一种1型单纯疱疹病毒载体系统及其制备方法与应用的利记博彩app【专利摘要】本发明属于生物【
技术领域：
】，涉及一种1型单纯疱疹病毒载体系统及其制备方法。该载体系统包括以HSV-1内部反向重复序列（IR）两侧DNA片段为同源重组臂的穿梭质粒pKo5/BN和含缺失IR区的HSV-1基因组的细菌人工染色体质粒pHSVΔIR-BAC。使用所述载体系统制备重组HSV-1包括三个步骤，首先将靶DNA片段克隆入pKo5/BN获得重组穿梭质粒；随后用所获重组穿梭质粒电转化含pHSVΔIR-BAC的大肠杆菌并筛选获得重组菌；最后从所获重组菌中提取重组DNA并转染Vero细胞，纯化获得重组HSV-1。所述载体系统安全性高，可容纳30Kb外源DNA，可高效地构建表达多个目的基因的选择复制型重组HSV-1。【专利说明】一种1型单纯疱疹病毒载体系统及其制备方法与应用【
技术领域：
】[0001]本发明属于生物【
技术领域：
】，本发明涉及一种I型单纯疱疹病毒载体系统及其制备方法，还涉及单纯疱疹病毒载体携载并表达EGFP报告基因和在抗肿瘤中的应用。【
背景技术：
】[0002]I型单纯疱疫病毒(HerpessimplexvirustypeI,HSV-1)是一种嗜神经性病毒，在人群中感染非常普遍，临床表现为黏膜或皮肤局部集聚疱疹等轻微症状，偶尔伴有发热。HSV-1为双链DNA病毒，基因组152kb，由独特长片段(?)和短片段(Us)组成，两端为末端反向重复序列TRjPTRs，两片段连接处为内部反向重复序列(IR区)。HSV-1编码约90种蛋白，功能大多已明确，其中约一半为病毒复制所必需，另一些为复制非必需，这些非必需基因删除并代之以外源基因不影响病毒复制，故HSV-1可改造为病毒载体。HSV-1载体的优势在于其宿主范围广、感染效率高、安全(基因组游离存在；抗疱疹病毒药物可终止治疗和意外感染)、容量大、易于制备、所携载的外源基因可持续表达；小鼠等动物感染HSV-1的症状类似于人，可作为HSV-1载体研究的动物模型；遗传背景清楚，重组方法成熟。目前，HSV-1作为溶瘤病毒和疫苗载体已有广泛的基础和临床研究。[0003]HSV-1作为溶瘤病毒的历史较长，最初(第一代)的HSV-1溶瘤病毒是缺失HSV-1核苷酸代谢酶基因而获得的，包括缺失胸苷激酶(ThymidineKinase,tk)基因和核糖核苷还原酶基因(ribonucleotidereductase,RR)的重组HSV-1,由于这类HSV-1仍有神经毒性，且tk是抗疱疫病毒药物甘昔洛韦(Gancyclovir,GCV)或阿昔洛韦(acyclovir,ACV)的靶分子，故研究者无法用药物控制这类重组HSV-1的治疗过程，目前，tk缺失的溶瘤HSV-1已被放弃。第二代HSV-1溶瘤病毒是同时缺失神经毒基因Y34.5和多个立即早期(IE)基因而获得的，如G207、HSV1716和NV1020，它们均进入临床试验。NV1020删除了部分IR区，同时将HSV-2的多个囊膜糖蛋白编码基因插入该位点，Roizman构建NV1020的最初目的是研制预防HSV-1和HSV-2感染的疫苗，研究中发现其抗肿瘤活性明显，安全性高，并将其改造为NV1023、NV1042、NV1066`等重组病毒，其中NV1020已进入临床二期。第三代HSV-1溶瘤病毒是缺失抑制MHC-1递呈抗原的ICP47基因而获得的，如G47A，其能激活机体对肿瘤的免疫清除，目前已进入临床前研究。近些年(第四代)的HSV-1溶瘤病毒是在HSV-1中插入免疫激活、肿瘤治疗或肿瘤靶向性相关的基因，以增强其抑杀肿瘤的活性，如表达GM-CSF的重组HSV-1已进入临床三期，表达IL-12的重组HSV-1也进入了临床前期实验。[0004]HSV-1作为疫苗载体的研究起步较晚，自上世纪90年代初Roizman提出HSV-1载体可用于预防HSV感染后，研究者们对HSV-1作为疫苗载体开展了系列研究，证实HSV-1作为疫苗载体具有独特的优势，如=HSV-1初次感染后潜伏于体内，机体针对HSV-1的预存免疫很低；表达抗原基因的重组HSV-1能激发小鼠产生持久的免疫反应；HSV-1载体可通过口服和黏膜免疫激发机体全面的免疫应答；HSV-1载体能激发机体的固有免疫反应，具有佐剂功能等。有研究者将GM-CSF和IL-12重组至HSV-1以促使其激活机体免疫反应。目前，HSV-1疫苗载体主要通过删除多个立即早期基因而获得，这类病毒为复制缺陷型或复制能力较低，如Knipe等将SIV的多个基因重组至缺失了ICP4，ICP22和ICP27的复制缺陷型HSV-1载体dl06中，该重组病毒能诱导短尾猴产生针对SIV的中和抗体和细胞免疫反应，攻毒后免疫组的病毒载量减少，但dl06携载的SIV基因在感染细胞中的表达水平很低，诱导的免疫应答水平不高，该研究组正着手恢复dl06中的部分IE基因以提高病毒载体的复制能力。[0005]HSV-1遗传背景清楚，已有几种成熟的方法可以获得其重组体。最早的重组HSV-1是通过诱变法获得，其局限性在于诱变产生的突变体大多为不需要的，从中筛选出所需HSV-1突变株非常困难。二十世纪80年代，同源重组法开始用于构建重组HSV-1，即将一个带有标记基因和靶基因的质粒与野生型HSV-1基因组共转染宿主细胞，在宿主细胞内发生同源重组，并通过表达的标记基因从子代病毒中筛选出重组体。同源重组法突变方向明确，筛选容易，较诱变法有明显的优势。即便如此，重组HSV-1的获得仍是一项费时费力的工作，构建一株重组病毒常需耗时一年。而野生型病毒增殖能力显著高于突变株时，就很难筛选出突变的病毒株；如果突变缺失的是病毒增殖必需基因，则需要在互补细胞系中增殖重组病毒，这又使重组体筛选更加繁琐。随着人类基因组学研究的深入，大容量载体系统逐渐被建立，这些工具不但用于哺乳动物细胞基因的研究，也极大地方便了大病毒基因组的研究。其中，在病毒学中最常用的是细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)。BAC在宿主菌中仅有1-2个拷贝，遗传性能稳定，且可通过电激转化宿主菌，常规方法即可从宿主菌中分离BAC-DNA，继而转染宿主细胞并获得HSV-1。目前，疱疹病毒科的所有成员都已被克隆至BAC中，这些病毒BAC保留了病毒的感染特性，其转染相应细胞后能够复制并释放子代病毒，而且用于大肠杆菌的基因工程方法也适用于病毒BAC的操作，这一技术极大地加快了获得重组HSV-1的速度。【
发明内容】[0006]本发明建立了一种新的I型单纯疱疹病毒载体系统，该I型单纯疱疹病毒载体安全性高，可容纳30Kb外源DNA片段。应用该载体系统可以高效地构建表达多个目的基因的选择复制型重组单纯疱疹病毒，特别是构建基因治疗的重组单纯疱疹病毒和单纯疱疹病毒载体疫苗。[0007]本发明建立的I型单纯疱疹病毒载体系统包括穿梭质粒pKo5/BN和HSV-1细菌人工染色体质粒pHSVDIR-BAC;所述的的穿梭质粒pKo5/BN包含HSV-1IR区两侧的DNA片段B和N、多克隆位点、温度敏感性的复制起始区、博莱霉素(zeocin)抗性基因和果聚糖蔗糖酶基因iSacB),其中的DNA片段B和N为同源重组区；所述的pHSVDIR-BAC包含缺失了IR区的HSV-1基因组DNA、BAC序列和氯霉素抗性基因。[0008]本发明提供的穿梭质粒pKo5/BN是在pKo5(BCHorsburgh,MMHubinette,andFTufaro，Geneticmanipulationofherpessimplexvirususingbacterialartificialchromosomes.MethodsEnzymoI,1999;306:337-352.)的基础上米用常规分子生物学技术改造而成的，主要是在pKo5多克隆位点两端分别克隆入作为同源重组区的DNA片段B和N。pKo5/BN来源于但不限于pKo5和pKo3(AJLink,DPhillips,andGMChurch,Methodsforgeneratingprecisedeletionsandinsertionsinthegenomeofwild-typeEscherichiacol1:applicationtoopenreadingframecharacterization.J.Bact.,1997;179:6228-6237)等。[0009]本发明提供的HSV-1细菌人工染色体质粒pHSVDIR-BAC是用上述的pKo5/BN电转化含有pHSV_BAC(BCHorsburgh,MMHubinette,andFTufaroGeneticmanipulationofherpessimplexvirususingbacterialartificialchromosomes.MethodsEnzymoI,1999;306:337-352.)的大肠杆菌，继而筛选获得的包含缺失IR区的HSV-1基因组的细菌人工染色体质粒。pHSVDIR-BAC来源于但不限于pHSV-BAC和pBeloBAC(HShizuya,BBirren,UJKim,VMancino,TSlepak,YTachiirietal.,Cloningandstablemaintenanceof300-kilobase-pairfragmentsofhumanDNAinEscherichiacoliusinganF-factor-basedvector.Proc.Natl.Acad.Sc1.,1992;89:8794-8797)等。[0010]本发明还建立了上述I型单纯疱疹病毒载体的制备方法，具体步骤包括:1.构建穿梭质粒pKo5/BN根据HSV-1基因组序列(本发明涉及HSV-1DNA序列之处均参考HSV-1弱毒株F株序列，GenBank:GU734771.1,网址:http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/GU734771)设计两对引物分别PCR扩增位于IR区两侧的ifeMlIB片段(简称B片段)和ifeMlIN片段(简称N片段)，并在B片段的上下游引物的5’端分别加入Z如I和分eI酶切位点，在N片段的上下游引物的5’端分别加入V和C/aI酶切位点，PCR扩增获得的B和N片段依次克隆入pBluescriptIIKS(+)，随后将包括B和N片段以及两个片段之间多克隆位点的DNA片段克隆入PK05的油aI和I之间获得穿梭质粒pKo5/BN。[0011]2.构建HSV-1细菌人工染色体质粒pHSVAIR-BAC,上述的穿梭质粒pKo5/BN电转化含有pHSV-BAC的大肠杆菌DHlOB感受态细胞，在大肠杆菌细胞中，pKo5/BN中的B和·N片段与pHSV-BAC中HSV-1基因组IR区两侧的DNA发生同源重组，继而通过43°C培养以及生化和氯霉素抗性筛选获得含有发生同源重组的菌株，大量提取、鉴定并最终获得重组质粒pHSVAIR-BAC，所获菌株即为含有pHSVAIR-BAC的大肠杆菌菌株。[0012]3.利用所述I型单纯疱疹病毒载体系统获得重组HSV-1首先，将靶DNA片段克隆入pKo5/BN的B和N片段间的多克隆位点获得重组穿梭质粒；随后，用获得的重组穿梭质粒电转化含有pHSVAIR-BAC的大肠杆菌DHlOB感受态细胞，在大肠杆菌细胞中，重组穿梭质粒中的B和N片段与pHSVAIR-BAC中的B和N片段发生同源重组并将靶DNA重组至pHSVAIR-BAC中，继而通过43°C培养以及生化和氯霉素抗性筛选获得含有发生同源重组的菌株，大量提取、鉴定并最终获得携载靶DNA的重组质粒；最后，用获得的携载靶DNA的重组质粒转染vero细胞，通过蚀斑挑选、纯化以及病毒鉴定最终获得携载靶DNA的重组HSV-1。[0013]本发明提供的I型单纯疱疹病毒载体的优势和创新性表现在:(I)本发明建立的I型单纯疱疹病毒载体删除的IR区包括HSV-1三个早期基因(ICP0、ICP4和ICP22)、神经毒性基因Y34.5和病毒潜伏相关转录本LAT在内的15351bp的DNA片段，所述载体可容纳的外源DNA片段在30Kb以上，可将含多个外源基因的靶DNA片段一次性重组至载体中获得重组HSV-1，故利用本发明提供的HSV-1载体系统构建重组HSV-1相对于在HSV-1多位点进行改造获得重组HSV-1而言具有明显的优势，也适用于携载包含多个治疗基因或包括治疗基因调控元件在内的大片段靶DNA等病毒载体的构建。(2)本发明是以HSV-1弱毒株F株为原型建立I型单纯疱疹病毒载体，并缺失了参与病毒复制的三个早期基因和神经毒性基因Y34.5，故本发明提供的单纯疱疹病毒载体毒性弱，安全性高。(3)利用本发明建立的I型单纯疱疹病毒载体系统获得的重组病毒为选择性复制重组HSV-1，其携载的外源基因在感染细胞中可持续表达，这就使得所述载体更适用于基因治疗。(4)本发明建立的I型单纯疱疹病毒载体利用细菌人工染色体技术，重组过程的所有步骤在大肠杆菌即可完成，故建立的获得重组HSV-1的方法更为高效，所需费用较少。[0014]【专利附图】【附图说明】[0015]图1本发明构建的穿梭质粒pKo5/BN的图谱；图2本发明构建的HSV-1细菌人工染色体质粒pHSVAIR-BAC的图谱(“HSV-1jfi，，表示pHSVAIR-BAC中HSV-1的IR区已删除)；图3重组病毒HSV-1/AIR和HSV-1/EGFP在哺乳动物细胞中的增殖曲线。【具体实施方式】[0016]以下通过具体实施例对本发明进一步说明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求的保护范围，下列实施例未注明具体实验条件和方法，通常按照常规实验方法进行，如分子生物学等方法均按照分子克隆实验技术指南(J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，科学出版社，第三版2002)或实验试剂生产商提供的操作程序进行。[0017]实施例1.制备穿梭质粒pKo5/BN根据HSV-1基因组结构，HSV-1的IB片段(B)和IN片段(N)分别位于IR区两侧，根据HSV-1的序列分别设计引物，并在B片段的上下游引物的5’端分别加KXbaI和SpeI酶切位点，在N片段的上下游引物的5’端分别加入V和ClaI酶切位点，PCR扩增获得2024bp的B片段和2857bp的N片段，将B和N片段依次克隆入pBluescriptIIKS(+)，随后将包括B和N片段以及两个片段之间多克隆位点的DNA片段克隆入pK05的油aI和SalI之间获得穿梭质粒pKo5/BN(附图1)。[0018]实施例2.制备HSV-1细菌人工染色体质粒pHSVAIR-BAC碱裂解法大量提取并纯化口1(05/81取2111(Iug/UI)纯化的pKO5/BN与40iaDHlOB感受态细胞混合并在冰水浴中预冷，加入0.1cm电击杯中进行电转化，电转化参数为电压2.5kV、电容30iiF和电阻400Q。电转化后的感受态细胞加入ImLSOC培养基中30°C孵育1h，涂布于含有zeocin和氯霉素的LB固体培养基上，43°C培养过夜；待菌落长至直径约Imm大小，随机挑选10个单克隆，混匀于ImL的生理盐水中，取40L并涂布于含有氯霉素和5%(v/v)蔗糖的LB固体培养基平板，300C培养过夜；再从每个平板上随机挑选10个单克隆(共计100个单克隆)分别划线于含有氯霉素的固体LB培养基上，37°C培养过夜，此步骤重复一遍；将挑取的100个单克隆影印至另一含有氯霉素的固体LB培养基平板，待菌落长至直径约Imm大小，菌落PCR筛选重组菌。大量提取、鉴定并最终获得重组质粒pHSVAIR-BAC,所获菌株即为含有pHSVAIR-BAC的大肠杆菌菌株。[0019]实施例3.制备缺失IR区的重组HSV-1=HSV-1/AIR按常规方法培养Vero细胞至细胞密度达到70%~80%，将纯化的重组质粒pHSVAIR-BAC(设2iig、4iig和8iig三个梯度)以脂质体介导法转染细胞。2d后开始观察转染细胞病理变化(CPE)，4d后细胞中出现蚀斑(细胞状态和转染试剂等会影响转染效果并导致蚀斑出现时间退后)；待蚀斑出现后弃细胞培养液，以2%低熔点琼脂糖和无血清2X199V培养基等体积混合液固定细胞，常规方法挑取蚀斑区细胞并加入200yL脱脂奶粉溶液(经常规高压灭菌的质量体积浓度为9%的脱脂奶粉溶液)和2X199V等体积混合液中，在冰水浴下超声波破碎细胞以释放病毒，超声波破碎时间和间隔以避免细胞破碎液温度过高为原则，细胞裂解液作为病毒储液保存于-80°C冰箱中备用。病毒储液常规方法重复感染Vero细胞3次并挑取蚀斑以纯化病毒，随后大量感染和扩增病毒，以25cm2细胞培养瓶满瓶感染为例，于4°C3000rpm离心收集细胞至5mL离心管中，用4mL预冷的PBS冲洗细胞两次，4°C3000rpm收集细胞，并用0.5mL的lyse-o-lot(150mMNaCl,IOmMTris,1.5mMMgCl)重悬细胞，加入5iiL10%NP40U0UL10%SDS,5uL0.5MEDTA以及1.8yL旦-ME，充分混匀，常规方法酚氯仿抽提两次，取上清，加入两倍体积的无水乙醇和1/10体积的醋酸钠，置于-70°C2h或_20°C过夜；4°C12000rpm收集病毒DNA。对病毒基因组进行分子鉴定，鉴定正确的重组病毒即为HSV-1/AIR。[0020]实施例4.制备携载EGFP的重组HSV-1:HSV_1/EGFP制备携载EGFP的重组HSV-1的实施细节参照实施例3，简述如下:首先，将报告基因绿色突光蛋白(EGFP,enhancedgreenfluorescentprotein)基因构建至穿梭质粒PK05/BN，获得携带绿色荧光蛋白基因的穿梭质粒pK05/BN/^?/P，多种限制性酶切鉴定穿梭质粒。随后以正确的穿梭质粒pK05/BN/^?/P电转化含有pHSVAIR-BAC的大肠杆菌感受态细胞，通过抗生素抗性和生化筛选获得发生同源重组的重组菌株，经菌落PCR和Southernblotting鉴定获得含靶基因EGFP的重组DNA，大量提取纯化重组质粒pHSVAIR-BAC/EGFP。最后，pHSVAIR-BAC/EGFP重组DNA转染Vero细胞后挑取发生明显细胞病理变化(celIpathologicalchanges,CPE)的蚀斑,超声波裂解感染细胞,细胞裂解液再次感染Vero细胞以纯化和富集重组病毒。经PCR和Southern检测获得携载靶基因EGFP的重组HSV-1:HSV-1/EGFP。`[0021]实施例5.重组病毒HSV-1/AIR和HSV-1/EGFP在哺乳动物细胞中增殖能力的分析首先，HSV-l/wt、HSV-l/AIR和HSV-1/EGFP三种病毒均以0.5M0I感染Vero细胞，并分别于12h、18h、24h、48h四个时间点收集感染细胞，细胞经三次反复冻融和超声裂解后储存于-80°C冰箱。随后，按病毒学常规方法梯度稀释病毒储液并感染Vero细胞，检测各时间点收集的病毒储液中病毒的滴度。结果表明，HSV-l/wt、HSV-1/AIR和HSV-1/EGFP三种病毒感染vero细胞12h时的滴度依次为1.00X107U.30XIO7和1.50XIO7;感染18h时的滴度依次为5.40X108、3.05XIO8和1.89XIO8;感染24h时的滴度依次为2.0OXlO9,1.60XIO9和1.20XIO9;感染48h时的滴度依次为4.00XIO8,2.50XIO8和1.90XIO8。以上结果表明野生型HSV-1和用本发明提供的HSV-1载体系统构建的重组病毒HSV-1/AIR和HSV-1/EGFP在Vero细胞中的增殖曲线和增殖能力接近，HSV-1/AIR和HSV-1/EGFP的增值能力稍低于野生型HSV-1。故本发明提供的HSV-1载体系统可用于构建条件选择复制型重组HSV-1。【权利要求】1.一种I型单纯疱疹病毒载体系统，其特征在于，该I型单纯疱疹病毒载体系统包括穿梭质粒pKo5/BN和缺失IR区的HSV-1细菌人工染色体质粒pHSVAIR-BAC;所述的穿梭质粒pKo5/BN包含HSV-1内部反向重复序列(IR)两侧的IB片段(B)和汉IN片段(N)、多克隆位点、温度敏感性的复制起始区、博莱霉素(zeocin)抗性基因和果聚糖蔗糖酶基因QSacB);所述的pHSVAIR-BAC包含缺失了IR区的HSV-1基因组DNA、BAC序列和氯霉素抗性基因。2.根据权利要求1所述的I型单纯疱疹病毒载体系统，其特征在于，所述穿梭质粒pKo5/BN中的DNA片段B和N为两个同源重组臂。3.根据权利要求1所述的I型单纯疱疹病毒载体系统，其特征在于，所述穿梭质粒pKo5/BN中的DNA片段B为位于HSV-1基因组独特性长片段中与IR区相连的2024bp的DNA片段。4.根据权利要求1所述的I型单纯疱疹病毒载体系统，其特征在于，所述穿梭质粒pKo5/BN中的DNA片段N为位于HSV-1基因组独特性短片段中与IR区相连的2857bp的DNA片段。5.根据权利要求1所述的I型单纯疱疹病毒载体系统，其特征在于，所述穿梭质粒pKo5/BN的多克隆位点包括几种酶切位点-MmAI,Sma1、PstI,EcoRI和&oRV。6.根据权利要求1所述的I型单纯疱疹病毒载体系统，其特征在于，所述pHSVDIR-BAC包含的HSV-1基因组缺失的IR区包括HSV-1三个早期基因(ICP0、ICP4和ICP22)、神经毒性基因Y34.5和病毒潜伏相关转录本LAT在内的15351bp的DNA片段。7.权利要求1所述的I型单纯疱疹病毒载体系统在构建重组HSV-1中的应用。8.—种权利要求1所述的I型单纯疱疹病毒载体系统的制备方法，其特征是按如下步骤进行，首先构建穿梭质粒pKo5/BN,将B和N片段依次克隆入pBluescriptIIKS(+),继而将包括B和N片段以及两个片段之间多克隆位点的DNA片段克隆入pK05的油aI和SalI之间获得穿梭质粒pKo5/BN;其次，构建pHSVAIR-BAC,将上述的穿梭质粒pKo5/BN电转化含有pHSV-BAC的大肠杆菌，筛选获得重组菌株，提取获得重组质粒pHSVAIR-BAC09.权利要求8所述I型单纯疱疹病毒载体系统的制备方法在构建重组HSV-1中的应用。【文档编号】A61P35/00GK103589754SQ201310504249【公开日】2014年2月19日申请日期:2013年10月24日优先权日:2013年10月24日【发明者】马正海,毛红艳,李永鑫申请人:新疆大学