一种组织工程化软骨移植物及其制备方法
【专利摘要】一种组织工程化软骨移植物及其制备方法，属于生物医学组织工程中利用生物活性诱导因子诱导分化骨髓间充质干细胞（Bone?marrow?mesenchymal?stem?cells，BMSCs）成软骨细胞复合支架材料构建组织工程化软骨的【技术领域】。组织工程化软骨移植物通过下述方法制备：(1)制备Nano-HA/PLLA软骨支架材料：(2)将BMSCs与Nano-HA/PLLA软骨支架材料共同培养，用成软骨诱导液将BMSCs诱导分化成软骨细胞，得到组织工程化软骨移植物。本发明，提高了软骨支架材料的柔韧性和生物降解性，改善生物力学性能，更加有利于骨细胞的粘附生长和血管化；在动物实验中已经证明能很好的修复软骨缺损。
【专利说明】一种组织工程化软骨移植物及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学组织工程中利用生物活性诱导因子诱导分化BMSCs成软骨细胞复合支架材料构建组织工程化软骨的【技术领域】，涉及ー种用于软骨缺损修复的修复材料，具体涉及ー种组织工程化软骨移植物及其制备方法。
【背景技术】
[0002]长期以来，在生物材料及医学领域，软骨缺损修复一直是ー个重要的研究课题，然而迄今为止临床上对创伤、感染和肿瘤切除后所造成的大范围软骨缺损的修复仍未得到有效的解決。软骨移植作为ー种有效的软骨缺损修复方法已得到学者的公认，但由于目前尚未能制造出ー种理想的人工材料作为软骨移植替代材料，软骨缺损修复材料的研究成为近百年来的热点课题之一。软骨组织工程研究主要有4方面:支架材料、种子细胞、细胞因子、临床使用。组织工程化软骨作为软骨修复材料的替代物可以避免生物源修复材料的缺陷。将生物相容性好的有骨传导能力的并在体内可生物降解的支架材料与具有強大诱导活性的细胞因子结合可以使软骨缺损修复拥有骨传导和诱导的双重特性，在迅速成软骨的同时植入材料逐渐降解，为软骨缺损的修复提供了全新的思路和方法。
[0003]羟基磷灰石(Hydroxy-apatite,简称HA)是最常见的ー种生物活性材料,它具有与人体骨组织相似的无机成分，是目前公认的具有较好生物相容性和骨传导性的生物活性陶瓷材料。聚乳酸(Polylactic acid,简称PLA)是目前组织工程研究和应用最为广泛的ー类材料，这类材料无毒，无抗原性，具有良好的可降解吸收性、生物安全性和力学強度，可以通过控制成份含量来调节材料的降解速度，使产品性质的重复性和力学性能达到较高水平。
[0004]BMSCs主要存在于骨髓中，现证实BMSCs至少可向9种以上成熟细胞分化，其中包括软骨细胞及内皮细胞，分化多向性提示它可以成为细胞治疗和组织工程化软骨构建的理想种子细胞，因此BMSCs成为软骨`组织工程理想的种子细胞。
[0005]有研究发现，BMSCs体外培养时，在培养基中加入TGF-P I可以诱导BMSCs定向分化为软骨细胞，其II型胶原的表达与TGF-P I的剂量呈正相关，5~10ng/ml的TGF-3 I可有效地促进BMSCs向软骨方向的分化。TGF-Pl浓度达到10ng/ml可使II型胶原、Aggercan等因子的表达量提高2倍以上，促使BMSCs向软骨方向分化。因此，采用10ng/ml的TGF-P I的特殊软骨诱导系统，在无血清条件下诱导体外扩增至第三代的BMSCs向软骨细胞分化，诱导第四天首次换液吋，细胞形态有所膨胀，估计可能诱导液渗入有夫，14天后细胞呈星形软骨细胞样。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于公开了用于软骨缺损修复的ー种组织工程化软骨移植物。
[0007]本发明的另ー个目的在于公开了上述组织工程化软骨移植物的其制备方法。
[0008]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:[0009]一种组织工程化软骨移植物，包括支架材料和种子细胞，其中，所述组织工程化软骨移植物是通过下述方法制备:
[0010](I)、Nano-HA/PLLA软骨支架材料的制备:
[0011 ] (a)、将Nano-HA和PLLA按质量比1:4溶解于有机溶剂溶剂内，混合均匀，得到配制好的生物材料；
[0012](b)、通过RIPF (低温冰型快速成形)エ艺成形具有间隔的平行冰线，RIPFエ艺的填充速度为20mm/s ；
[0013](C)、将配制好的生物材料填入冰线间的间隔，将填了生物材料后的表面刮平，使得冰线和生物材料交替排列；
[0014](d)、在正交方向成形下一层冰线，重复步骤(b)和(C)；
[0015](e)、成形后，将冰和生物材料构成的实体拿到冷藏室，冰融化剩下的空间即为骨组织支架所需的纵横交错、彼此连通的大孔；
[0016](f)、将由生物材料构成多孔支架再放置在冻干机中冷冻干燥之后，有机溶剂升华，留下了大量更为微细的孔洞；
[0017](2)、组织工程化软骨移植物的构建:
[0018]BMSCs传代至第3代后经含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化后接种于Nano-HA/PLLA软骨支架材料中在含FBS的H-DMEM培养液内进行共培养；当细胞长满约50%~60%吋，将培养基更换为加入了成软骨诱导液的不含FBS的H-DMEM培养液，4天后首次更换培养基，以后每3-4天更换培养基， 共诱导两周，即得组织工程化软骨移植物；所述成软骨诱导液的组成为TGF-0 110 u g/L、胰岛素6.25mg/L、丙酮酸钠lmmol/L、维生素C37.5mg/L、地塞米松lCT7mol/L、转铁蛋白6.25mg/L和亚硒酸6.25mg/L。
[0019]上述技术方案所述的组织工程化软骨移植物，其中，步骤(a)中的有机溶剂为1-4 二氧六环；步骤(e)中的骨组织支架为三维多孔结构，孔隙为200-5001! m，孔隙率为80%-90%，孔隙为连通孔隙。
[0020]上述技术方案所述的组织工程化软骨移植物，其中，BMSCs经胰蛋白酶消化后接种于Nano-HA/PLLA软骨支架材料中的接种密度为6X 103/cm2。
[0021]上述技术方案所述的组织工程化软骨移植物的制备方法，包括下述步骤:
[0022](I)、Nano-HA/PLLA软骨支架材料的制备:
[0023](a)、将Nano-HA和PLLA按质量比1:4溶解于有机溶剂溶剂内，混合均匀，得到配制好的生物材料；
[0024](b)、通过RIPFエ艺成形具有间隔的平行冰线，RIPFエ艺的填充速度为20mm/s ；
[0025](C)、将配制好的生物材料填入冰线间的间隔，将填了生物材料后的表面刮平，使得冰线和生物材料交替排列；
[0026](d)、在正交方向成形下一层冰线，重复步骤(b)和(C)；
[0027](e)、成形后，将冰和生物材料构成的实体拿到冷藏室，冰融化剩下的空间即为骨组织支架所需的纵横交错、彼此连通的大孔；
[0028](f)、将由生物材料构成多孔支架再放置在冻干机中冷冻干燥之后，有机溶剂升华，留下了大量更为微细的孔洞；
[0029](2)、组织工程化软骨移植物的构建:[0030]BMSCs传代至第3代后经含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化后接种于Nano-HA/PLLA软骨支架材料中在含FBS的H-DMEM培养液内进行共培养；当细胞长满约50%~60%吋，将培养基更换为加入了成软骨诱导液的不含FBS的H-DMEM培养液，4天后首次更换培养基，以后每3-4天更换培养基，共诱导两周，即得组织工程化软骨移植物；所述成软骨诱导液的组成为TGF-0 110 u g/L、胰岛素6.25mg/L、丙酮酸钠lmmol/L、维生素C37.5mg/L、地塞米松lCT7mol/L、转铁蛋白6.25mg/L和亚硒酸6.25mg/L。
[0031]上述技术方案所述的组织工程化软骨移植物的制备方法，其中，步骤(a)中的有机溶剂为1-4 二氧六环；步骤(e)中的骨组织支架为三维多孔结构，孔隙为200-5001! m，孔隙率为80%-90%，孔隙为连通孔隙。
[0032]上述技术方案所述的组织工程化软骨移植物的制备方法，其中，BMSCs经胰蛋白酶消化后接种于Nano-HA/PLLA软骨支架材料中的接种密度为6X 103/cm2。
[0033]本发明具有以下有益效果:
[0034]1、本发明利用RIPF(低温快速成型)技术将Nano-HA和PLLA复合制备三维多孔的Nano-HA/PLLA人工骨，该三维多孔的人工骨支架材料综合了 Nano-HA和PLLA两者的优点，使其在良好骨传导性和生物相容性的基础上，提高柔韧性和生物降解性，改善生物力学性能，更加有利于骨细胞的粘附生长和血管化，必将极大地提高骨缺损处移植人工骨的愈合速度及效果，是ー种理想的新型纳米复合人工骨支架材料。
[0035]2、本发明采用密度梯度离心联合贴壁法分离培养BMSCs，大大提高了分离的成功率。并在培养基中加入诱导因子TGF-P I向软骨细胞分化，能够最大限度的发挥TGF-3 I的作用时间。
[0036]3、本发明所述构建的组织工程化软骨移植物可以用于修复软骨缺损的软骨移植物，在动物实验中已经证明了能很好的修复软骨缺损。`【专利附图】
【附图说明】:
[0037]1、图1为本发明实施例3中Nano-HA/PLLA软骨支架材料微观结构观察结果(SEM50 X)；
[0038]2、图2为本发明实施例3中制备的组织工程化软骨移植物扫描电镜下观察结果(SEM5000 X)；
[0039]3、图3为诱导后软骨细胞II型胶原免疫组化染色呈阳性表达；
[0040]4、图4为RT-PCR检测复合后诱导细胞Aggrecan、col2Al的表达；
[0041]5、图5为Western-bolt检测复合后诱导细胞II型胶原蛋白的表达；
[0042]6、图6为本发明实施例4中A组24周时大体观察图；
[0043]7、图7为本发明实施例4中B组24周时大体观察图；
[0044]8、图8为本发明实施例4中C组24周时大体观察图；
[0045]9、图9为本发明实施例4中A组24周时组织学检测图；
[0046]10、图10为本发明实施例4中B组24周时组织学检测图；
[0047]11、图11为本发明实施例4中C组24周时组织学检测图。
【具体实施方式】:[0048]为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明一种组织工程化软骨移植物及其制备方法作进ー步的说明。
[0049]实施例1:Nano-HA的制备:
[0050]采用溶胶-絮凝法合成羟基磷灰石。制备方法:将硝酸钙与磷酸铵的水溶液进行化学合成，合成过程中加入一定量的氨水，调整溶液的PH值为8~13，添加分散剂，选择合适的搅拌器，调整搅拌器速率和搅拌时间，使其沉淀完全，然后经洗涤、过滤，将沉淀物在80~120°C干燥，在600~800°C温度下烧结2~3小时，将得到粉末粒径小于IOOnm与人体骨组织成份相似的纳米羟基磷灰石粉末。
[0051]实施例2、PLLA的制各
[0052]1、丙交酯的制备:取乳酸与ZnO粉末，逐渐升温使乳酸脱水变为丙交酯；然后升温抽真空蒸出淡黄色丙交酯单体，再以こ酸こ酯为溶剂反复洗涤、重结晶提纯，抽滤，真空干燥，得无色片状纯丙交酯晶体。
[0053]2、PLLA的合成:纯净丙交酯单体，加入辛酸亚锡引发剂，常温下真空干燥一定时间后，在硅油浴中浸泡3-5min，密封反应瓶，升温至单体刚熔化时反复摇动反应瓶至混合均匀，然后记时聚合至一定时间取出反应瓶。
[0054]3、PLLA的纯化:粗制PLLA中加入二氯甲烷使其完全溶解，过滤，滤液中加入甲醇至沉淀完全，再过滤，甲醇洗涤，真空干燥，得到白色纯PLLA。
[0055]4、PLLA分子量的測定:称取一定量的PLLA溶解于三氯甲烷中，用乌氏粘度法测定，计算相对粘均分子质量。
[0056]本发明下述实施例中的原料Nano-HA和PLLA可以从市场购买也可以通过实施例1和2的方法进行制备。
`[0057]实施例3:组织工程化软骨移植物的制备:
[0058]一种组织工程化软骨移植物，包括支架材料和粘附于支架材料上的种子细胞，该种子细胞是由BMSCs经TGF-P I诱导分化成的软骨细胞；该组织工程化软骨移植物的制备方法如下:
[0059]1、Nano-HA/PLLA软骨支架材料的制备
[0060](I)、Nano-HA/PLLA软骨支架材料的制备:
[0061 ] (a)、将Nano-HA和PLLA按质量比1:4溶解于有机溶剂溶剂内，混合均匀，得到配制好的生物材料；
[0062](b)、通过RIPFエ艺成形具有间隔的平行冰线，RIPFエ艺的填充速度为20mm/s，填充的速度决定了平行冰线之间的间隔大小；
[0063](C)、将配制好的生物材料填入冰线间的间隔，将填了生物材料后的表面刮平，使得冰线和生物材料交替排列；
[0064](d)、在正交方向成形下一层冰线，重复步骤(b)和(C)；
[0065](e)、成形后，将冰和生物材料构成的实体拿到冷藏室，冰融化剩下的空间即为骨组织支架所需的纵横交错、彼此连通的大孔；
[0066](f)、将由生物材料构成多孔支架再放置在冻干机中冷冻干燥之后，有机溶剂升华，留下了大量更为微细的孔洞，即得Nano-HA/PLLA软骨支架材料，如图1所示，其中图1为Nano-HA/PLLA软骨支架材料微观结构观察(SEM50X)。[0067]2、BMSCs 制备:
[0068]取2 — 3月龄、体重2.0 — 2.5kg的新西兰大白兔，采用密度梯度离心法联合贴壁法分离、10%FBS的L-DMEM培养液培养rBMSCs，当原代细胞培养I周后，以1:2或者1:1消化传代，2-3天换液I次，传代至第3代后备用。
[0069]3、组织工程化软骨移植物的制备:
[0070]BMSCs传代至第3代后，用含有0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶进行消化，然后以6X IOVcm2的密度接种于Nano-HA/PLLA软骨支架材料中，在装有含FBS的H-DMEM培养液的无菌6孔培养板中进行共培养；
[0071]当细胞长满约50%~60%(细胞在培养皿中生长贴壁覆盖的比例)时，将培养基更换为不含FBS的H-DMEM培养液，在不含FBS的H-DMEM培养液加入成软骨诱导液，成软骨诱导液的组成为TGF-P 110 u g/L、胰岛素6.25mg/L、丙酮酸钠lmmol/L、维生素C37.5mg/L、地塞米松10_7mol/L、转铁蛋白6.25mg/L和亚硒酸6.25mg/L ；4天后首次换液，以后每3-4天换诱导液，共诱导两周，即得组织工程化软骨移植物，如图2所示，其中图2为组织工程化软骨移植物(即BMSCs经TGF-P I诱导分化成软骨细胞复合三维多孔Nano-HA/PLLA人工软骨支架材料)扫描电镜下观察(SEM5000X)，电镜扫描见分化细胞在支架材料分布均匀，黏附良好。
[0072]BMSCs -TGF-P I诱导后向软骨细胞分化，经甲苯胺蓝染色可见分化软骨细胞分泌糖胺聚糖(glycosaminoglycan, GAG), II型胶原免疫组织化学染色呈阳性(见图3,图3为诱导后软骨细胞II型胶原免疫组化染色呈阳性表达)；
[0073]4、RT-PCR检测复合材料中分化软骨细胞相关基因的表达: [0074]按照Trizol (Invitrogen, USA)试剂说明书操作消化收集贴附支架第7、14、21天的细胞并提取总RNA。按照Fermentas公司试剂盒操作,将2ul总RNA逆转录成cDNA,体系为 40ul。
[0075]PCR 仪(Eppendorf)扩增目的基因，50 ii I PCR 反应体系中含 2 X PCR Mastermix25ul, cDNA3iU，上、下游引物各2iU，引物序列和产物长度见表1，引物由深圳市欣海凌生物科技有限公司设计。
[0076]扩增条件为94 V 预变性 5min，94 V 30s, 56 V 30s, 72 V 45s，共 30 个循环，72 °C IOmin延伸，以GAPDH基因作为内源性參照基因(表1)。
[0077]表1PCR引物系列和产物长度
[0078].......生.巴.....................................................................................................gitiSM...............................................................................................................................................................................................................Aggrecan I;沪国-:5-AAOCiCl TA(R,tj 11' lXjI^CiCiA-3321 bp
卜游 R: 5-tTClCTTC'rrt.Cit)C'Tt?TTCCJ-3
A.1 1.Vi( ￥: 5-CC:ACCJllX'AACiTCCtlt^AAf.>
卜 iW R; 5-TC it'KiCTtX'ACCAt ;TTCTT?T.3249bp
GAPDH IM F: 5-CI'Al'TTTtiTOAACit'ICATlTC:C:T-3 22Sbp
______________卜-R:5.TCliTl*C'TtlT('T(iCiTCirTrT-3 _娜
[0079]结果见图4所示，图4为RT-PCR检测复合后诱导细胞Aggrecan、col2Al的表达；其中列I为7天、列2为14天、列3为21天。
[0080]5,ffestern Blot检测复合材料中分化软骨细胞II型胶原蛋白(Col2)分泌情况:
[0081]分别取第7、14、21天细胞载体复合物(组织工程化软骨移植物)PBS洗涤三次后，0.25%胰蛋白酶消化2min，加入含10%FBS培养液终止消化。吹打3min后把细胞悬液转移至离心管1500rpm,离心3min,弃上清加Trizol提取消化细胞总蛋白，以GAPDH作为阳性对照；10%SDS-PAGE凝胶电泳(Biorad垂直电泳仪),10 U I上样，110V,电泳60min ;之后15V电压转印70min (Biorad SD型半干转膜仪)；11型胶原单抗抗兔抗体(ー抗)5 y I加10%TBST5ml 稀释 1000倍，4°C封闭过夜；10% TBST洗涤 3 次(5min\ 次)，1:1000 鼠抗兔 IgG(二抗)，孵育一个小时后10% TBST洗涤3次(5min\次)，ECL显色并扫描进行定量分析。
[0082]结果见图5所示，图5为Western-bolt检测复合后诱导细胞II型胶原蛋白的表达；其中列I为7天、列2为14天、列3为21天。
[0083]RT-PCR 及 Western-bolt 检测不 7、14、21 天 Aggrecan、Col2Al 在 mRNA 水平、II 型胶原蛋白均有不同程度表达。
[0084]本发明所用的Nano-HA/PLLA软骨支架材料为三维多孔纳米复合支架材料，通过SEM电镜扫描测得孔隙为200-500 u m,孔隙率为80%_90%，并且所得孔隙为连通孔隙，与单一的生物材料相比具有更好的力学強度，更适合的生物降解性能，更适宜的生物相容性。
[0085]孔隙率的测试步骤如下:将重量为Ws的多孔支架放入100ml圆底烧瓶中，抽真空后，用针筒将こ醇注入瓶中，快速通大气，使こ醇在压力的作用下进入支架内部；通过几次抽真空/通大气过程使支架中的孔隙完全被こ醇占满；将此支架放入ー个预先已经盛满こ醇的称量瓶中，称重Wp将支架小心从瓶中取出后，再次称重称量瓶的重量w2。支架的孔隙率根据以下公式进行计算:
[0086]
0 = (W1-W2-WsVpeA^sX 100%
[0087]式中p e为支架材料的密度
[0088]Vs为こ醇的体积
[0089]实施例4:组织工程化软骨移植物在动物软骨缺损修复中的应用:
[0090]一、动物实验手术操作:
[0091]1、动物分组:
[0092]18只新西兰大白免，体重(2.5-3.0kg),雌雄不限，每个膝关节作为ー个単位，将18只兔分3组，每组6只免，12个关节。实验组(A组):缺损处移植培养2周的组织工程化软骨移植物(实施例3制备)；单纯支架组(B组):缺损处移植预湿的无菌支架材料；空白对照组(C组):缺损处不做处理。分别于术后24周每组处死所有实验兔取材，观察缺损处修复的情况。
[0093]2、手术方法:
[0094]新西兰大白兔18只，先喂养I周适应环境。肌肉注射速眠新(0.3ml/kg)，结合氯氨酮0.lg/kg腹腔注射麻酔，麻酔成功后，铺巾，无菌条件下行膝内侧髌骨旁切ロ，向外侧翻动髌骨，显露股骨内外侧髁及滑车。在股骨内侧髁以特制环钻钻孔，环钻外直径4.5_，钻取深度为5mm，造成圆柱形软骨及软骨下骨缺损区。
[0095]按照随机分组，A组在缺损处移植组织工程化软骨移植物；B组在缺损处移植无菌支架；C组缺损处旷置不做处理。清洗创ロ，縫合关节囊及皮肤。术后每只兔肌注40万单位青霉素，连续3天，以防膝关节感染。术后如常喂养，术肢无需制动。
[0096]二、观察指标及方法:
[0097]1、术后一般情況:
[0098]动物术后肢体活动及饮食情況，伤ロ有无感染。
[0099]2、大体观察:
[0100]在24周每组分别处死6只兔，大体观察兔膝关节有无肿胀、粘连、积液，缺损处修复的形状、色泽、光滑度、有无凹陷、与周围正常软骨的结合情況。
[0101]3、组织学观察:
[0102]取下兔股骨内髁包括术区及周围正常软骨和软骨下骨的修复标本，10%的甲醛固定I周，5%硝酸溶液脱钙4-5天至标本变软，流水冲洗，梯度酒精脱水:按70%こ醇lh、80%こ醇lh、90%こ醇lh、95%こ醇lh、100%こ醇I 30min、100%こ醇II 30min，二甲苯透明:二甲苯I 30min、二甲苯II 30min，60°C下浸蜡4h，石蜡包埋，以连续切片，将切片放入45°C温水中展平，载玻片烤干，准备染色。
[0103]3.1、HE 染色:
[0104]取上述切片置于60°C恒温烤箱中烤片30min，二甲苯和梯度こ醇脱蜡水化，顺序为:二甲苯I 15min, 二甲苯II 15min,无水こ醇I 2min、无水こ醇II 2min、95%こ醇2min、80%こ醇2min、70%こ醇2min、流水2min、蒸懼水2min。苏木素染液染核5min,流动自来水快洗，1%的盐酸こ醇(70%)分化数秒`钟，自来水洗30min，氨水中“蓝化”3-4秒钟，蒸馏水中漂洗5min (换一次)，镜检，分化程度以胞核变蓝，背景接近无色为佳，如分化过头，可返回再染，如分化不足，可再次分化。然后入伊红染液染色l_5min。梯度こ醇脱水:70%こ醇数秒、80%こ醇2min、95%こ醇2min、无水こ醇I 2min、无水こ醇II 2min、无水こ醇与二甲苯等量混合液5min，二甲苯透明:二甲苯5-10min，中性树胶封片，倒置显微镜下观察，细胞核呈蓝黑色，细胞质为红色。
[0105]3.2、番0/固绿染色:
[0106]取上述切片置于60°C恒温箱烤片30min，二甲苯和梯度こ醇脱蜡水化:二甲苯I 15min, 二甲苯II 15min,无水こ醇I 2min、无水こ醇II 2min、95%こ醇2min、80%こ醇2min、70%こ醇2min、流水2min、蒸懼水2min。2%固绿水染3min, 1%番红0染色3min,蒸懼水洗，梯度こ醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，倒置显微镜下观察。
[0107]3.3、II型胶原免疫组化染色:
[0108]ー抗用鼠抗兔II型胶原单克隆抗体(1: 50)，二抗用生物素化兔抗鼠二抗(1:80)，DAB显色。具体方法如下(按S-P法)。取上述切片置于60°C恒温箱烤片30min，二甲苯和梯度こ醇脱腊水化:二甲苯I 15min, 二甲苯II 15min,无水こ醇I 2min、无水こ醇II 2min、95%こ醇2min、80%こ醇2min、70%こ醇2min、流水2min、蒸懼水2min。首先滴加50 U I过氧化酶阻断溶液(试剂A)，室温孵育15min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，PBS清洗3次(3min/次)；吸出PBS液后加I滴非免疫动物血清(试剂B)，室温孵育15min ；PBS清洗后加50 ill的第一抗体，室温孵育80min，PBS冲洗三次；倒去PBS液后加50 U I生物素标记的第二抗体，室温下孵育IOmin ；PBS冲洗后加50 U I链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂D)，室温下孵育15min ；PBS冲洗后加2滴DAB溶液，显微镜观察后自来水冲洗，苏木素复染，自来水冲洗返蓝，DAB显色；切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。
[0109]三、結果:
[0110]1、一般情況:
[0111]麻醉清醒后，动物活动少、饮食減少，经2-3天后步态及饮食恢复，在喂养中伤ロ未出现红肿，伤ロ愈合好。
[0112]2、大体观察:
[0113](1)、12周的结果:大体观察显示A组缺损区被填充，表面稍平整，边缘整合好；B组轻度凹陷，表面不平，可见支架；C组凹陷深，能看见软骨下骨。
[0114](2)、24周的结果:A组缺损表面变得光滑、平整，边缘整合好，如图6所示出组凹陷变浅，但表面仍凸凹不平，边缘整合仍不理想，如图7所示；(:组凹陷较12周的结果变浅，缺损直径变小，但中央仍可见软骨下骨，如图8所示。
[0115]3、组织学检测:
[0116]A组:
[0117](I)、12周的样本显示正常或轻度超细胞结构，相比正常的组织细胞的排列缺乏典型软骨细胞的带状排列。纤维组织和多孔支架在缺损中占主导地位，但在缺损的表面出现类软骨特征的组织。番0染色切片显示整个移植区有sGAG。II型胶原的免疫染色显示:II型胶原蛋白是整个移植区不同软骨细胞分泌的。除了表面整个修复的组织被染色，局部有密集的染色区。
`[0118](2)、24周移植区，在表面附近的缺损区彻底被软骨细胞组织填充，底部形成规则的软骨下骨。紧密整合的软骨和骨。和正常的软骨相比，有钙化的软骨层在界面形成一道线。然而，在一些样本中，软骨下骨的形成不完全，导致部分界限。而在某些情况，修复组织与正常组织整合处有裂缝和裂纹，在无软骨组织处，番0染色和免疫染色显示sGAG和II型胶原蛋白的同一的分布，和正常软骨相似，如图9所示。在所有样本中，移植处II型胶原蛋白的密集度比正常组织的低，表明在重建组织中，II型胶原蛋白的量还是比正常软骨组织的少。
[0119]B组:
[0120](I)、12周的移植组有相对光滑的表面纤维组织形成，Nano-HA/PLLA多孔结构仍然可见，尤其在孔周围聚集着圆形的细胞。另外，在所以切片中既没有含有sGAG的大片软骨组织也没有II型胶原蛋白沉积。
[0121](2)、而某些情況，24周移植组缺损虽然有光滑的表面，但没有软骨层形成，番0也没染色，显示没有软骨细胞形成，如图10所示。
[0122]C组:
[0123](I)、12周的样本有不规则和纤维的表面，对sGAG和II型胶原蛋白不均匀的染色。
[0124](2)、24周的样本显示，纤维细丝在缺损中占主导，缺损没有完全填充同时没有软骨层形成。染色后电镜扫描整个移植区几乎没有sGAG和II型胶原蛋白，如图11所示。
[0125]以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所掲示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的 范围内。
【权利要求】
1.一种组织工程化软骨移植物，包括支架材料和种子细胞，其特征在于，所述组织工程化软骨移植物是通过下述方法制备: (1)、Nano-HA/PLLA软骨支架材料的制备: (a)、将Nano-HA和PLLA按质量比1:4共同溶解于有机溶剂溶剂内，混合均匀，得到配制好的生物材料； (b)、通过RIPFエ艺成形具有间隔的平行冰线，RIPFエ艺的填充速度为20mm/s； (c)、将配制好的生物材料填入冰线间的间隔，将填了生物材料后的表面刮平，使得冰线和生物材料交替排列； (d)、在正交方向成形下一层冰线，重复步骤(b)和(C)； (e)、成形后，将冰和生物材料构成的实体拿到冷蔵室，冰融化剩下的空间即为骨组织支架所需的纵横交错、彼此连通的大孔； (f)、将由生物材料构成多孔支架再放置在冻干机中冷冻干燥之后，得到Nano-HA/PLLA软骨支架材料； (2)、组织工程化软骨移植物的构建: BMSCs传代至第3代后经含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化后接种于Nano-HA/PLLA软骨支架材料中在含FBS的H-DMEM培养液内进行共培养；当细胞长满约50%~60%吋，将培养基更换为加入了成软骨诱导液的不含FBS的H-DMEM培养液，4天后首次更换培养基，以后每3-4天更换培养基，共诱导两周，即得组织工程化软骨移植物；所述成软骨诱导液的组成为TGF-P IlOii g/L、胰岛素6.25mg/L、丙酮酸钠lmmol/L、维生素C37.5mg/L、地塞米松10 7mol/L、转铁蛋白 6.25mg/L 和亚砸酸 6.25mg/L。
2.根据权利I所述的组织工程化软骨移植物，其特征在于:步骤(a)中的有机溶剂为1-4 二氧六环；步骤(e)中的骨组织支架为三维多孔结构，孔隙为200-500 ym，孔隙率为80%-90%，孔隙为连通孔隙。
3.根据权利I所述的组织工程化软骨移植物，其特征在于=BMSCs经胰蛋白酶消化后接种于Nano-HA/PLLA软骨支架材料中的接种密度为6X 103/cm2。
4.权利要求1所述的组织工程化软骨移植物的制备方法，包括下述步骤: (1)、Nano-HA/PLLA软骨支架材料的制备: (a)、将Nano-HA和PLLA按质量比1:4溶解于有机溶剂溶剂内，混合均匀，得到配制好的生物材料； (b)、通过RIPFエ艺成形具有间隔的平行冰线，RIPFエ艺的填充速度为20mm/s； (c)、将配制好的生物材料填入冰线间的间隔，将填了生物材料后的表面刮平，使得冰线和生物材料交替排列； (d)、在正交方向成形下一层冰线，重复步骤(b)和(C)； (e)、成形后，将冰和生物材料构成的实体拿到冷蔵室，冰融化剩下的空间即为骨组织支架所需的纵横交错、彼此连通的大孔； (f)、将由生物材料构成多孔支架再放置在冻干机中冷冻干燥之后，得到Nano-HA/PLLA软骨支架材料； (2)、组织工程化软骨移植物的构建: BMSCs传代至第3代后经含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化后接种于Nano-HA/PLLA软骨支架材料中在含FBS的H-DMEM培养液内进行共培养；当细胞长满约50%~60%吋，将培养基更换为加入了成软骨诱导液的不含FBS的H-DMEM培养液，4天后首次更换培养基，以后每3-4天更换培养基，共诱导两周，即得组织工程化软骨移植物；所述成软骨诱导液的组成为TGF-P IlOii g/L、胰岛素6.25mg/L、丙酮酸钠lmmol/L、维生素C37.5mg/L、地塞米松10-7mol/L、转铁蛋白 6.25mg/L 和亚砸酸 6.25mg/L。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在干:步骤(a)中的有机溶剂为1-4二氧六环；步骤(e)中的骨组织支架为三维多孔结构，孔隙为200-500 u m,孔隙率为80%_90%，孔隙为连通孔隙。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在干:BMSCs经胰蛋白酶消化后接种于Nano-HA/PLLA软骨支架材料中的接种密度为6X 103/cm2。
【文档编号】A61L27/38GK103495208SQ201310431784
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2013年9月18日
【发明者】王大平, 黄江鸿, 熊建义, 朱伟民, 刘建全, 尤微, 段莉, 张巨峰, 陈洁琳 申请人:深圳市第二人民医院