流感病毒m1蛋白及其编码基因和应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种流感病毒M1蛋白及其编码基因和应用。本发明了M1蛋白，为如下（a）或（b）或（c）：（a）由序列表的序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）由序列表的序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（c）将（a）或（b）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且可以形成病毒样颗粒的由其衍生的蛋白质。M1蛋白可以作为形成病毒样颗粒的功能组件，将其与其他功能蛋白片段融合，可以形成病毒样颗粒状的融合蛋白，大大增加功能片段的效果。
【专利说明】流感病毒M1蛋白及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种流感病毒Ml蛋白及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002]流行性感冒病毒，简称流感病毒，是一种造成人、狗、马、猪及禽类等患流行性感冒的RNA病毒，在分类学上，流感病毒属于正黏液病毒科，它会造成急性上呼吸道感染，并借由空气迅速的传播，在世界各地常会有周期性的大流行。
[0003]流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，是流行性感冒(流感)的病原体。其中甲型流感病毒抗原性易发生变异，多次引起世界性大流行。
[0004]禽流感是禽流行性感冒的简称，它是一种由甲型流感病毒的一种亚型(也称禽流感病毒)引起的传染性疾病，被国际兽疫局定为甲类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。按病原体类型的不同，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性禽流感三大类。非致病性禽流感不会引起明显症状，仅使染病的禽鸟体内产生病毒抗体。低致病性禽流感可使禽类出现轻度呼吸道症状，食量减少，产蛋量下降，出现零星死亡。高致病性禽流感最为严重，发病率和死亡率均高,人感染高致病性禽流感死亡率约是60%，家禽感染的死亡率几乎是
100% ο
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种流感病毒Ml蛋白及其编码基因和应用。
[0006]本发明提供了一种 人工设计的Ml蛋白，为如下(a)或(b)或(C):
[0007](a)由序列表的序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0008](b)由序列表的序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0009](c)将(a)或(b)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且可以形成病毒样颗粒的由其衍生的蛋白质。
[0010]编码所述Ml蛋白的基因也属于本发明的保护范围。
[0011]编码所述Ml蛋白的基因优选为如下(I)或(2)或(3)或(4)所述的DNA分子:
[0012](I)序列表的序列2所示的DNA分子；
[0013](2)序列表的序列4所示的DNA分子；
[0014](3)在严格条件下与(I)或(2)限定的DNA序列杂交且编码可以形成病毒样颗粒的蛋白的DNA分子；
[0015](4)与(I)或(2)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且可以形成病毒样颗粒的蛋白的DNA分子。
[0016]上述严格条件可为在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC、
0.1%SDS 和 I X SSC,0.1%SDS 各洗膜一次。
[0017]所述Ml蛋白形成的病毒样颗粒也属于本发明的保护范围。
[0018]本发明还保护所述Ml蛋白或所述Ml蛋白形成的病毒样颗粒的应用，为如下(I )或(II)或(III)或(IV):( I)作为功能蛋白片段的载体；(II)制备功能蛋白片段的载体；(III)作为细胞骨架；(IV)制备细胞骨架。所述功能蛋白片段可为具有疫苗功能的蛋白片段，具体可为具有禽流感疫苗功能的蛋白片段，更具体可为HA蛋白片段。所述HA蛋白片段具体可由序列表的序列5自N末端第253至267位氨基酸残基组成。
[0019]本发明还保护具有所述Ml蛋白和功能蛋白片段的融合蛋白。所述功能蛋白片段可为具有疫苗功能的蛋白片段，具体可为具有禽流感疫苗功能的蛋白片段，更具体可为HA蛋白片段。所述HA蛋白片段具体可由序列表的序列5自N末端第253至267位氨基酸残基组成。[0020]所述融合蛋白具体可为如下(d)或(e)或(f):
[0021](d)由序列表的序列5自N端第I至267位氨基酸残基组成的蛋白质；
[0022](e)由序列表的序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0023](f)将(d)或(e)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且可以形成病毒样颗粒的由其衍生的蛋白质。
[0024]编码所述融合蛋白的基因也属于本发明的保护范围。
[0025]编码所述融合蛋白的基因优选为如下(5)或(6)或(7)或(8)所述的DNA分子:
[0026](5)序列表的序列6自5’末端第I至801位核苷酸所不的DNA分子；
[0027](6)序列表的序列6所示的DNA分子；
[0028](7)在严格条件下与(5)或(6)限定的DNA序列杂交且编码可以形成病毒样颗粒的蛋白的DNA分子；
[0029](8)与(5)或(6)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且可以形成病毒样颗粒的蛋白的DNA分子。
[0030]所述融合蛋白形成的病毒样颗粒也属于本发明的保护范围。
[0031 ] 本发明还保护所述融合蛋白或所述融合蛋白形成的病毒样颗粒在制备疫苗中的应用。所述疫苗可为禽流感疫苗，具体可为针对禽H9N2亚型流感病毒的禽流感疫苗，进一步具体可为针对AIV-SD株的禽流感疫苗。所述疫苗可为预防和/或治疗疫苗。
[0032]本发明还保护一种疫苗，其活性成分为所述融合蛋白或所述融合蛋白形成的病毒样颗粒。所述疫苗可为禽流感疫苗，具体可为针对禽H9N2亚型流感病毒的禽流感疫苗，进一步具体可为针对AIV-SD株的禽流感疫苗。所述疫苗可为预防和/或治疗疫苗。
[0033]禽H9N2 亚型流感病毒(Avian H9N2Influenza A Virus) AIV-SD 株，已于 2011 年3月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCC N0.4689。禽H9N2亚型流感病毒又称H9N2亚型禽流感病毒。禽H9N2亚型流感病毒(Avian H9N2Influenza A Virus)AIV_SD株CGMCC N0.4689 简称 AIV-SD 株。
[0034]本发明提供的Ml蛋白可以作为形成病毒样颗粒的功能组件，将其与其他功能蛋白片段融合，可以形成病毒样颗粒状的融合蛋白，大大增加功能片段的效果。基于该机理，本发明将Ml蛋白与HA蛋白片段融合，该融合蛋白形成病毒样颗粒，其对禽流感病毒的保护效果大大优于HA蛋白片段本身。本发明对于疫苗的研制具有重大价值。本发明对于禽流感病毒的预防或治疗具有重大价值。【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1为实施例1中的SDS-PAGE电泳图。
[0036]图2为实施例1中电镜观察的照片。
[0037]图3为实施例2中的SDS-PAGE电泳图。
[0038]图4为实施例2中电镜观察的照片。
【具体实施方式】
[0039]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0040]大肠杆菌BL21:北京博凌科为生物科技有限公司，货号CCOSOSopET-SZaG)质粒:北京诺博莱德科技有限公司。
[0041]禽H9N2 亚型流感病毒(Avian H9N2Influenza A Virus) AIV-SD 株，已于 2011 年3月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCC N0.4689。禽H9N2亚型流感病毒又称H9N2亚型禽流感病毒。禽H9N2亚型流感病毒(Avian H9N2Influenza A Virus)AIV_SD株CGMCC N0.4689 简称 AIV-SD 株。
[0042]实施例1、Ml蛋白的制备
[0043]一、重组质粒的制备
[0044]1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子(表达序列表的序列I所示的Ml蛋白)。
[0045]2、以步骤I合成的DNA分子为模板,用Primer-Ml-F和Primer-Ml-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0046]Primer-Ml-F:5’ -GGAATTCCATATGAGTCTTCTAACCG-3，；
[0047]Primer-Ml-R:5’ -CCGCTCGAGTACATTCTTTTCTAGT-3，。
[0048]3、用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
[0049]4、用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切pET_32a(+)质粒，回收约5400bp的载体骨架。
[0050]5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒甲。根据测序结果,对重组质粒甲进行结构描述如下:在pET-32a(+)质粒的Nde I和Xho I酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第4-756位核苷酸所示的双链DNA分子。重组质粒甲中，插入的DNA分子与pET-32a(+)质粒上的部分DNA融合，形成序列表的序列4所示的融合基因，表达序列表的序列3所示的融合蛋白(序列3中，最后6个氨基酸残基组成组氨酸标签)。
[0051]二、Ml蛋白溶液的制备
[0052]1、将步骤一得到的重组质粒甲导入大肠杆菌BL21，得到重组菌。
[0053]2、将步骤I得到的重组菌接种至IOml含50 μ g/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37°C>200rpm振荡培养6_8h，得到种子液。
[0054]3、将步骤2得到的种子液接种至IOOOml含50 μ g/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37°C、200rpm振荡培养，OD600nm=I时加入IPTG并使其浓度为0.lmg/ml，继续37°C、200rpm振荡培养4h。
[0055]4、取步骤3的培养体系，离心收集菌体。
[0056]5、用Binding buffer重悬步骤4获得的菌体,8000rpm离心IOmin,收集菌体。
[0057]6、用Binding buffer重悬步骤5得到的菌体,超声破碎(超声破碎仪购自宁波新芝生物科技股份有限公司，型号为SCIENTZ-1I D ;超声探头为10Φ ;超声6s，间歇12s，超声100次),4°C、12000rpm离心15min,收集上清液。
[0058]7、将步骤6得到的上清液上样于镍柱(购自广州誉维生物科技仪器有限公司，货号为7324610)，4°C静置孵育l_2h，然后打开镍柱底部的塞子，弃除穿透液；然后用30个柱体积(实际应用中，20-50个柱体积均可)的Wash Buffer洗涤镍柱，以除去非特异性结合的杂蛋白；然后用2个柱体积(实际应用中，1-3个柱体积均可)的Elution Buffer洗脱,收集过柱后溶液，即为Ml蛋白溶液。
[0059]纯化过程中的SDS-PAGE电泳图见图1，泳道I为加入IPTG前的菌体的破碎液，泳道2为步骤6中超声破碎后得到的上清液，泳道3和泳道4为步骤7得到的Ml蛋白溶液。
[0060]Binding buffer:含 20mM Tris>500mM NaCl、20mM imidazole, ρΗ8.0。
[0061]Wash Buffer:含 20mM Tris>500mM NaCl、60mM imidazole, pH8.0。
[0062]Elution Buffer:含 20mM Tris>500mM NaCl、500mM imidazole, pH8.0。
[0063]三、对照溶液的 制备
[0064]用PET_32a(+)质粒代替重组质粒甲进行步骤二，得到对照溶液。
[0065]四、将步骤二制备的Ml蛋白溶液4°C静置12小时，然后用电镜观察形态，照片见图2。结果表明，Ml蛋白可以形成病毒样颗粒。所以Ml蛋白可以和功能蛋白(如具有疫苗作用的功能蛋白)形成存在形式为病毒样颗粒状的融合蛋白，该融合蛋白的效果将优于单独的功能蛋白。
[0066]五、将步骤三制备的对照溶液4°C静置12小时，然后用电镜观察形态，观察不到病
毒样颗粒。
[0067]实施例2、融合蛋白的制备
[0068]一、重组质粒的构建
[0069]1、合成序列表的序列6自5’末端第I至801位所不的双链DNA分子(表达序列表的序列5自N端第I至267位核苷酸所示的蛋白质，序列5中，第I至252位氨基酸残基组成Ml蛋白，第253至267位氨基酸残基组成HA蛋白片段)。
[0070]2、以步骤I合成的DNA分子为模板,用Primer-F和Primer-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0071]Primer-F:5’ -GGAATTCCATATGAGTCTTCTAACCG-3，；
[0072]Primer-R:5’ -CCGCTCGAGCAGCTTGGGGTAGCT-3，。
[0073]3、用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
[0074]4、用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切pET_32a(+)质粒，回收约5400bp的载体骨架。
[0075]5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒乙。根据测序结果,对重组质粒乙进行结构描述如下:在pET-32a(+)质粒的Nde I和Xho I酶切位点之间插入了序列表的序列6自5’末端第4-801位核苷酸所示的双链DNA分子。重组质粒乙中，插入的DNA分子与pET-32a (+)质粒上的部分DNA融合，形成序列表的序列6所示的融合基因，表达序列表的序列5所示的融合蛋白(序列5中，最后6个氨基酸残基组成组氨酸标签)。
[0076]二、融合蛋白溶液的制备
[0077]用重组质粒乙代替重组质粒甲，其它同实施例1的步骤二。
[0078]得到融合蛋白溶液。
[0079]纯化过程中的SDS-PAGE电泳图见图3，泳道I为加入IPTG前的菌体的破碎液，泳道2为步骤6中超声破碎后得到的上清液，泳道3为步骤7得到的融合蛋白溶液。
[0080]三、HA片段溶液的制备
[0081]将序列表的序列6自5’末端第757至801位核苷酸所述的双链DNA分子插入pET-32a(+)质粒的Nde I和Xho I酶切位点之间，得到重组质粒丙。
[0082]用重组质粒丙代替重组质粒乙，其它同实施例1的步骤二，得到HA片段溶液。
[0083]四、对照溶液的制备
[0084]用pET_32a(+)质粒代替重组质粒乙，其它同实施例1的步骤二，得到对照溶液。
[0085]五、将步骤二制备的融合蛋白溶液4°C静置12小时，然后用电镜观察形态，照片见图4。结果表明，融合蛋白可以形成病毒样颗粒。
[0086]六、将步骤三制备的HA片段溶液4°C静置12小时，然后用电镜观察形态，观察不到
病毒样颗粒。
[0087]七、将步骤四制备的对照溶液4°C静置12小时，然后用电镜观察形态，观察不到病
毒样颗粒。
[0088]实施例3、疫苗的制备
[0089]一、疫苗甲的制备
[0090]油相:弗氏佐剂(购自上海博蕴生物科技有限公司代理sigma产品，货号:BY12096)。
[0091]水相:实施例2制备的融合蛋白溶液(蛋白浓度为0.lmg/ml)。
[0092]乳化:取I体积份油相放于乳化缸内，开动电机慢速转动搅拌，同时缓慢加入I体积份水相，加完后再以10000转/分钟，搅拌2~5分钟；得到疫苗甲。
[0093]二、疫苗乙的制备
[0094]用实施例2制备的HA片段溶液等体积代替融合蛋白溶液进行步骤一，得到疫苗乙。
[0095]三、对照品的制备
[0096]用实施例2制备的对照溶液等体积代替融合蛋白溶液进行步骤一，得到对照品。
[0097]实施例4、融合蛋白的应用
[0098]一、对雏鸡免疫的效力
[0099]将雏鸡(品种为SPF白杭鸡， 购自北京维通利华实验动物技术有限公司)分为6组，每组10只，分别进行如下处理:
[0100]第一组:单次注射实施例3制备的疫苗甲，每只雏鸡皮下注射0.1ml ；
[0101]第二组:单次注射实施例3制备的疫苗甲，每只雏鸡皮下注射0.2ml ；[0102]第三组:单次注射实施例3制备的疫苗甲，每只雏鸡皮下注射0.4ml ；
[0103]第四组:单次注射实施例3制备的疫苗乙，每只雏鸡皮下注射0.4ml ；
[0104]第五组:单次注射实施例3制备的对照品，每只雏鸡皮下注射0.4ml ；
[0105]第六组:单次注射生理盐水，每只雏鸡皮下注射0.1ml0
[0106]免疫后第14天，用AIV-SD株病毒液对雏鸡进行攻毒(注射雏鸡腿部肌肉)，每只雏
鸡的攻毒剂量为IO7EID5tl，之后再连续观察14天。攻毒后第14天统计攻毒保护数，结果见表1。
[0107]表1雏鸡疫苗的效力试验结果
[0108]
【权利要求】
1.Ml蛋白，为如下(a)或(b)或(C): (a)由序列表的序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)由序列表的序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (c)将(a)或(b)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且可以形成病毒样颗粒的由其衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述Ml蛋白的基因，所述基因优选为如下(I)或(2)或(3)或(4)所述的DNA分子: (1)序列表的序列2所不的DNA分子； (2)序列表的序列4所不的DNA分子； (3)在严格条件下与(I)或(2)限定的DNA序列杂交且编码可以形成病毒样颗粒的蛋白的DNA分子； (4)与(I)或(2)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且可以形成病毒样颗粒的蛋白的DNA分子。
3.权利要求1所述Ml蛋白形成的病毒样颗粒。
4.权利要求1所述Ml蛋白或权利要求4所述病毒样颗粒的应用，为如下(I)或(II)或(ΠΙ)或(IV):( I )作为功能蛋白片段的载体；(II)制备功能蛋白片段的载体；(III)作为细胞骨架；(IV)制备细胞骨架。.
5.具有权利要求1所述Ml蛋白和功能蛋白片段的融合蛋白。
6.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于:所述融合蛋白为如下(d)或(e)或(f): (d)由序列表的序列5自N端第I至267位氨基酸残基组成的蛋白质； Ce)由序列表的序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质； Cf)将(d)或(e)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且可以形成病毒样颗粒的由其衍生的蛋白质。
7.编码权利要求6所述融合蛋白的基因，所述基因优选为如下(5)或(6)或(7)或(8)所述的DNA分子: (5)序列表的序列6自5’末端第I至801位核苷酸所示的DNA分子； (6)序列表的序列6所示的DNA分子； (7 )在严格条件下与(5 )或(6 )限定的DNA序列杂交且编码可以形成病毒样颗粒的蛋白的DNA分子； (8)与(5)或(6)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且可以形成病毒样颗粒的蛋白的DNA分子。
8.权利要求5或6所述融合蛋白形成的病毒样颗粒。
9.权利要求5或6所述融合蛋白或权利要求8所述病毒样颗粒在制备疫苗中的应用。
10.一种疫苗，其活性成分为权利要求5或6所述融合蛋白或权利要求8所述病毒样颗粒。
【文档编号】A61P31/16GK103467581SQ201310384342
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年8月29日 优先权日:2013年8月26日
【发明者】刘文军, 范文辉, 李晶, 毕玉海, 杨利敏, 贾晓娟 申请人:中国科学院微生物研究所