆状病毒用SF-900II SFM梯度稀释:10_1~1(T8
[0061]④弃6孔板内上清，快速加入稀释好的病毒，Iml /孔，室温孵育Ih
[0062]⑤制备斑点培养基:混合30ml的`SF-900培养基(1.3x)和agarose gel在100ml灭菌瓶中，轻摇，使用前放入40°C水浴。
[0063]⑥弃6孔板内上清，快速加2ml斑点培养基中，室温静止Ih
[0064]⑦将6孔板放入27°C培养箱，培养7-10天
[0065]⑧计数板中曬菌斑,直至连续两天无变化,加Img / ml中性红0.5ml,室温孵育2h后计数噬菌斑
[0066]病毒滴度(pfu / ml) = I /稀释倍数X噬菌斑数X I /每孔接种体积
[0067]测定的病毒培养液的滴度为:2xl07pfu / ml
[0068]2.将扩大培养的重组病毒细胞裂解液进行SDS-PAGE蛋白电泳，western-blot,IFA鉴定(如图4所示)所得到的重组病毒含有目的蛋白的表达(陈宗艳，朱英奇，王世传，李传峰，李露，王玢缤，付玉志，高景鹏，王超，刘光清.一株新型鸭源呼肠孤病毒(TH11株)的分离与鉴定.中国动物传染病学报，2012，1:10-15.12.)，其分子量分别为41Ku和34Ku，与oB和oC蛋白预期值相吻合(如图3所示)。从中可以看出，利用本发明所述的pFbDNDRV- O B / o C可以同时高效双表达NDRV外衣壳蛋白oB和o C。
[0069]上游引物O B-F:TCCCCCGGGATGGAAATGCGTGTGCCAAACT(SEQ ID N0.1)
[0070]下游引物O B-R:GGGGTACCTTACCACCTACACTCCAG (SEQ ID N0.2)
[0071](2)用于扩增NDRV O C基因的引物序列是:
[0072]上游引物O C-F:CGGGATCCATGGATCGCAACGAGGTGATACGC(SEQ ID N0.3)
[0073]下游引物O C-R:GCTCTAGACTAGCCCGTGGCGACGGTGAA(SEQ ID N0.4)。
【权利要求】
1.一种表达新型鸭呼肠孤病毒NDRV外衣壳蛋白的重组杆状病毒，其特征是所述重组杆状病毒为vAcNDRV- O B / o C，该病毒高效双表达NDRV外衣壳蛋白o B和o C。
2.权利要求1所述重组杆状病毒的构建方法，其特征是通过RT-PCR扩增，分别得到2条编码NDRV外衣壳蛋白O B和O C基因的特异片段；通过基因克隆筛选获得插入的NDRV O B和oC基因的重组pFastBacdual双表达载体pFbDNDRV- o B / o C ;将筛选得到的重组双表达载体转化DHlOBac细胞，得到转座的AcNDRV- o B / o C Bacmid ;并将其转染sf9昆虫细胞，在sf9昆虫细胞中获得重组病毒vAcNDRV- o B / o C。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是采用以下步骤: (1)用于扩增NDRV-oB / O C蛋白基因的新型鸭呼肠孤病毒毒株为NDRV THll株；
(2)以NDRVTHll基因组dsRNA SI和S3片段为模板，采用RT-PCR方法扩增NDRV o C和oB基因片段； (3)扩增的NDRVO B和O C DNA片段与pFastBacDual双表达载体连接，获得重组质粒pFbDNDRVO B / o C ； (4)将筛选得到的重组质粒转化DHlOBac细胞，获得转座的AcNDRV-o B / o CBacmid ； (5)采用celIfectin脂质体，将纯化的AcNDRV-O B / oC Bacmid转染sf 9昆虫细胞，获得在sf9昆虫细胞中高效表达的重组病毒vAcNDRV- oB / o C。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征是所述步骤(3)具体为: (1)根据NDRVO B和O C基因的GenBank序列以及pFastBacDual供体质粒的多克隆位点设计含酶切位点的引物，NDRV O B和O C基因的GenBank序列号分别为JX826588和JX826587 ； (2)采用逆转录酶系统与高保真Taq酶，进行oB和oC编码基因片段的RT-PCR扩增； (3)将OC基因插入到pFastBacDual多角体启动子下游，o B基因插入到PlO启动子下游。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是扩增OB和O C编码基因序列的引物是: (1)用于扩增NDRVO B基因的引物序列是:
上游引物 O B-F:TCCCCCGGGATGGAAATGCGTGTGCCAAACT
下游引物 O B-R: GGGGTACCTTACCACCTACACTCCAG (2)用于扩增NDRVO C基因的引物序列是:
上游引物 O C-F:CGGGATCCATGGATCGCAACGAGGTGATACGC
下游引物 O C-R:GCTCTAGACTAGCCCGTGGCGACGGTGAA。
6.根据权利要求4所述的重组杆状病毒的构建方法，其特征是OB基因的酶切位点分别是Sma I和Kpn I。
7.根据权利要求4所述的重组杆状病毒的构建方法，其特征是OC基因的酶切位点分别是Bam I和Xba I。
8.权利要求1所述的重组杆状病毒vAcNDRV-OB / o C在制备抗新型鸭呼肠孤病毒制剂中的应用。
9.权利要求8的应用，所述应用为制备抗新型鸭呼肠孤病毒基因工程疫苗。
【文档编号】A61K35/76GK103642758SQ201310541349
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】刘光清, 陈宗艳, 毕庄莉, 朱音奇, 李传峰, 孟春春 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所