一种新型抗癌药物羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的制备方法。该方法以羟乙基淀粉为基本骨架，丁二酸酐为偶联剂，将羟乙基淀粉和多西紫杉醇以酯键形式偶联起来，得到一种具有良好生物相容性的羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物。与多西紫杉醇原料药相比，该偶联物显著提高了多西紫杉醇在水中的溶解度(约1000～3000倍)。同时偶联物中的羟乙基淀粉还明显改善了多西紫杉醇的药代动力学性质，具有体内长循环特征。在小鼠荷瘤乳腺癌EMT-6模型实验中，相比多西紫杉醇原料药，该偶联物明显增强了对皮下移植肿瘤的抑制作用。
【专利说明】ー种新型抗癌药物羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物制备方
法
【技术领域】:
[0001]本发明涉及生物相容和生物降解类新型药物载体，具体涉及ー种以羟乙基淀粉为基本骨架，以丁二酸为连接臂，制备羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的方法和应用。
[0002]发明背景:
[0003]多西紫杉醇(Docetaxel，DTX)是继紫杉醇后又ー种新型的抗癌药物。该药物的作用机制是提高加强微管蛋白聚合作用和抑制微管解聚作用，阻滞细胞于G和M期，从而抑制癌细胞的有丝分裂和增通(F.V.Fossella et al., Phase II study of docetaxel foradvanced or metastatic platinum-refractory non-small—cell lung cancer.Journalof Clinical Oncology, 1995,13,645-651)。与紫杉醇相比，在体外抗瘤活性实验中，已证实多西紫杉醇的活性是紫杉醇的1.3~12倍(S.Noguchi, Predictive factors forresponse to aocetaxel in numan breast cancers?しancer bcience,200d,97,813-820)。目前已获得FDA批准用于临床上治疗乳腺癌、卵巣癌、非小细胞肺癌和前列腺癌等。由于多西紫杉醇在水中的溶解性较差( 小于I U g/ml)，极大的影响了药效的发挥，目前上市的剂型多利用非离子型表面活性剂吐温-80增溶，经13%的こ醇稀释后注射使用。但是吐温-80具有溶血性且粘度较大，在临床应用中，以发现该制剂具有外周神经毒性和肌肉骨骼毒性，以及中性粒细胞减少等一系列过敏反应(J.Baker, et al., Docetaxel-relatedside effects and their management.European Journal of Oncology Nursing,2009,13,49-59)。另外，由于小分子抗癌药物在体内分布广泛，尤其是在正常器官和组织中有较多的分布，不仅给患者带来了痛苦，更影响了药物利用度。因此解决多西紫杉醇的水溶性问题，控制该药物释放速率和靶向性，对于提高多西紫杉醇抗癌药效具有重要意义。
[0004]天然多糖类聚合物具有良好的生物相容性和生物降解性，作为药物载体，可有效避免和降低载体本身带来的毒副作用。然而，普通天然多糖同样具有水溶性较差的问题，例如壳聚糖只能在酸性条件下溶解，而纤维素在水溶液和一般溶液下都不能溶解。作为药物载体，天然多糖不仅在负载水溶性药物，而且在负载脂溶性药物方面均存在一定的局限性。为此，通常采用聚乙二醇(PEG)对天然多糖类药物载体进行表面亲水修饰。需要指出的是，这种PEG亲水修饰作用往往也带来细胞摄取的減少和胞内释放的降低，即所谓“PEG两难困境，，(PEG-dilemma)现象(H.Hatakeyama et al., A multifunctional envelopetype nano device(MEND)for gene delivery to tumours based on the EPR eftect:astrategy for overcoming the PEG dilemma.Advanced Drug Delivery Reviews,2011,63,152-160)。另外，PEG本身不能被降解，且连续使用容易产生副作用(R.Webster et al.，PEb ana PEb conjugates toxicity:towards an understanding of the toxicity of PEband its relevance to PEGylated biological.PEGylated Protein Drugs:Basic Scienceand Clinical Applications, Series !Milestones in Drug Therapy, Birkhauser, , Basel2009，127-146)。
[0005]轻乙基淀粉(Hydroxyethyl starch,以下简记为HES)是ー种天然多糖(高分支支链淀粉)经酸水解、并与环氧乙烷反应(羟乙基化)的产物。与一般天然多糖不同，HES不仅具有良好的水溶性，还具有良好的生物降解性。！ES本身就是ー种血浆扩容剂，进入体内后能够迅速扩张血浆容量，并能够在血管内停留足够长的时间维持血压，是目前治疗低血容量和休克的首选药物。另外，HES还具有良好的局部和系统耐受性(J.Waitzinger et al.，Hydroxyethyl starch (HES)[130/0.4], a new HES specification.Drugs in R &D,2003,4，149-158)。人体内每天使用的最大剂量可达1.2g/kg，且没有副作用。在进入血液之后，HES被血浆a -淀粉酶逐渐水解，平均分子量不断的下降，最后被肾小球滤过通过尿液排出体外(し.Jungheinrich et al., Pharmacokinetics of hydroxyethyl starch.しlinica丄Pharmacokinetics, 2005，44，681-699)。目前关于HES作为药物载体的研究甚少，尤其是作为负载脂溶性药物的载体尚未见报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供ー种新型抗癌药物羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的制备方法。
[0007]实现本发明的技术方案是:
[0008]本发明提供的羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的制备方法，包括以下步骤:
[0009]步骤ー:令多西紫杉醇与丁二酸酐反应生成多西紫杉醇_2’ 丁二酸酯；
[0010]步骤二:令对甲苯磺酸与4-二甲氨基吡啶反应生成二甲氨基吡啶对甲苯磺酸盐；
[0011]步骤三:以羟乙基淀粉为基本骨架，在二甲氨基吡啶对甲苯磺酸盐和1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺的催化下，令羟乙基淀粉和紫杉醇-2’ 丁二酸酯发生酷化反应生成羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物。
[0012]上述步骤一所述的令多西紫杉醇与丁二酸酐反应生成紫杉醇_2’ 丁二酸酯的具体方法是:将多西紫杉醇，丁二酸酐和4`-二甲氨基吡啶加入到反应容器中，封ロ后抽真空2h，多西紫杉醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶的用量摩尔比为2.5: 3: I;然后将吡啶混合在二氯甲烷中注入反应容器，室温反应3h后加入甲醇终止反应得反应混合液，其中多西紫杉醇与吡啶的用量摩尔体积比为1: 2(单位为mol: L)，吡唆、二氯甲烷和甲醇的里量体积比为2.5: 5: I ;将得到的反应混合液用浓度为2mol/L的HCl水溶液和饱和食盐水依次萃取一次，得到有机相I和水相I ;有机相I再用配制好的HCl水溶液和饱和食盐水分别重复萃取2次，将各次所得水相合并得到水相II ;水相II再用二氯甲烷萃取I次，得到有机相II，将有机相I和有机相II合并后，用无水硫酸钠干燥，蒸去有机溶剤，以甲醇/ 二氯甲烷(I: 10，v/v)为流动相，通过硅胶柱层析分离，得到白色固体状多西紫杉醇_2’ 丁二酸酷。所述的HCl水溶液的配制方法是:取浓盐酸15ml，用一次水稀释至100ml，得到2mol/L的HCl水溶液；所述的饱和食盐水的配制方法是:取氯化钠36g溶解在100ml —次水中，搅拌均匀得到饱和食盐水。
[0013]上述步骤二所述的令对甲苯磺酸与4-二甲氨基吡啶反应生成二甲氨基吡啶对甲苯磺酸盐的具体方法是:将对甲苯磺酸和4-二甲氨基吡啶溶解在四氢呋喃中，于40~60°C下反应2h，其中对甲苯磺酸和4-二甲氨基吡啶的用量摩尔比为1: 1，对甲苯磺酸和四氢呋喃的用量摩尔体积比为1: 3(单位为mol: L)，反应结束后冷却至室温，过滤得到白色沉淀物，该白色沉淀物经二氯甲烷中重结晶，再于40°C真空干燥，得到针状固态的二甲氨基吡啶对甲苯磺酸盐。
[0014]上述步骤三所述的以羟乙基淀粉为基本骨架，在二甲氨基吡啶对甲苯磺酸盐和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺的催化下，令羟乙基淀粉和紫杉醇-2’ 丁二酸酷发生酯化反应生成羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的具体方法是:按等摩尔量取多西紫杉醇_2’丁二酸酷、二甲氨基吡啶对甲苯磺酸盐和1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺，加入到二甲基亚砜中，使多西紫杉醇-2’丁二酸酯与二甲基亚砜的用量摩尔体积比为I: 100 (单位为mol: L)，室温下反应4~6h，再加入羟乙基淀粉，以羟乙基淀粉単元糖环的摩尔数计算羟乙基淀粉的用量为:使羟乙基淀粉単元糖环与多西紫杉醇_2’ - 丁二酸酯的摩尔比为10: I~50: 1，室温下继续反应3~5天，反应结束后将反应溶液在双蒸水中透析48~72h，透析期间每7h换一次双蒸水，透析结束后经冷冻干燥，得到白色固体状羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物(HES-DTX)。
[0015]本发明利用羟乙基淀粉的亲水性，通过化学偶联反应合成了一种羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物(简记为ffiS-DTX)。本发明不仅可解决多西紫杉醇的水溶性问题，改善药物的药代动力学性质，同时还提供了ー种非PEG化亲水修饰药物载体的新途径。
[0016]本发明制备羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的基本思路是通过丁二酸酐的偶联作用，使羟乙基淀粉与多西紫杉醇发生化学偶联反应(见附图1)。本发明所述羟乙基淀粉原料购买于武汉华科大生命科技有限公司，所购羟乙基淀粉的分子量为130Kd，取代度为
0.4。多西紫杉醇原料购买于武汉威盛达有限公司，纯度为99%。
[0017]本发明利用大鼠模型考察了本发明实施例1制备的本发明羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的体内药代动力学性质，具体步骤如下:
[0018]实验药物的配制:将羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物溶解在水中配制成25.5mg/ml 的水溶液；參照文献的方法(M.J.Ernsting et al., Preclinical pharmacokinetic,biodistribution, and ant1-cancer efficacy studies oi a docetaxelcarboxymethyl—cellulose nanoparticle in mouse models.Biomaterials,2012，33，1445-1454.)配制2.5mg/ml的多西紫杉醇溶液。
[0019]随机将大鼠分为2组，每组5只。将多西紫杉醇原料药和羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物以多西紫杉醇10mg/kg的给药量，Iml的剂量通过尾静脉注射入每只大鼠。不同时间点下从大鼠眼眶静脉丛取血0.4ml,4000rpm转速下离心IOmin,取血衆0.2ml,高效液相色谱检测血浆中多西紫杉醇的浓度(见附图4)。动物实验结果表明，羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物显著改善了多西紫杉醇的药代动力学性质，具有体内长循环效果，使药物易于在肿瘤部位富集。
[0020]另外，按文献方法(M.J.Ernsting et al.，Tumor—targeted drug delivery usingMR—contrasted docetaxel—CarDoxymethyIcelluiose nanoparticIes.Biomaterials,2012，33，3931-3941)建立小鼠乳腺癌EMT-6细胞荷瘤小鼠模型，考察了羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物体内抗肿瘤活性。具体步骤如下:
[0021]实验药物的配制:将本发明实施例1制备的羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物溶解在水中配制成13.7mg/ml的水溶液；配制多西紫杉醇溶液的浓度为1.4mg/ml。
[0022]随机将小鼠分为3组，每组6只。将多西紫杉醇组，羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物水溶液组以多西紫杉醇10mg/kg的给药量，200 u I的剂量于第0天、第4天、第8天尾静脉注射入每只小鼠，并设置空白对照组生理盐水组(saline)，测量肿瘤体积大小(见附图5)。动物实验结果表明，本发明的羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物能够显著增强多西紫杉醇对肿瘤的抑制作用。[0023]本发明提供的羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的优点在于:多西紫杉醇的水溶性提高了 1000~3000倍，解决了多西紫杉醇原料药水溶性低药效差的难题；延长了多西紫杉醇的血液循环时间，使其易于在肿瘤部位富集；显著增强多西紫杉醇对肿瘤的抑制作用。[0024]本发明提供了一种羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的制备方法。该方法以羟乙基淀粉为基本骨架，丁二酸酐为偶联剂，将羟乙基淀粉和多西紫杉醇以酯键形式偶联起来，得到ー种具有良好生物相容性的羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物。与多西紫杉醇原料药相比，该偶联物显著提高了多西紫杉醇在水中的溶解度(约1000~3000倍)。同时偶联物中的羟乙基淀粉还明显改善了多西紫杉醇的药代动力学性质，具有体内长循环特征。在小鼠荷瘤乳腺癌EMT-6模型实验中，相比多西紫杉醇原料药，该偶联物明显增强了对皮下移植肿瘤的抑制作用。
【专利附图】
【附图说明】[0025]图1为羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的合成路线图。[0026]图2本发明实施例1制备的羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的红外光谱(FT-1R)图。从附图2的羟乙基淀粉红外光谱可知，3400cm—1，2926cm—1，1649cm—1的吸收峰分别为OH的伸缩振动峰，C-H的震动吸收峰和分子内氢键。对比羟乙基淀粉的红外光谱，羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物在1720cm—1处出现了ー个新吸收峰，归属于酯键C = O振动峰。同时在1540cm \ 1453cm 1和713cm 1还出现了三个新吸收峰，其中1540cm S 1453cm 1归属于苯环C = C骨架振动峰，713cm-1归属于苯环C-H弯曲振动峰。这些新吸收峰证明多西紫杉醇已经成功偶联到HES上面。[0027]图3为本发明实施例1制备的羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的核磁共振波谱(1H-NMR)图。其中谱图A为多西紫杉醇原料药。谱图B为多西紫杉醇-2’丁二酸酷。谱图C为羟乙基淀粉。谱图D为本发明实施例1制备的羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物。从附图3的氢核磁共振波谱可知，对比多西紫杉醇的核磁共振波谱，多西紫杉醇_2’ - 丁二酸酯(DTX-Suc)的2’号H对应的核磁共振峰从4.64ppm(s, 1H)处消失，并迁移到5.5ppm处，这表明酯键的生成。并且2.5~2.7ppm处增加的多重峰对应的是丁二酸的0C0CH2CH2C00H部分，证明多西紫杉醇_2’丁二酸酯成功合成。另外，从羟乙基淀粉-多西紫杉醇的氢核磁共振波谱的7.0~8.0ppm之间还出现了较多的峰，这是多西紫杉醇苯环上的氢振动峰。根据氢核磁共振波谱确证羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的结构正确。[0028]图4为大鼠体内注射多西紫杉醇和本发明实施例2制备的羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物后不同时间点的血药浓度曲线。从附图4的血药浓度曲线可知，多西紫杉醇给药组的药物消除速率很快，给药Ih后血药浓度就从16.01 u g/ml迅速下降到1.26 u g/ml,到8h几乎完全消除(仅为0.11 y g/ml)。24h后已经检测不到多西紫杉醇的色谱峰。羟乙基淀粉-多西紫杉醇给药组在给药后的前2h内也存在ー个快速消除的过程，但是药物的消除速率明显低于多西紫杉醇给药组。血药浓度也远远高于多西紫杉醇给药组，给药Ih后血药浓度仍然有6.65 u g/ml,并在随后的时间内保持一个缓慢的药物消除过程，48h后仍然能够检测到血药浓度为0.157 u g/ml。将多西紫杉醇和羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物两个给药组的血药浓度输入药代动力学软件DAS2.0进行拟合，多西紫杉醇给药组和羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物给药组均符合三室药代动力学模型，其中羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的药物清除率远远小于多西紫杉醇，经静脉给药后其药代动力学曲线下面积AUC(0—是多西紫杉醇溶液的4倍，即相对生物利用度提高到原有的4倍，消除半衰期t1/2e是多西紫杉醇溶液的4.1倍。这表明，通过静脉给药方式，羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物具有显著的长循环特征。
[0029]图5为荷瘤小鼠注射多西紫杉醇和本发明实施例2制备的羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的肿瘤生长曲线。其中:曲线a为生理盐水对照组；曲线b为多西紫杉醇给药组；曲线c为羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物给药组；图B是实验结束后将各组小鼠肿瘤剥离出来后拍摄的照片。从附图5的肿瘤生长曲线可以看出，与生理盐水组相比，多西紫杉醇组和羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物给药组的肿瘤体积显著性降低(P < 0.05)，抑制肿瘤生长作用明显。相比多西紫杉醇组，羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物给药组的肿瘤体积在第4天开始减小，到第12天时显著降低(p<0.05)。实验结束后各组小鼠剥离肿瘤的照片也显示羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物给药组的肿瘤体积显著减小。说明在本发明实施例5的给药方案下羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物对于小鼠乳腺癌EMT-6皮下移植肿瘤的抑制作用明显高于纯多西紫杉醇。
【具体实施方式】
[0030]以下结合实施例和附图将明做进ー步的说明，而不是限制本发明范围。
[0031]实施例1:
[0032]实验药品的配制:取浓盐酸15ml，用一次水稀释至100ml，得到2mol/L的HCl水溶液；取氯化钠36g溶解在100ml —次水中，搅拌均匀得到饱和食盐水。
[0033]步骤一、将多西紫杉醇2g，`丁二酸酐0.3g和4- 二甲氨基吡啶61mg加入到两ロ烧瓶中，封ロ后抽真空2h。然后将5ml吡啶混合在IOml 二氯甲烷中，注入瓶中，室温反应3h后加入2ml甲醇终止反应。
[0034]步骤二、将步骤一得到的反应混合液用IOml浓度为2mol/L的HCl水溶液和IOml饱和食盐水依次萃取I次，得到有机相I和水相I，有机相I再用配制好的HCl水溶液和饱和食盐水分别重复萃取2次，将各次所得水相合并得到水相II。水相II再用IOml 二氯甲烷萃取I次得到有机相II。将有机相I和有机相II合并后，用无水硫酸钠干燥，蒸去有机溶剤，以甲醇/ 二氯甲烷(I: 10，v/v)为流动相，通过硅胶柱层析分离得到白色固体状多西紫杉醇-2’ 丁二酸酷。
[0035]步骤三、将5g对甲苯磺酸和3.55g4_ 二甲氨基吡啶溶于100ml四氢呋喃中，于60°C下反应2h。反应结束后冷却至室温，过滤得到白色沉淀物，该白色沉淀物在30ml 二氯甲烷中重结晶，再于40°C真空干燥，得到针状固态的二甲氨基吡啶对甲苯磺酸盐。
[0036]步骤四、偶联反应:取0.30g上述步骤二得到的多西紫杉醇_2’ 丁二酸酷、上述步骤三得到的二甲氨基吡啶对甲苯磺酸盐0.092g和1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺0.064g,加入到30ml 二甲基亚砜中，室温下反应4~6h。再加入轻乙基淀粉，以轻乙基淀粉単元糖环的摩尔数计算羟乙基淀粉的用量为:使羟乙基淀粉単元糖环与多西紫杉醇-2’ 丁二酸酯的摩尔比为50: 1，室温下继续反应3天。反应结束后将反应溶液在双蒸水中透析48~72h，透析期间每7h换一次透析液。透析结束后经冷冻干燥，得到白色固体状羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物01ES-DTX)，该偶联物称重测得质量为I。采用紫外检测法测得羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物中多西紫杉醇的质量为W2，载药量采用公式Wt%=VW1X 100%计算为 4.5%o
[0037]采用红外光谱和氢核磁共振波谱确认本实施例合成的HES-DTX的化学结构，见图2和图3，图2本发明实施例1制备的羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的红外光谱(FT-1R)图。图3为本发明实施例1制备的羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的核磁共振波谱(1H-NMR)图。从附图2的羟乙基淀粉红外光谱可知，3400cm—1，2926cm—1，1649cm—1的吸收峰分别为OH的伸缩振动峰，C-H的震动吸收峰和分子内氢键。对比羟乙基淀粉的红外光谱，羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物在1720cm—1处出现了ー个新吸收峰，归属于酯键C = O振动峰。同时在1540cm \ 1453cm 1和713cm 1还出现了三个新吸收峰，其中1540cm S 1453cm 1归属于苯环C = C骨架振动峰，713cm-1归属于苯环C-H弯曲振动峰。这些新吸收峰证明多西紫杉醇已经成功偶联到HES上面。附图3为羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的核磁共振波谱(1H-NMR)图。其中谱图A为多西紫杉醇原料药。谱图B为多西紫杉醇-2’丁二酸酷。谱图C为羟乙基淀粉。谱图D为本发明实施例1制备的羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物。从附图3的氢核磁共振波谱可知，对比多西紫杉醇的核磁共振波谱，多西紫杉醇_2’ - 丁二酸酯(DTX-Suc)的2’号H对应的核磁共振峰从4.64ppm(s, 1H)处消失，并迁移到5.5ppm处，这表明酯键的生成。并且2.5~2.7ppm处增加的多重峰对应的是丁二酸的0C0CH2CH2C00H部分，证明多西紫杉醇_2’丁二酸酯成功合成。另外，从羟乙基淀粉-多西紫杉醇的氢核磁共振波谱的7.0~8.0ppm之间还出现了较多的峰，这是多西紫杉醇苯环上的氢振动峰。根据氢核磁共振波谱确证羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的结构正确。
[0038]实施例2:
[0039]除羟乙基淀粉単元糖环与多西紫杉醇_2’_ 丁二酸酯的摩尔比为20: I外，其它条件同实施例1。采用紫外检测法测得实施例2制备的羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的载药量为9.8%。
[0040]实施例3:
[0041]除改变羟乙基淀粉単元糖环与多西紫杉醇-2’ - 丁二酸酯的摩尔比为10: I外，其它条件同实施例1。采用紫外检测法测得实施例3制备的羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的载药量为10.6%。
[0042]实施例4:
[0043]大鼠体内药代动力学实验:随机将大鼠分为2组，每组5只，体重在250~260g。给药组分别为多西紫杉醇组和本发明实施例2制备的羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物组。两组的给药量均为10mg/kg，每只大鼠的注射量为1ml，给药方式均为尾静脉注射。
[0044]给药后分别于5min、15min、0.5h、lh、2h、4h、8h、12h、24h、48h,从大鼠眼眶静脉丛取血0.4ml置于事先用肝素钠湿润的离心管中，在离心机中离心IOmin(4000rpm)后，取血浆0.2ml。采用高效液相色谱分别測定了不同时间点血浆样品中多西紫杉醇的浓度。
[0045]从附图4的血药浓度曲线可知，多西紫杉醇给药组的药物消除速率很快，给药Ih后血药浓度就从16.01 V- g/ml迅速下降到1.26 V- g/ml,到8h几乎完全消除(仅为0.1lug/ml)。24h后已经检测不到多西紫杉醇的色谱峰。羟乙基淀粉-多西紫杉醇给药组在给药后的前2h内也存在ー个快速消除的过程，但是药物的消除速率明显低于多西紫杉醇给药组。血药浓度也远远高于多西紫杉醇给药组，给药Ih后血药浓度仍然有6.65 u g/ml,并在随后的时间内保持一个缓慢的药物消除过程，48h后仍然能够检测到血药浓度为0.157 Ug/ml。将多西紫杉醇和羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物两个给药组的血药浓度输入药代动カ学软件DAS2.0进行拟合，多西紫杉醇给药组和羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物给药组均符合三室药代动力学模型，其中羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的药物清除率远远小于多西紫杉醇，经静脉给药后其药代动力学曲线下面积AUC(0 —是多西紫杉醇溶液的4倍，即相对生物利用度提高到原有的4倍，消除半衰期t1/2e是多西紫杉醇溶液的4.1倍。这表明，通过静脉给药方式，羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物具有显著的长循环特征。
[0046]实施例5: [0047]通过在每只健康Balb/c小鼠右后肢近腋下皮下接种小鼠乳腺癌EMT-6细胞悬液4X105cells/100iil，建立小鼠乳腺癌EMT-6细胞皮下移植荷瘤小鼠模型。
[0048]在饲养过程中，各组小鼠均同等自由饮食。动物房内温度保持在20~24°C，相对湿度当皮下瘤体积为50~IOOmm3时(约7天左右)，开始尾静脉给药。将皮下瘤体积在50~IOOmm3范围内，体重在28~30g范围内的荷瘤小鼠随机分为3组，每组6只。给药组分为多西紫杉醇组和本发明实施例2制备的羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物组，均以多西紫杉醇给药量为10mg/kg。并设置空白対照的生理盐水组。每只小鼠通过尾静脉注射200 Ul的剂量。第一次给药记为第0天，再分别于第4天、第8天继续按上述剂量分组给药。第0天，采用游标卡尺測量皮下肿瘤最宽处(W)和最长处大小(L)，计算肿瘤的体积V = LXW2/2。之后每隔一天測量一次，绘制肿瘤生长曲线。实验结束时，处死荷瘤小鼠，将肿瘤剥离并拍照。
[0049]附图5是为荷瘤小鼠注射多西紫杉醇和本发明实施例2制备的羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的肿瘤生长曲线。其中曲线a为生理盐水对照组；曲线b为多西紫杉醇给药组；曲线c为羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物给药组；图B是实验结束后将各组小鼠肿瘤剥离出来后拍摄的照片。从附图5的肿瘤生长曲线可以看出，与生理盐水组相比，多西紫杉醇组和羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物给药组的肿瘤体积显著性降低(P < 0.05)，抑制肿瘤生长作用明显。相比多西紫杉醇组，羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物给药组的肿瘤体积在第4天开始减小，到第12天时显著降低(p<0.05)。实验结束后各组小鼠剥离肿瘤的照片也显示羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物给药组的肿瘤体积显著减小。说明在本发明实施例5的给药方案下羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物对于小鼠乳腺癌EMT-6皮下移植肿瘤的抑制作用明显高于纯多西紫杉醇。
【权利要求】
1.一种羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的制备方法，包括以下步骤: 步骤ー:令多西紫杉醇与丁二酸酐反应生成多西紫杉醇-2’ 丁二酸酯； 步骤二:令对甲苯磺酸与4- 二甲氨基吡啶反应生成二甲氨基吡啶对甲苯磺酸盐； 步骤三:以羟乙基淀粉为基本骨架，在二甲氨基吡啶对甲苯磺酸盐和1-乙基-3- (3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺的催化下，令羟乙基淀粉和紫杉醇_2’丁二酸酯发生酯化反应生成羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物。
2.根据权利要求1所述的羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的制备方法，其特征在干，步骤一所述的令多西紫杉醇与丁二酸酐反应生成紫杉醇-2’ 丁二酸酯的具体方法是:将多西紫杉醇，丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶加入到反应容器中，封ロ后抽真空2h，多西紫杉醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶的用量摩尔比为2.5: 3: I ;然后将吡啶混合在二氯甲烷中注入反应容器，室温反应3h后加入甲醇终止反应得反应混合液，其中多西紫杉醇与吡啶的用量摩尔体积比为1: 2(单位为mol: L)，吡啶、二氯甲烷和甲醇的用暈体积比为2.5: 5:1 ;将得到的反应混合液用浓度为2mol/L的HCl水溶液和饱和食盐水依次萃取一次，得到有机相I和水相I ;有机相I再用配制好的HCl水溶液和饱和食盐水分别重复萃取2次，将各次所得水相合并得到水相II ;水相II再用二氯甲烷萃取I次，得到有机相II，将有机相I和有机相II合并后，用无水硫酸钠干燥，蒸去有机溶剤，以甲醇/ 二氯甲烷(I: 10，v/v)为流动相，通过硅胶柱层析分离，得到白色固体状多西紫杉醇-2’ 丁二酸酷。
3.根据权利要求2所述的羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的制备方法，其特征在于，所述的HCl水溶液的配制方法是:取浓盐酸15ml，用一次水稀释至100ml，得到2mol/L的HCl水溶液。
4.根据权利要求2所述的羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的制备方法，其特征在于，所述的饱和食盐水的配制方法是:取氯化钠36g溶解在100ml —次水中，搅拌均匀得到饱和食盐水。
5.根据权利要求1所述的羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的制备方法，其特征在于，步骤二所述的令对甲苯磺酸与4-二甲氨基吡啶反应生成二甲氨基吡啶对甲苯磺酸盐的具体方法是:将对甲苯磺酸和4-二甲氨基吡啶溶解在四氢呋喃中，于40~60°C下反应2h，其中对甲苯磺酸和4-二甲氨基吡啶的用量摩尔比为1: 1，对甲苯磺酸和四氢呋喃的用量摩尔体积比为1: 3(单位为mol: L)，反应结束后冷却至室温，过滤得到白色沉淀物，该白色沉淀物经二氯甲烷中重结晶，再于40°C真空干燥，得到针状固态的二甲氨基吡啶对甲苯磺酸盐。
6.根据权利要求1所述的羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的制备方法，其特征在于，步骤三所述的以羟乙基淀粉为基本骨架，在二甲氨基吡啶对甲苯磺酸盐和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺的催化下，令羟乙基淀粉和紫杉醇-2’ 丁二酸酯发生酯化反应生成羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的具体方法是:按等摩尔量取多西紫杉醇_2’ 丁二酸酷、二甲氨基吡啶对甲苯磺酸盐和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺，加入到二甲基亚砜中，使多西紫杉醇-2’ 丁二酸酯与二甲基亚砜的用量摩尔体积比为1: 100(单位为mol: L)，室温下反应4~6h，再加入羟乙基淀粉，以羟乙基淀粉単元糖环的摩尔数计算羟乙基淀粉的用量为:使羟乙基淀粉単元糖环与多西紫杉醇_2’ - 丁二酸酯的摩尔比为10: I~50: I，室温下继续反应3~5天，反应结束后将反应溶液在双蒸水中透析48~72h，透析期间每7h换一次双蒸水，透析结束后经冷冻干燥，得到白色固体状羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物(HES-DTX)。
7.根据权利要求6所述的羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的制备方法，其特征在于，所述的多西紫杉醇_2’ 丁二酸酯按权利要求2所述方法制得。
8.根据权利要求6所述的羟乙基淀粉-多西紫杉醇偶联物的制备方法，其特征在于，所述的二甲氨基吡啶对甲苯磺酸·盐按权利要求5制得。
【文档编号】A61K31/337GK103585642SQ201310521645
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年10月29日 优先权日:2013年10月29日
【发明者】杨祥良, 杨亚江, 徐辉碧, 柳轻瑶, 万江陵 申请人:华中科技大学