一种羔羊痢疾b型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种羔羊痢疾B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法；是将B型产气荚膜梭菌接种在硫乙醇酸盐流体培养基中，在厌氧环境条件下38℃14h培养增菌;将上述培养物加入到由缓冲液溶解的胰蛋白胨、糊精、酵母浸膏、L-精氨酸培养基中，在厌氧环境下振荡培5h，然后4℃15min3800g离心，蔡氏滤器中过滤除菌;将灭活好的类毒素按1:1比例加入灭菌的白油佐剂，并加入0.01%硫柳汞，即得类毒素疫苗。该疫苗无毒副作用，效价高，免疫力强，能有效预防、控制由B型产气荚膜梭菌引起的羔羊痢疾、绵羊、山羊、驹及犊牛的肠毒血症或坏死性肠炎。
【专利说明】一种羔羊痢疾B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及一种羔羊痢疾B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法。
[0002](二)发明背景
[0003]B型产气荚膜梭菌可引起羔羊痢疾、绵羊、山羊、驹及犊牛的肠毒血症或坏死性肠炎，主要致病毒素为α、β、ε毒素。由β_毒素引起的坏死性肠炎，一般认为是由于食物中的胰蛋白酶阻止了肠道中该毒素的分解，从而导致该病的发生。此外，该毒素可能还是一种神经毒素。而B型毒素的分泌量少，它则可促使动物的主动脉和其它动脉收缩而导致血压升高；此外，还具有与血脑屏障内血管上皮受体结合的能力，从而引起血管通透性增高,最终导致致死性水肿,但ε -毒素不耐热(Mcdonel, 1986)。
·[0004]多年来，我国生产中使用的是灭活菌苗，早在1989年，陈锡全等已经开展了 “兔病毒性出血症和A型魏氏梭菌联苗”的研究并且取得成功；恪承刚等(1991)研制兔的魏氏梭菌单苗，对实验动物可以产生82.01%的保护率；鲁承(1997)等对兔瘟病毒和A型魏氏梭菌二联苗进行了研究；杨瑛(1997)对A型魏氏梭菌氢氧化铝灭活苗进行研究，疫苗0.6ml、2ml、4ml可以保护小鼠、兔和猪抵抗标准A型IMLD毒素的攻击；姚湘燕等(1998)采用三个不同来源的牛源魏氏梭菌分离株研制牛魏氏梭菌浓缩AL(OH)3灭活苗；王克领(1998)等对兔出血病、魏氏梭菌病、巴氏杆菌病三联苗进行了研究；谭诗文等(2000)进行了羔羊痢疾、羊肠毒血症、大肠杆菌病、羊猝狙四联油佐剂灭活苗的研制。这些菌苗对该病的预防有一定的效果，同时也存在一些不足:最关键地是疫苗中的有效成分主要为菌体抗原，诱导机体产生的抗体只能够中和菌体抗原，却难以中和毒素抗原，与家畜“猝死症”致病机理不全相符。因此，灭活菌苗的有效性还存在一些质疑。
[0005]柴同杰(2001)对家畜“猝死症”致病机理的研究发现:在某种应激状态下，动物肠道中微生态平衡破坏，使魏氏梭菌呈‘爆炸性’的繁殖，瞬间产生大量的外毒素，肠粘膜通透性的升高使得毒素或细菌+毒素进入血液循环引起毒血症(有时伴有菌血症)，从而导致重要器官的衰竭，造成动物死亡；由此，进一步提出，“魏氏梭菌感染致病以及动物快速死亡的主要原因是肠源性毒血症，预防的关键在于针对毒素引起的毒血症，疫苗的抗原成分应是相应的类毒素”的学说。
[0006]B型产气荚膜梭菌引发的羔羊痢疾等疾病发病急，死亡快，有时症状不太明显并且根本来不及治疗。要从根本上控制本病的传播，减少或避免经济损失，必须采取切实有效的预防措施。产气荚膜梭菌形成的主要外毒素的化学成分为蛋白质，具有较好的免疫原性。因此，根据产气荚膜梭菌的发病机理，制备产气荚膜梭菌外毒素，将其灭活后做成类毒素疫苗，用于畜禽预防。
(三)
【发明内容】
[0007]为了解决上述问题，本发明发明提供了一种效价全、免疫力强、针对性好、无毒副作用的羔羊痢疾B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法，用于动物的B型产气荚膜梭菌病特别是羔羊痢疾的预防，控制羔羊痢疾等B型产气荚膜梭菌病的流行。[0008]羔羊痢疾等B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法，包括以下步骤:
[0009]IB型产气荚膜梭菌菌种接种于血平板培养基上在厌氧环境(气体的组成为85%氮气9%氢气6% 二氧化碳)下37 °C 46h复苏。
[0010]2B型产气荚膜梭菌接种在硫乙醇酸盐流体培养基中，在厌氧环境(气体的组成为85%氮气9%氢气6%二氧化碳)下38°C 14h培养增菌。
[0011]3将8ml上述培养物加入到产毒培养基海IOOmlPBS缓冲液溶解2g胰蛋白胨、Ig糊精、2g酵母浸膏和1.2rL-精氨酸)中，在厌氧环境下振荡培养，221摆/min，38°C培养5h，然后在4°C 3800g离心15min，再用孔径0.22 μ m的蔡氏滤器中过滤除菌，即得外毒素溶液。
[0012]4在外毒素溶液中加入外毒素溶液体积比为0.3%的甲醛，充分振荡混匀，置370C 48h灭活，间隔5-6h振摇一次，得到灭活好的类毒素溶液。
[0013]5在类毒素溶液中按1:1体积比加入灭菌的白油佐剂乳化，每100毫升乳化液中加Λ 0.01克硫柳汞制得B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗；
[0014]所述白油佐剂 构成:9份白油和一份Span-80混合后加入白油和Span-80混合液体积比2%的Tween-20和质量比1%的硬脂酸铝；
[0015]所述的血平板培养基成分为:100毫升蒸馏水、3.7g豆粉琼脂、Ig葡萄糖和5%体积比绵羊血；
[0016]所述的产毒培养基成分为:每IOOmlPBS缓冲液溶解2g胰蛋白胨、Ig糊精、2g酵母浸膏和1.2rL-精氨酸；
[0017]所述的PBS缓冲液成分为:IL去离子水、8g NaCU0.2g KC1、3.58gNa2HPO4.12Η20、0.27g ΚΗ2Ρ04。
[0018]使用时，肌肉注射，一次5毫升。
[0019]有益效果
[0020]该疫苗无毒副作用，效价高，免疫力强，能有效预防、控制由B型产气荚膜梭菌引起的羔羊痢疾、绵羊、山羊、驹及犊牛的肠毒血症或坏死性肠炎，能为养殖业减少损失，带来可视性利益。
(四)【具体实施方式】
[0021]实施例1疫苗制备的详细过程
[0022]首先，制备菌液。B型产气荚膜梭菌菌种NCTC6121 (National Collection of TypeCultures-英国微生物菌种保藏中心保藏保藏号:NCTC6121)挑取一环(约3 μ I)接种于血平板培养基(100ml蒸馏水、3.7g豆粉琼脂、Ig葡萄糖、5毫升绵羊血)厌氧环境(各气体浓度为85% N2、9% H2、6% CO2) 37°C 46h复苏。挑取一个B型产气荚膜梭菌菌落接种在硫乙醇酸盐流体培养基FT (青岛日水生物技术有限公司生产)中，在气体浓度为85% N2,9% H2,6% CO2的厌氧环境条件下38°C 14h培养增菌。
[0023]将上述培养物加入到自制的产毒培养基(每IOOmlPBS缓冲液溶解2g胰蛋白胨、Ig糊精、2g酵母浸膏和1.2gL-精氨酸)中，在厌氧环境下振荡培养，221摆/min，38°C 5h，4°C 15min3800g离心，再用孔径0.22μπι的蔡氏滤器中过滤除菌，即得外毒素，将所制备的外毒素加入甲醛使甲醛终浓度达到0.3%，充分振荡混匀，置37°C 48h灭活，间隔5-6h振
摇一次。[0024]在灭活好的类毒素溶液中按1:1体积比加入灭菌的白油佐剂，加入硫柳汞(每100毫升类毒素溶液中和白油佐剂疫苗混合液中加入0.01克硫柳汞)，即得类毒素疫苗。使用时，肌肉注射，一次5毫升。
[0025]实施例2疫苗安全性及效果的验证
[0026]最小致死量的确定用体重30kg的健康绵羊12只，随机分成四组,分别注射5ml、7ml、9ml、I Iml制备的B型产气荚膜梭菌外毒素，一天后，注射5ml和7ml外毒素的绵羊发生腹泻但不死亡，注射9ml和Ilml毒素的绵羊严重腹泻后死亡，因而确定9ml为绵羊最小致死量。
[0027]安全性检验取1.5kg健康兔4只，分别肌肉接种5ml所制备的B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗，连续观察10·天。局部无肉芽肿等不良反应，全身亦无异常反应。(参照《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》)
[0028]使用剂量的确定用体重为30kg的健康绵羊12只，随机分为四组，分别注射4、5、6、7ml所制备的疫苗，18d后四组均注射9ml的B型产气荚膜梭菌外毒素，观察3d，注射5、
6、7ml疫苗的绵羊均不死亡，并且无羔羊痢疾的症状，因而，免疫剂量定为5ml。
[0029]免疫效力检验用体重30kg的健康绵羊6只,其中4只肌肉注射5ml制备的类毒素疫苗，另外两只不注射类毒素疫苗作为对照组。18d后，6只绵羊均注射9ml的B型产气荚膜梭菌外毒素。24h后，对照组的2只绵羊严重腹泻并死亡，而免疫过的绵羊均不死亡，并且继续观察3d，无羔羊痢疾等发病症状。说明该疫苗对绵羊的保护力达到了 100%。
【权利要求】
1.一种羔羊痢疾B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤: 1)B型产气荚膜梭菌菌种接种于血平板培养基上在厌氧环境下37°C46h复苏； 2)复苏后的B型产气荚膜梭菌接种在硫乙醇酸盐流体培养基中，在厌氧环境下38 0C 14h培养增菌； 3)将步骤2)增菌培养物按照接种量8%体积比接种产毒培养基，在厌氧环境下振荡培养，38°C培养5h，然后在4°C 3800g离心15min，蔡氏滤器过滤除菌，得到外毒素溶液； 4)在外毒素溶液中加入外毒素溶液体积比为0.3%的甲醛，充分振荡混匀，置37°C 48h灭活，间隔5-6h振摇一次，得到灭活好的类毒素溶液； 5)在类毒素溶液中按1:1体积比加入灭菌的白油佐剂乳化，每100毫升乳化液中加入0.01克硫柳汞制得B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗； 所述白油佐剂构成:9份白油和一份Span-80混合后加入白油和Span-80混合液体积比2%的Tween-20和质量比1%的硬脂酸铝； 所述的血平板培养基成分为:100毫升蒸馏水、3.7g豆粉琼脂、Ig葡萄糖和5%体积比绵羊血； 所述的产毒培养基成分为:每IOOmlPBS缓冲液溶解2g胰蛋白胨、Ig糊精、2g酵母浸膏和1.2gL-精氨酸； 所述的 PBS 缓冲液成分为:1L 去离子水、8g NaCU0.2g KCl,3.58g Na2HPO4.12H20、0.27g KH2PO4。
【文档编号】A61P31/04GK103432579SQ201310416012
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】柴同杰, 刘雪慧, 王海荣 申请人:山东农业大学