钙激活中性蛋白酶和钙激活蛋白酶抑制剂的用途
【专利摘要】本发明公开了一种钙激活中性蛋白酶和钙激活蛋白酶抑制剂的用途，将该钙激活蛋白酶抑制剂PD150606制成用于治疗/预防由多溴联苯醚所引起病灶的治疗/预防药物。PBDEs会引起钙激活中性蛋白酶calpain2活力的改变以及钙激活蛋白酶抑制剂PD150606会减轻PBDEs对钙激活中性蛋白酶calpain2活力的影响，因此可通过检测动物体内钙激活中性蛋白酶calpain2的活性，实现对PBDEs所引起病灶的诊断。通过钙激活蛋白酶抑制剂PD150606制成的药物可对由多溴联苯醚所引起病灶进行治疗/预防。
【专利说明】钙激活中性蛋白酶和钙激活蛋白酶抑制剂的用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多溴联苯醚所引起病灶的治疗或预防领域，具体涉及钙激活中性蛋白 酶和钙激活蛋白酶抑制剂的用途。
【背景技术】
[0002] 多溴联苯醚（PBDEs)作为溴化阻燃剂，在电子电器产品、建筑装修材料、塑料和橡 胶制品、纺织品中广泛使用，其可大大降低了火灾的发生率，给火灾的抢救争取了时间。然 而，由于PBDEs是以非共价方式添加在各种物品中，在使用和处理含有PBDEs的物品时， PBDEs极易通过挥发、渗出等方式释放到外环境中，并随大气长距离迁移，造成大气、水体、 土壤及生物圈的污染，进而使人体内PBDEs负荷加重。PBDEs具有持久性（半衰期为19-119 天）、难降解性、高脂溶性、高毒性，可以通过食物链的生物富集和生物放大作用在生物体 内蓄积，成为全球性的持久性有机污染物。在出现更好的替代阻燃剂之前，PBDEs在我国 乃至全世界仍然在大量使用。按照溴原子数的不同，可以将PBDEs分为BDE-47, BDE-99， BDE-100，BDE-153，BDE-154和BDE-209等十类209种同系物。我国是全球最大的PBDEs生 产、使用和出口基地，是全球产生大量电子垃圾的国家之一，也正成为全球最大的电子电器 垃圾集散地。而原始的废物处理手段（露天焚烧、烘烤和酸洗等）使PBDEs等持久性有机 污染物不断释放，在环境和生物体内普遍存在且污染呈增长趋势，对动物和人类健康造成 潜在危害。但是PBDEs作为一种阻燃剂，具有价格低廉、阻燃效果良好等优点，在我国甚至 世界上仍然大量生产和使用。因此，研究针对PBDEs健康危害预防用药具有重要的科学和 社会现实意义。
[0003] 我国儿童有BDE-153高暴露的危险，与其他同系物不同，BDE-153不能被肝微粒 体酶代谢，最不容易被代谢和排泄，在动物脑组织的含量约是其在血液中含量的5倍，t匕 BDE-47在脑组织中的含量高10倍左右。也就是说，BDE-153更容易在脂肪组织蓄积，对脑 组织有特殊的亲和力。因此，BDE-153的长期暴露可能对我国婴幼儿的神经发育造成更深 远的影响，是研究PBDEs神经毒性的代表物质。
[0004] 通过长期研究发现BDE-153具有神经发育毒性，能够影响动物的认知功能和神经 心理功能，并能使神经细胞凋亡和细胞内Ca2+稳态失衡。Ca2+在发育中的神经细胞和成熟 神经细胞中都能启动和调节一系列细胞反应，包括细胞凋亡、信号转导、突触可塑性等重要 的生理和病理过程。细胞内Ca2+稳态失衡必将导致细胞的损伤或死亡。钙激活中性蛋白 酶（calpain)是一种胞内Ca2+依赖的、水解半胱氨酸的蛋白酶家族，通过水解特异性蛋白 质的半胱氨酸调节多种酶和蛋白质的功能，参与细胞信号转导、细胞分化、细胞凋亡等多种 病理过程。Calpain共有14个家族成员，包括calpainl和calpain2。
[0005] PBDEs对神经系统的损害已经被证实，但是目前大多研究还是关注其神经发育毒 性的发生机制，而忽视了对其所引起的病灶进行预防或干预措施。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种钙激活中性蛋白酶和钙激活蛋白酶抑制剂的新用途， 其实现对PBDEs所引起病灶的诊断、治疗和预防。
[0007] 该用途具体如下：
[0008] 钙激活蛋白酶抑制剂roi50606的用途：将该钙激活蛋白酶抑制剂roi50606制成 用于治疗/预防由多溴联苯醚所引起病灶的治疗/预防药物。
[0009] 钙激活中性蛋白酶calpain2的用途：通过检测动物体内的钙激活中性蛋白酶 calpain2的活性对动物体内PBDEs积存量或PBDEs所引起病灶的诊断。
[0010] 申请人:通过长期试验发现，PBDEs会引起钙激活中性蛋白酶calpain2活力的改变 以及钙激活蛋白酶抑制剂roi50606会减轻PBDEs对钙激活中性蛋白酶calpain2活力的影 响，因此可通过检测动物体内I丐激活中性蛋白酶calpain2的活性，实现对PBDEs所引起病 灶的诊断。通过钙激活蛋白酶抑制剂HH50606制成的药物可对由多溴联苯醚所引起病灶 进行治疗/预防。
[0011] 另外，神经系统在生物体的正常机能发挥中起举足轻重的作用，由于其富含脂肪 组织，神经系统对各种亲脂性的环境污染物极为敏感。PBDEs是威胁儿童神经系统正常发育 的主要环境持久性有机污染物，具有明显的亲脂性、环境持久性、生物蓄积性和高毒性的特 点，具有明显的神经发育毒性。儿童在神经发育的早期通过接触室内灰尘和乳汁摄入大量 的PBDEs，引起神经系统不可逆的广泛的损伤，给青少年时期、成年期的学习、工作和生活带 来不可改变性逆的、随年龄增长不断加重的损伤。而对于神经发育异常造成的神经系统损 伤，现代医学显得无能为力。因此，本发明的主要效果是：calpain抑制剂HH50606能够在 神经系统发育的早期阶段，阻止环境污染物PBDEs对神经系统的损伤，保护神经系统的功 能和结构的完整，为预防PBDEs造成的儿童神经发育异常提供了可靠的干预措施。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1为实施例2中神经元的纯度鉴定结果图；
[0013] 图2-1为实施例2中空白对照组显微镜下观察神经细胞的形态图；
[0014] 图2-2为实施例2中DMS0溶剂对照组显微镜下观察神经细胞的形态图；
[0015] 图2-3为实施例2中10 μ M BDE-153组显微镜下观察神经细胞的形态图；
[0016] 图2-4为实施例2中20 μ M BDE-153组显微镜下观察神经细胞的形态图；
[0017] 图2-5为实施例2中40 μ M BDE-153组显微镜下观察神经细胞的形态图；
[0018] 图2-6为实施例2中20 μ M BDE-153+5 μ M PD150606组显微镜下观察神经细胞的 形态图；
[0019] 图2-7为实施例2中20 μ M BDE-153+20 μ M PD150606组显微镜下观察神经细胞 的形态图；
[0020] 图3为实施例2中BDE-153染毒和Η)150606干预后细胞活力的变化图；
[0021] 图4为实施例2中BDE-153染毒以及HH50606干预后细胞上清液中LDH活力的 变化图；
[0022] 图5为实施例2中BDE-153染毒以及HH50606干预后细胞凋亡率的变化图；
[0023] 图6为实施例2中BDE-153染毒以及HH50606干预后神经细胞calpain激酶活 力的变化图；
[0024] 图7为实施例3中染毒后1个月和2个月时大鼠的跳台实验结果比较图；
[0025] 图8为实施例3中染毒后1个月和2个月时大鼠 Morris水迷宫实验中游泳速度 和游泳时间的比较图(均数土标准表）；
[0026] 图9为实施例3中染毒后1个月和2个月时大鼠 Morris水迷宫实验中游泳距离 的比较图(均数土标准表）；
[0027] 图10为实施例3中染毒后1个月和2个月时大鼠旷场试验结果比较图(均数土 标准表）；
[0028] 图11-1为实施例3中溶剂对照组染毒后2个月时大鼠脑组织的病理
[0029] 形态学改变图（HE染色200X);
[0030] 图11-2为实施例3中lmg/kg BDE-153组染毒后2个月时大鼠脑组织的病理形态 学改变图（HE染色200X);
[0031] 图11-3为实施例3中中组染毒后2个月时大鼠脑组织的病理形态学改变图（HE 染色200X);
[0032] 图11-4为实施例3中10mg/kg BDE-153组染毒后2个月时大鼠脑组织的病理形 态学改变图（HE染色200X); 图11-5为实施例3中HH50606干预组染毒后2个月时大鼠脑组织的病理形态学改变 图（HE染色200 X)。
【具体实施方式】
[0033] 以下通过【具体实施方式】对本发明作进一步的说明和佐证；
[0034] 实施例lcalpainl，calpain2在PBDEs神经发育毒性中的作用
[0035] 前期研究发现，出生第10天接触BDE-153能引起青少年期和成年期大鼠的学习记 忆能力下降，自发活动能力降低，引起神经细胞内钙离子紊乱和神经细胞凋亡。而calpain 在与钙离子浓度变化相关的中枢神经系统疾病中发挥重要的作用。以下拟通过体内动物实 验，研究calpainl和calpain2在PBDEs神经发育毒性中的作用。
[0036] 采用的研究方案：
[0037] 新生的雄性SD大鼠仔鼠，在出生第4天（PND4)时按窝别和体重随机分成4组， 分别为橄榄油溶剂对照、lmg/kg，5mg/kg和10mg/kgBDE-153染毒组。在仔鼠出生第10天 (PND10)时，按0. lml/10g体重腹腔注射染毒BDE-153的橄榄油溶液一次，继续饲养2个月 后，断头处死大鼠，分离脑组织，检测calpainl和calpain2基因、蛋白和激酶活力的改变。
[0038] 研究结果：
[0039] 1. calpainl和calpain2基因表达量的改变
[0040] 通过实时荧光定量PCR技术检测calpainl和calpain2在BDE-153神经发育毒性 中的作用，结果显示calpainl基因的表达量在各组间没有明显改变，差异没有统计学意义 (P> 0. 05);随着染毒剂量的增加，calpain2基因表达量逐渐增加，中、10mg/kg BDE-153组 显著高于对照组，差异有统计学意义（*，P < 〇. 05)，10mg/kg BDE-153组显著高于lmg/kg BDE-153组（#，P < 0.05)，具体结果如表1、2所示。
[0041] 以上研究结果显示，BDE-153染毒后大鼠脑组织calpain激酶活力显著增高，而 calpainl的基因和蛋白表达量没有明显改变，calpain2基因和蛋白表达量随BDE-153剂量 的增加显著增加，提示calpain2在BDE-153神经发育毒性中起重要的作用。
[0042] 表1大鼠脑组织calpainl和calpain2基因表达的改变（均数土标准差）
[0043]
【权利要求】
1. 一种钙激活蛋白酶抑制剂roi50606的用途：一种钙激活蛋白酶抑制剂roi50606的 用途：将该钙激活蛋白酶抑制剂roi50606制成用于治疗/预防由多溴联苯醚所引起病灶的 治疗/预防药物。
【文档编号】A61P25/00GK104083350SQ201310471590
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】张红梅, 李新, 常利军, 张华俊 申请人:山西医科大学