一种抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体及其构建方法和应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体及其构建方法和应用，本发明的一种猪源嵌合抗体由一条轻链和一条重链通过二硫键和非共价键联结形成，所述的轻链从N端到C端依次包括鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗轻链可变区和猪IgG轻链恒定区，所述的重链依次包括鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗重链可变区和猪IgG重链恒定区。实验证明本发明的一种抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体无论在体内还是体外都具有显著地抑菌效果，因此本发明的抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体在检测或预防副猪嗜血杆菌感染方面具有广泛的应用前景。
【专利说明】一种抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种猪源嵌合抗体及其构建方法和应用，特别涉及ー种能够抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体及其构建方法和应用，属于生物医药【技术领域】。
【背景技术】
[0002]副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)为非溶血、NAD依赖性的革兰氏阴性菌，属于巴斯德杆菌科。副猪嗜血杆菌是猪的ー种重要上呼吸道病原菌，是格拉瑟氏病(Glsser’s Disease)的病原。该病以脑膜炎、关节炎以及纤维素性多发性浆膜炎为主要特征，有时会出现败血症和急性肺炎症状。近年，随着猪群养殖方式的改变，如早期断奶方案和三点养殖系统的应用，因副猪嗜血杆菌而引起的猪群的发病率和死亡率逐年増加，并且已成为危害商业化养猪场，特别是SPF猪场最为严重的细菌病之一。虽然用抗生素可以有效治疗因HPS引起的格拉瑟氏病，但关于HPS的耐药性已经有很多报道。疫苗是防治格拉瑟氏病的有效方法，但是由于HPS血清型众多，単一血清型的疫苗只能保护猪群免受同型HPS的攻击，并且关于HPS疫苗交叉保护能力较差已经有很多研究报道。因此，寻找新的防治格拉瑟氏病的方法是非常必要的。
[0003]鼠源抗副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)单克隆抗体1D8能与15个血清型副猪嗜血杆菌反应，井能部分保护小鼠免受同源及异源副猪嗜血杆菌额攻击，请參见文献:副猪嗜血杆菌具有保护效カ单克隆抗体的筛选和免疫原性蛋白的鉴定，田华彬，《中国农业科学院》，2012年。然而，直接在其他种属动物上应用鼠源单克隆抗体可能存在问题。来自不同种属动物的抗体可能不与Fe受体和/或补体反应，这会导致适当的下游功能的缺乏并在体内被快速清除。为了克服鼠源单克隆抗体在猪体内应用的缺陷从而产生了包含猪Fe区域和鼠源可变区的嵌合抗体。利用重组DNA技术产生嵌合抗体用于人类疾病的治疗和预防已被广泛报道。产生鼠-猪嵌合抗体的报道寥寥无几。仅有针对猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和猪流行性腹泻病毒单克隆抗体构建的鼠-猪嵌合抗体的报道，但两篇文章均未提及嵌合抗体在体内抵抗病毒攻击的能力。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种新的可用于副猪嗜血杆菌感染的检测和预防的方法。为此，本发明提出了一种抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体，实验证明本发明的一种抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体无论在体内还是体外都具有显著地抑菌效果。
[0005]为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段:
[0006]本发明的一种抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体，其特征在于所述的抗体由一条轻链和一条重链通过二硫键和非共价键联结而成，所述的轻链从N端到C端依次包括鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗轻链可变区和猪IgG轻链恒定区，所述的重链依次包括鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗重链可变区和猪IgG重链恒定区。
[0007]在本发明中，优选的， 所述的鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述的猪IgG轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，所述的鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，所述的猪IgG重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0008]在本发明中，优选的，所述的轻链和重链的N端还包括信号肽序列，更优选的，所述的轻链的氨基酸序列如SEQ ID N0.5所示，所述的重链的氨基酸序列如SEQ IDN0.6所示。
[0009]本发明还提出了编码以上任一项所述猪源嵌合抗体的核苷酸序列。
[0010]在本发明中，优选的，编码鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示，编码猪IgG轻链恒定区的核苷酸序列如SEQ ID N0.8所示，编码鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID N0.9所示，编码猪IgG重链恒定区的核苷酸序列如SEQ ID N0.10所示。
[0011]在本发明中，优选的，编码轻链和重链的核苷酸序列的5’端还分别连有编码信号肽序列的核苷酸序列，更优选的，编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID N0.11所示，编码重链的核苷酸序列如SEQ ID N0.12所示。
[0012]在本发明中，优选的，所述的信号肽序列如SEQ ID N0.13所示，编码该信号肽的核苷酸序列如SEQ ID N0.14所示。
[0013]更进一歩的，本发明还提出了ー种表达载体，其特征在于含有以上任一项所述的核苷酸序列。
[0014]在本发明中，优选的，所述的表达载体为杆状病毒表达载体，更优选的，所述的表达载体是在双向表达载体pFast-Bac-Dual的基础上构建得到的。
·[0015]再进ー步的，本发明还提出了一种表达所述的抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体的方法，其特征在于包括以下步骤:
[0016](I)构建用于表达抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体的杆状病毒表达载体，其中編码猪源嵌合抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID N0.11所示，编码猪源嵌合抗体重链的核苷酸序列如SEQ ID N0.12所示；
[0017](2)将构建得到的杆状病毒表达载体转染昆虫细胞并进行杆状病毒的组装；
[0018](3)获得的杆状病毒接种昆虫细胞，当细胞病变达到80-90%，收获杆状病毒感染的细胞培养物，纯化，即得。
[0019]在本发明中，优选的所述的杆状病毒表达载体是在双向表达载体pFast-Bac-Dual的基础上构建得到的，所述的编码猪源嵌合抗体轻链的核苷酸序列以及编码猪源嵌合抗体重链的核苷酸序列分别各自位于pFast-Bac-Dual上的PPH启动子或p 10启动子的下游,所述的昆虫细胞为sf-900 II。
[0020]最后，本发明还提出了所述的抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体在制备检测或预防副猪嗜血杆菌感染试剂或药物中的应用。及
[0021]所述的表达载体在制备抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体中的应用。
[0022]实验证明，采用本发明的方法制备得到的嵌合抗体蛋白，在体外能够抑制副猪嗜血杆菌生长；在小鼠体内能够小鼠免受致死剂量的副猪嗜血杆菌的攻击。因此，说明本发明的嵌合抗体蛋白无论在体内还是体外都具有显著地抑菌效果。
【专利附图】
【附图说明】[0023]图1为单抗轻重链可变区与猪源抗体轻重链恒定区的PCR鉴定结果；
[0024]M:DNA Marker DL2000 ；1:轻链可变区；2:轻链恒定区；3:重链可变区；4:重链恒定区。
[0025]图2为重组质粒轻链与重链PCR鉴定结果；
[0026]1、3:轻链PCR扩增产物；2、4:重链PCR扩增产物；5:阴性对照；M:DNAMarkerDL2000 [0027]图3为双向表达载体pFast-Bac-Dual的载体图谱；
[0028]图4为轻链连接到pFast-Bac-Dual之后的双酶切鉴定结果；
[0029]1:轻链的双酶切鉴定图谱；M:DNA Marker DL2000
[0030]图5为连接有轻重链的pFast-Bac-Dual质粒的轻重链的双酶切鉴定结果；
[0031]1:重链的双酶切鉴定结果；2:轻链双酶切鉴定结果；M:DNA Marker DL2000
[0032]图6为双向表达载体pFast-Bac-Dual-H+L的载体图谱；
[0033]图7为P2病毒接毒72h之后的昆虫细胞与对照组昆虫细胞的对比图片；
[0034]图8为杆状病毒表达之后的SDS-PAGE结果；
[0035]M:蛋白Markerl:纯化后的表达蛋白
[0036]图9为杆状病毒表达之后的Western Blot检测图谱；
[0037]M:蛋白Markerl:纯化后的蛋白的Western Blot图谱
[0038]图10为重组蛋白与单抗1D8的ELISA对比结果；
[0039]图11为重组蛋白的体内抑菌试验。
【具体实施方式】
[0040]下面结合具体实施例来进ー步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0041]实施例1单抗轻重链可变区序列与猪抗体轻重链恒定区的扩增
[0042]I)鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗轻链可变区与重链可变区序列的扩增
[0043]抗副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)单克隆抗体1D8的制备及鉴定请參见文献:副猪嗜血杆菌具有保护效カ单克隆抗体的筛选和免疫原性蛋白的鉴定，田华彬，《中国农业科学院》，2012年。由中国农业科学研究哈尔滨兽医研究所猪传染病室猪病分子诊断组分离并保存。
[0044]鉴定抗体的亚型之后，将单抗细胞进行总RNA的提取(根据Axygen总RNA小量提取试剂盒)，并进行反转录。用设计的引物BacVL-F、BacVL-R与BacVH-F、BacVH-R，各引物序列如下表1所示，分别扩增鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗轻链可变区序列与单抗重链可变区序列。
[0045]表1
[0046]
【权利要求】
1.一种抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体，其特征在于所述的抗体由一条轻链和一条重链通过二硫键和非共价键联结而成，所述的轻链从N端到C端依次包括鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗轻链可变区和猪IgG轻链恒定区，所述的重链依次包括鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗重链可变区和猪IgG重链恒定区。
2.如权利要求1所述的猪源嵌合抗体，其特征在于所述的鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述的猪IgG轻链恒定区的氨基酸序列如SEQID N0.2所示，所述的鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，所述的猪IgG重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。
3.如权利要求1或2所述的猪源嵌合抗体，其特征在于在所述的轻链和重链的N端还包括信号肽序列，优选的，所述的轻链的氨基酸序列如SEQ ID N0.5所示，所述的重链的氨基酸序列如SEQ ID N0.6所示。
4.编码权利要求1-3任一项所述猪源嵌合抗体的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的核苷酸序列，其特征在于编码鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示，编码猪IgG轻链恒定区的核苷酸序列如SEQ IDN0.8所示，编码鼠源抗副猪嗜血杆菌单抗重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID N0.9所示，编码猪IgG重链恒定区的核苷酸序列如SEQ ID N0.10所示。
6.如权利要求4所述的核苷酸序列，其特征在于在编码轻链和重链的核苷酸序列的5’端还分别连有编码信号肽序列的核苷酸序列，优选的，编码轻链的核苷酸序列如SEQ IDN0.11所示，编码重链的核苷酸序列如SEQ ID N0.12所示。
7.—种表达载体,其特征在于含有权利要求4-6任一项所述的核苷酸序列。
8.如权利要求7所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体为杆状病毒表达载体，优选的，所述的表达载体是在双向表达载体pFast-Bac-Dual的基础上构建得到的。
9.ー种表达权利要求1所述的抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)构建用于表达抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体的杆状病毒表达载体，其中编码猪源嵌合抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID N0.11所示，编码猪源嵌合抗体重链的核苷酸序列如 SEQ ID N0.12 所示； (2)将构建得到的杆状病毒表达载体转染昆虫细胞并进行杆状病毒的组装； (3)获得的杆状病毒接种昆虫细胞，当细胞病变达到80-90%，收获杆状病毒感染的细胞培养物，纯化，即得。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述的杆状病毒表达载体是在双向表达载体pFast-Bac-Dual的基础上构建得到的，所述的编码猪源嵌合抗体轻链的核苷酸序列以及编码猪源嵌合抗体重链的核苷酸序列分别各自位于pFast-Bac-Dual上的PPH启动子或PlO启动子的下游，所述的昆虫细胞为sf-900 II。
11.权利要求1-3任一项所述的抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体在制备检测或预防副猪嗜血杆菌感染试剂或药物中的应用。
12.权利要求5或6所述的表达载体在制备抗副猪嗜血杆菌的猪源嵌合抗体中的应用。
【文档编号】A61K39/40GK103570832SQ201310431967
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年9月22日 优先权日:2013年9月22日
【发明者】李曦, 符芳, 柴政, 田华彬 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所