抗菌肽Protegrin-1在防治猪蓝耳病中的应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明属于医药【技术领域】，具体公开了抗菌肽Protegrin-1在制备抗猪蓝耳病药物中的应用。本发明首先根据已报道的Protegrin-1的氨基酸序列，化学合成抗菌肽Protegrin-1，然后通过抗大肠杆菌DH5α实验验证其抗菌活性，并利用Marc-145细胞，通过qRT-PCR、Western-Blot、细胞上清TCID50检测及IFA等方法研究其对HP-PRRSV的抗病毒作用，进一步在病毒吸附和进入细胞两个过程阐述其抗病毒机制。结果发现Protegrin-1对HP-PRRSV有很好的抗病毒效果，有望成为一种新型的防治猪蓝耳病的药物。
【专利说明】抗菌肽Protegr in-1在防治猪蓝耳病中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药【技术领域】，具体涉及抗菌肽Protegrin-1在防治猪蓝耳病中的应用。
【背景技术】
[0002]猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS)又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome viruse, PRRSV)引起。该病最早于1987年在美国爆发，随后蔓延到欧洲，我国于1996年分离到该病毒。目前，根据基因组序列和抗原性差异，将PRRSV分为两种基因型，一种以Lelystad Virus (LV)毒株为代表的欧洲型，另一种以ATCC VR-2332毒株为代表的美洲型。在我国，PRRSV主要以美洲型为主，但据报道也分离到欧洲型毒株。2006年，我国爆发了猪高热病，对养猪业造成严重的经济损失，后来将此毒株定义为高致病型毒株(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome viruse,HP-PRRSV )。PRRS主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔及各年龄阶段猪特别是仔猪呼吸道症状，特征性病变为间质性肺炎，死亡率极高，是一种高度接触性的全球性的重要传染病。
[0003]PRRSV属于尼多病毒目(Nidovirales)、动脉炎病毒科(Arteriviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)成员，电镜下观察病毒粒子呈球形或椭圆形，有囊膜。病毒基因组为一条单股正链RNA，全长约为15Kb，含有5'和3'非编码区，中间为10个开放阅读框(openreading frame, ORF),其 中 0RF2-7 分别翻译病毒糖蛋白(glycoprotein GP) GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、GP5a、M及N蛋白。其中最重要的是GP5和N蛋白，它们不仅是病毒粒子的主要组成部分，而且在病毒粒子的包装、成熟、免疫逃避及抗体诱导中产生重要的作用。
[0004]PRRSV的防控是目前我国乃至世界的难题。PRRSV难于防控主要表现在以下几方面:(1)嗜巨噬细胞性和免疫抑制性疾病，PRRSV主要感染猪的肺泡巨噬细胞(Porcinealveolar macrophages, PAMs) , PAMs是免疫细胞,破坏PAMs,从而破坏机体免疫系统,从而引起免疫抑制；(2)抗原变异性，目前PRRSV变异较快，弱毒疫苗的使用是促使病毒变异的一个原因，疫苗没有交叉保护力；(3)抗体依赖性增强，PRRSV的感染会刺激机体产生抗体，但低效价的抗体不但不能中和病毒，反而对病毒的增殖有促进作用；(4)病毒持续性感染，PRRSV感染后，能够长时间在猪体内检测到病毒血症。(5)混合感染，目前临床上混合感染特别是圆环病毒、副猪嗜血杆菌等与PRRSV的混合感染使PRRSV防控难上加难。
[0005]目前PRRSV防控主要有灭活疫苗和弱毒疫苗，临床上用的较多的是弱毒疫苗。其中灭活疫苗有如下缺点:(1)需要大剂量接种或应用浓缩抗原，免疫期短，常需强化接种；
(2)不能引起局部免疫，以致细胞免疫的作用弱；(3)产生完全免疫力需要2-3周，不利于紧急预防接种与降低疫苗费用；(4)存在灭活不彻底和散毒的可能。而弱毒疫苗存在毒力返强、重组及潜在感染的危险。故疫苗在防制PRRSV中暴露出越来越多的问题。
[0006]抗菌肽Protegrin-1 (PG-1)是从猪白细胞中分离得到的由18个氨基酸残基组成的猪源抗菌肽，二级结构为β -折叠，4个半胱氨酸形成2个二硫键对其二级结构的维持及抗微生物学活性起着非常重要的作用，据报道，这2个二硫键的去除能够显著性地降低PG-1的抗微生物学活性。目前已证明PG-1对革兰氏阴性菌、部分革兰氏阳性菌、真菌以及少数囊膜病毒有抗微生物学活性，其中包括HIV、登革热病毒。PG-1是目前被证明为最具潜力成为抗生素的替代物之一。
[0007]猪蓝耳病对养猪业造成严重的经济损失，传染性极强。抗菌肽PG-1对PRRSV病毒是否具有抗病毒作用，至今还未有报道。故本发明使用PG-1研究其对PRRSV的抗病毒作用，以期寻找一种很好的抗PRRSV药物。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供抗菌肽Protegrin-1在制备抗PRRSV病毒药物中的应用。
[0009]本发明的另一目的在于提供抗菌肽Protegrin-1在制备防治猪蓝耳病药物中的应用。
[0010]本发明上述目的通过以下技术方案予以实现:
本发明通过实验发现抗菌肽Protegrin-1能够明显抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒吸附细胞，为通过药物治疗增强对猪繁殖与呼吸综合征病毒的防控提供有力支持。因此，本发明提供一种抗菌肽Pr otegrin-1在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的应用，同时本发明提供一种抗菌肽Protegrin-1在制备防治猪蓝耳病药物中的应用。
[0011]一种抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的药物制剂，包括有效量的抗菌肽Protegrin-1和药学上可接受的辅料。优选地，所述药物制剂为注射制剂或口服制剂。更优选地，所述注射制剂为冻干粉针剂；所述口服制剂为散片剂、胶囊剂或颗粒剂。
[0012]本发明首先化学合成生物活性分子抗菌肽Protegrin-Ι,其氨基酸序列为SEQ IDN0.1所示，氨基酸序列第6位和第15位Cys、第8位和第13位Cys形成2对二硫键，C端酰胺化修饰。然后验证其抗菌活性，进一步利用Marc-145细胞研究其对HP-PRRSV的抗病毒活性并通过病毒吸附细胞和进入细胞两个过程研究PG-1的抗HP-PRRSV机制。具体实验设计如下:
1、首先化学合成PG-1，然后测定其抗大肠杆菌活性，并筛选出PG-1活性最高的溶剂。
[0013]2、PG-1细胞毒性试验。AlamarBlue (购自Invitrogen公司)作为活细胞代谢指示剂，在线粒体酶促还原反应下会产生可测量的荧光代谢产物，通过测定其荧光强度可监测细胞活性。使用多功能酶标仪分别读取540nm激发光和590nm发射光荧光值，制作PG-1细胞毒性图。
[0014]3、PG-1抗病毒试验。用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养Marc-145细胞至汇合度为60-70%，弃去培养液，PBS洗3次，将含HP-PRRSV MOI=0.1 (空斑形成单位PFU=0.7 X TCID50,感染复数MOI=病毒数/细胞数)的2%胎牛血清的DMEM培养液加入细胞37°C继续培养5h，PBS洗3遍，将含不同浓度的PG-1的2%胎牛血清的DMEM培养液加入细胞37°C培养36h，收集上清做TCID5tl检测，另外进行qRT-PCR及Western-Blot检测。
[0015]4、PG-1 抗病毒间接免疫突光试验(Indirect Immunofluorescent Assay, IFA)。抗病毒试验方法同上，收集细胞，4%多聚甲醛固定lOmin，PBS洗lOmin，10%Triton_100穿孔15min，PBS洗lOmin，然后用PBS稀释1%BSA封闭30min，加入抗PRRSV病毒N蛋白的一抗，室温反应Ih,再加入抗鼠二抗作用lh, Hoechst染核5min, PBS洗IOmin,然后在突光显微镜下观察PG-1抗病毒效果。
[0016]5、PG-1抗病毒机制研究。(I) PG-1是否通过影响HP-PRRSV吸附Marc-145细胞从而达到抗HP-PRRSV的目的。首先，在Marc-145细胞汇合度70%的6孔板用PBS洗3次，然后以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，并加入浓度梯度的PG_1，4°C孵育2h，孵育完后，用PBS洗3次，将未吸附到细胞表面的病毒清洗掉，然后在5%C02、37°C培养箱中培养24h，收集细胞对N基因做qRT-PCR和Western-Blot检测。(2)PG_1是否通过抑制HP-PRRSV进入Marc-145细胞来达到抗HP-PRRSV的目的。首先，在Marc-145细胞汇合度70%的6孔板用PBS洗3次，然后以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，4°C孵育2h，孵育完后，用PBS洗3次，将未吸附到细胞表面的病毒清洗掉，然后加入浓度梯度的PG-1的营养液在5%C02、37°C培养箱中培养6h，PBS洗3次，换新鲜的含2%胎牛血清的营养液继续培养24h，收集细胞Western-Blot检测，。(3)当PRRSV进入细胞4h后，PG-1是否还有抗病毒作用。首先，在Marc-145细胞汇合度70%的6孔板用PBS洗3次，然后以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，4°C孵育2h，PBS洗3次，将未吸附到细胞表面的病毒清洗掉，5%C02、37°C培养箱中培养4h，PBS洗3次，分别将含浓度为20、30、40mg/L的PG-1的2%胎牛血清的DMEM培养液加入细胞37°C培养6h，PBS洗3次，换新鲜的含2%胎牛血清的营养液(不含PG-1)继续培养24h，弃去营养液，PBS洗3遍，收集细胞Western-Blot 检测。
[0017]6、统计学分析。以上所有试验至少3次独立重复，结果采用平均值和标准误表示，使用泣t 来分析。所有统计分析均采用以八％ 作为具有显著统计学差异的检验标准，分析软件为SPSS 16.0和GraphPad Prism 5。
[0018]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
本发明最大的创新性在于首次使用PG-1来研究其对HP-PRRSV的抗病毒作用，并通过多种方法证明了 PG-1在Marc-145细胞水平对HP-PRRSV有很好的抗病毒效果，为研制抗猪蓝耳病的新型药物奠定了基础。
[0019]为了进一步研究PG-1的抗病毒作用，本发明还对PG-1抗HP-PRRSV的机制进行了研究。结果表明，PG-1的抗病毒作用是发生在HP-PRRSV吸附细胞过程中的。
[0020]为了增强PG-1的生物学活性，本发明在化学合成PG-1过程中对其C端进行了酰胺化修饰。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为PG-1抗大肠杆菌DH5 α活性图；图中ddH20 =PG-1溶解于0.01%冰乙酸的ddH20 中；PBS:PG-1 溶解于 0.01% 冰乙酸的 PBS 中；0.2M tris-Hcl 6.8:PG_1 溶解于 0.2Mtris-Hcl PH=6.8 缓冲液中；0.2M tris-Hcl 6.8/PBS:PG_1 溶解于 0.2M tris-Hcl PH=6.8PBS 缓冲液中；Contro1:100 μ L 浓度为 100mg/L Amp。
[0022]图2为AlamarBlue检测PG-1细胞毒性图。
[0023]图3为分别经不同浓度PG-1处理后的HP-PRRSV感染的Marc-145细胞上清中的病毒滴度图。
[0024]图4为分别经不同浓度PG-1作用36h后，N基因相对于内参基因HPRTl的表达水平图。[0025]图5为分别经20、30mg/L PG-1处理36h后，N蛋白表达水平图。
[0026]图6为分别经20、30、40mg/L PG-1处理36h后，对N蛋白的间接免疫荧光试验图；绿色为抗PRRSV N蛋白颜色，蓝色为Hoechst染细胞核颜色。
[0027]图7为PG-1抗病毒机制一病毒吸附细胞过程中，N基因相对于内参GAPDH的表达水平图。
[0028]图8为PG-1抗病毒机制一病毒吸附细胞过程中，N蛋白Western-Blot检测图。[0029]图9为PG-1抗病毒机制一病毒进入细胞过程中，N蛋白Western-Blot检测图。
[0030]图10为PG-1抗病毒机制一病毒进入细胞4h后，N蛋白Western-Blot检测图。
【具体实施方式】
[0031]以下结合说明书附图和实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
[0032]本发明实施例中所用的病毒株为HP-PRRSV (高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒)，该毒株由华南农业大学兽医学院动物传染病实验室获得，HP-PRRSV是致病性比较高的猪繁殖与呼吸综合征病毒的简称，对本发明不做任何限定。
[0033]实施例1 PG-1化学合成及抗大肠杆菌活性实验
1、首先通过抗菌妝数据库(APD)The Antimicrobial Peptide Database (http://aps.unmc.edu/AP/main.php)查找猪源抗菌肽PG-1的氨基酸序列，如SEQ ID N0.1所示,将氨基酸序列发送至上海吉尔生化有限公司(http://glbetter.cn.1688.com/)进行合成，由于PG-1的β -折叠结构对其生物学活性至关重要，而β -折叠结构的形成依赖于PG-1中的2对二硫键，故在合成PG-1时一定要确保二硫键合成成功并准确定位。2对二硫键分别是第6位和第15位Cys、第8位和第13位Cys，并且为了增强PG-1的生物学活性，对其C端酰胺化修饰。HPLC 95%纯度，合成30mg。合成后0.01%冰乙酸灭菌水稀释成100mg/L，0.22 μ m过滤除菌，分装_80°C保存。
[0034]2、PG-1抗大肠杆菌活性实验。由于PG-1在弱酸性环境下才有活性且溶解性最高，为了使PG-1抗微生物学活性最高，将化学合成的PG-1粉末分别溶解于含0.01%冰乙酸的灭菌水、PBS及0.2M Tris-Hcl的灭菌水和PBS中，然后再研究其对大肠杆菌DH5 α的抗菌活性，筛选出PG-1活性最高的溶剂。
[0035]PG-1抗大肠杆菌活性实验方法采用标准琼脂孔穴扩散法。将疋coli DH5 a IOyL与55°C的LB固体培养基30mL混匀后涂布平板，待其凝固后，用直径为3mm的灭菌的打孔器打孔，并加入100 μ L PG-1，同时加入等体积的溶解PG-1溶剂作为阴性对照，Amp (IOOmg/mL)2l.! L作为阳性对照。37°C培养箱中培养12h，当能看到明显的抑菌圈时拿出并测量抑菌
圈直径。
[0036]每孔加入200 μ L上述稀释好的PG-1，同时设立氨苄青霉素阳性对照和0.01%冰乙酸的阴性对照，见附图1。由图1可知，当PG-1在0.01%冰乙酸的灭菌水中溶解时，抑菌圈最大，在0.01%冰乙酸的PBS中抑菌圈稍小，但在0.2Μ Tris-Hcl的灭菌水中溶解时几乎没有抑菌圈，故由图1说明，为了使PG-1对大肠杆菌DH5a抑菌效果最好，须将PG_1溶解在
0.01%冰乙酸的灭菌水中。
[0037]3、筛选出使PG-1活性最高的溶剂后，将PG-1粉末稀释成终浓度为100mg/L，0.22 μ m过滤除菌，分装，并于-80°c保存。
[0038]实施例2 PG-1细胞毒性试验
AlamarBlue (购自Invitrogen公司)作为活细胞代谢指示剂,在线粒体酶促还原反应下会产生可测量的荧光代谢产物，通过测定其荧光强度可监测细胞活性。用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养Marc-145细胞至60_70%，弃去培养液，加入含PG-1倍比稀释的营养液作用36h，设定PBS对照组，然后加入10% (V/V)比例AlamarBlue继续培养3h，使用多功能酶标仪分别读取540nm激发光和590nm发射光荧光值，制作PG-1细胞毒性图(见附图2)。以PBS对照组细胞活性作为100%，倍比稀释的PG-1处理的细胞的荧光值比上PBS对照组荧光值即为不同浓度下PG-1相对细胞活性，由图2可知，当PG-1浓度为40mg/L时，其对Marc-145细胞没有毒性，细胞活性100%，此浓度即为后面试验的最大浓度。
[0039]实施例3 PG-1抗病毒试验
1、在含10%胎牛血清的DMEM培养基的6孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时，弃去培养液，PBS洗3次，以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，在2%胎牛血清的DMEM培养液中37 °C继续培养5h。
[0040]2,PBS洗3遍，分别将浓度为20、30、40mg/L PG-1的2%胎牛血清的DMEM培养液加入细胞37°C培养36h，并设PBS对照组，PBS洗3遍，收集上清做TCID5tl检测，见附图3，由图3可知，PG-1可显著性地减少细胞上清中的病毒产量，抑制病毒释放到细胞上清中；另外每孔加400 μ L Trizol，提RNA，做qRT-PCR检测，见附图4，由图4可知，在转录水平上，PG-1可显著性地降低N基因表达水平。
[0041]3、同上以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，在2%胎牛血清的DMEM培养液中37°C继续培养5h，PBS洗3遍，分别将浓度为20、30、40mg/L PG-1的2%胎牛血清的DMEM培养液加入细胞37°C培养36h，并设PBS对照组，收集ImL上清做TCID5tl检测，弃去剩余培养液，PBS洗3遍，
0.25%胰酶消化，裂解细胞，测蛋白浓度`，Western-Blot检测，见附图5，由图5可知，在蛋白翻译水平上，PG-1可明显的降低N蛋白表达水平。故本实验从多方面证明PG-1有很好的抗HP-PRRSV效果。
[0042]4、PG-1 抗病毒间接免疫突光试验(Indirect Immunofluorescent Assay, IFA)。在含10%胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时，弃去培养液，PBS洗3次，以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，在2%胎牛血清的DMEM培养液中37°C继续培养5h，PBS洗3遍，分别将浓度为20、30、40mg/L PG-1的2%胎牛血清的DMEM培养液加入细胞37°C培养36h，并设PBS对照组，PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定10min，PBS洗lOmin，10%Triton-100 穿孔 15min，PBS 洗 lOmin，然后用 PBS 稀释 1%BSA 封闭 30min，抗 PRRSV N 蛋白一抗室温Ih,抗鼠二抗作用lh, Hoechst染核5min, PBS洗lOmin,进行IFA检测,在突光显微镜下观察PG-1抗病毒效果，见附图6，由图6可知，PG-1浓度为20、30、40mg/L时，抗PRRSV N蛋白荧光值明显低于PBS对照组，表明PRRSV N蛋白几乎没有在细胞中表达，即说明PG-1抗病毒效果明显,且当PG-1浓度为40mg/L时,抗病毒效果最明显。
[0043]实施例4 PG-1抗病毒机制研究一HP-PRRSV吸附抑制试验
1、在Marc-145细胞汇合度70%的6孔板用PBS洗3次，然后以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，并分别加入浓度为20、30、40mg/L PG_1，4°C孵育2h。
[0044]2,PBS洗3次，将未吸附到细胞表面的病毒清洗掉，然后在5%C02、37°C培养箱中继续培养24h，弃去培养液，PBS洗3次，收集细胞，每孔加400 μ L Trizol,提RNA，对N基因做qRT-PCR检测，见附图7 ;裂解细胞，测蛋白浓度，Western-Blot检测，见附图8。结果表明PG-1能够显著性地降低N基因和N蛋白表达水平，且随着PG-1浓度的升高，抑制效果更明显，当PG-1浓度为20mg/L时，HP-PRRSV N蛋白表达水平检测不到，说明在HP-PRRSV吸附细胞过程中，PG-1有很好的抗病毒效果。
[0045] 实施例5 PG-1抗病毒机制研究一HP-PRRSV进入抑制试验
1、在Marc-145细胞汇合度70%的6孔板用PBS洗3次，然后以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，4°C孵育2h。
[0046]2、PBS洗3次，将未吸附到细胞表面的病毒清洗掉，然后分别加入浓度为20、30、40mg/L PG-1，在 5%C02、37°C培养箱中培养 6h。
[0047]3、PBS洗3次，换新鲜的含2%胎牛血清的营养液继续培养24h，弃去营养液，PBS洗3遍，收集细胞Western-Blot检测，见附图9，由图9可知，在HP-PRRSV进入细胞过程中，PG-1抗病毒效果不明显，只有当PG-1浓度为40mg/L时，N蛋白表达水平有所下降，说明PG-1在HP-PRRSV进入细胞过程中抗病毒作用不明显。
[0048]实施例6 PG-1抗病毒机制研究一HP-PRRSV进入4h后抑制试验
1、在Marc-145细胞汇合度70%的6孔板用PBS洗3次，然后以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，4°C孵育2h，PBS洗3次，将未吸附到细胞表面的病毒清洗掉，5%C02、37°C培养箱中培养4h。
[0049]2、PBS洗3次，分别将浓度为20、30、40mg/L PG-1的2%胎牛血清的DMEM培养液加入细胞37°C培养6h。
[0050]3、PBS洗3次，换新鲜的含2%胎牛血清的营养液继续培养24h，弃去营养液，PBS洗3遍，收集细胞Western-Blot检测，见附图10，结果表明，当HP-PRRSV在37°C进入细胞4h后再用不同浓度PG-1处理，PG-1抗病毒效果不明显，只有当PG-1浓度为40mg/L时，才有抗病毒效果，说明在病毒进入细胞4h后，PG-1抗病毒效果不明显。
【权利要求】
1.抗菌肽Protegrin-1在制备抗PRRSV病毒药物中的应用，其特征在于，所述Protegrin-1的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.抗菌肽Protegrin-1在制备防治猪蓝耳病药物中的应用，其特征在于，所述Protegrin-1的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于,所述的Protegrin-1的二级结构为β -折叠，其氨基酸序列第6位和第15位Cys、第8位和第13位Cys形成2对二硫键，C端酰胺化修饰。
4.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述的抗菌肽Protegrin-1使用剂量范围为 20 mg/L ~40mg/L。
5.一种抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的药物制剂，其特征在于，包括有效量的抗菌肽Protegrin-1和药学上可接受的辅料。
6.根据权利要求5所述药物制剂，其特征在于，所述药物制剂为注射制剂或口服制剂。
7.根据权利要求6所述药物制剂，其特征在于，所述注射制剂为冻干粉针剂。
8.根据权利要求6所述药物制剂，其特征在于，所述口服制剂为散片剂、胶囊剂或颗粒剂。
【文档编号】A61P31/14GK103623391SQ201310469273
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年10月10日 优先权日:2013年10月10日
【发明者】刘小红, 郭春和, 莫德林, 陈瑶生, 高进涛 申请人:中山大学