海兔素在制备治疗胶质瘤的药物中的用途
【专利摘要】本发明公开了海兔素在制备治疗胶质瘤的药物中的用途。本发明研究海兔素对胶质瘤的抗瘤活性，本发明中经MTT实验发现，随海兔素浓度的增加，对C6细胞的抑制率升高，但80μg/ml以上浓度虽增加，对细胞抑制率却没有明显的增高，说明海兔素最有效的抑瘤浓度为80μg/ml；从作用时间效果看，48h为最佳作用时间，时间再延长，细胞抑制率却没有明显提升。动物实验发现，随海兔素剂量的增加，大鼠生存时间延长，胶质瘤重量减轻，淋巴细胞浸润增多，40mg/kg·bw为最佳作用剂量。本发明通过实验证明可将海兔素用作治疗胶质瘤的药物，而且海兔素属于天然海洋药物，毒副作用少，具有良好的市场应用前景。
【专利说明】海兔素在制备治疗胶质瘤的药物中的用途
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域，尤其涉及海兔素在制备治疗胶质瘤的药物中的用途。【背景技术】
[0002]胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，且颅内发病率最高，目前的治疗方法仍以手术治疗为主，辅以放疗及化疗等。但是手术难以切除干净，复发率、死亡率高，放疗化疗效果均不理想。虽然新的治疗方法如基因治疗、免疫治疗等也有应用，但都未获得突破性进展。目前的对症治疗手段都无法有效控制脑胶质瘤的发展，因此，寻找天然有效的化疗药物，延缓病程的进展，提高存活率，具有不可估量的临床应用价值和广阔的经济社会效益。
[0003]海兔素作为一种天然的海洋药物，它是一种海藻溴代倍半萜，它是从海洋三列凹顶藻中提取的脂溶性化合物，分子式为C15H19BrO,分子量小，仅为295。但是目前还没有关于海兔素在治疗胶质瘤方面的研究报道。
【发明内容】
[0004]本发明提供了海兔素在制备治疗胶质瘤的药物中的用途，利用本发明所述海兔素，可以很好地起到抗肿瘤作用，而且其具有天然活性，毒副作用少，具有广泛的应用前景。
[0005]为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现:
[0006]本发明提供了海兔素在制备治疗胶质瘤的药物中的用途。
[0007]进一步的，所述海兔素的最佳作用浓度为80 μ g/ml ο
[0008]进一步的，所述海兔素的最佳作用时间为48h。
[0009]进一步的，在20-80 μ g/ml浓度范围内，随着海兔素浓度的增加，细胞凋亡率明显增高。
[0010]进一步的，在20-80 μ g/ml浓度范围内，随着海兔素浓度的增加，处于GcZG1期细胞数增加。
[0011]进一步的，所述海兔素通过抑制Ras/Raf/ERK-MAPK通路，启动线粒体凋亡程序，促使C6细胞凋亡。
[0012]进一步的,在动物实验中,海兔素的最佳作用剂量为40mg/kg.bw。
[0013]与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是:本发明通过实验研究海兔素对胶质瘤的抗瘤活性，本发明中经MTT实验发现，随海兔素浓度的增加，对C6细胞的抑制率升高，但80 μ g/ml以上浓度虽增加，对细胞抑制率却没有明显的增高，说明海兔素最有效的抑瘤浓度为80 μ g/ml ；从作用时间效果看，48h为最佳作用时间，时间再延长，细胞抑制率却没有明显提升。动物实验发现，随海兔素剂量的增加，大鼠生存时间延长，胶质瘤重量减轻，⑶8+T淋巴细胞浸润增多,但剂量大于40mg/kg.bw时变化不再明显,说明40mg/kg.bw为最佳作用剂量。本发明还通过实验具体从Ras-Raf-MAPK细胞传导通路、PI3K-AKT通路及动物实验研究海兔素对胶质瘤的抑制作用。
[0014]本发明中海兔素是从海洋三列凹顶藻中提取的脂溶性化合物，具有天然活性，毒副作用少，本发明通过实验证明海兔素可以起到良好的抗肿瘤作用，可以用作治疗胶质瘤的药物，而且海兔素属于天然海洋药物，具有良好的市场应用前景。
[0015]结合附图阅读本发明的【具体实施方式】后，本发明的其他特点和优点将变得更加清
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是流式细胞仪分析海兔素影响C6胶质瘤细胞周期实验结果，其中图1A为对照组，图1B为20 μ g/ml海兔素实验组，图1C为40 μ g/ml海兔素实验组，图1D为80 μ g/ml海兔素实验组。
[0017]图2是流式细胞仪检测C6胶质瘤细胞凋亡的实验结果，其中图2A为对照组，图2B为20 μ g/ml海兔素实验组，图2C为40 μ g/ml海兔素实验组，图2D为80 μ g/ml海兔素实验组。
[0018]图3是Western blot检测C6胶质瘤细胞信号传导通路中相关蛋白表达变化的实验结果，其中图3A为对照组，图3B为80 μ g/ml海兔素实验组。
[0019]图4是各组大鼠的生存曲线，图4A为20mg/kg.bw海兔素组大鼠生存曲线，图4B为40mg/kg.bw海兔素组大鼠生存曲线，图4C为80mg/kg.bw海兔素组大鼠生存曲线，control为对照组大鼠生存曲线。
[0020]图5是大鼠胶质瘤细胞HE染色。
[0021]图6是免疫组化显示各组大鼠胶质瘤⑶8+T淋巴细胞浸润情况，其中图6A为对照组，图6B为20mg/kg *bw海兔素实验组，图6C为40mg/kg *bw海兔素实验组，图6D为80mg/kg.bw海兔素实验组。
【具体实施方式】
[0022]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
[0023]实施例1
[0024]本发明所用实验材料如下:C6胶质瘤细胞系购自中国科学院上海细胞生物学研究所；DMEM培养基购自美国GIBCO BRL公司；胰蛋白酶购自美国Sigma公司；EGFR、COX-2、Bcl-2、Bax、ERK、PI3K单克隆抗体购自美国Cell Signaling公司；小鼠抗大鼠CD8Mcab(Serotec)。
[0025]一、海兔素的制备
[0026]本发明从三列凹顶藻中提取海兔素(也可以从含有海兔素的海洋藻类中提取)，所述三列凹顶藻(Laurencia tristicha Tseng, Chang, E.Z.et.B.M.Xia)属红藻门(Rhodophyta)红藻纲(Rhodophyceae),仙菜目(Ceramiales),仙菜科(Cermiaceae),凹顶藻属(Laurencia)。三列凹顶藻由中国科学院海洋研究所提供并鉴定。
[0027]海兔素制备方法:将常温风干的所述三列凹顶藻样品(5kg)，用体积分数为0.95的乙醇室温下浸泡3d，提取3次，提取液经减压浓缩(温度低于40°C)得到乙醇提取物325g ;然后将所述乙醇提取物悬浮于蒸馏水中，用乙酸乙酯萃取，有机相回收溶剂得到萃取物105g。取所述乙酸乙酯萃取物，干法上样，进行正相硅胶柱色谱分离，用石油醚丙酮梯度洗脱，薄层色谱检查，合并相同部分。洗脱液经过反复正相硅胶、生物胶Bio-beads、凝胶Sephadex LH-20柱色谱和反相HPLC分离纯化，得到一白色化合物，经IR、13C_NMR及1H-NMR鉴定此化合物为溴代倍半萜海兔素单体(Aplysin)，分子式为C15H19BrO,分子量为295。
[0028]提取到的海兔素的特征如下:
[0029]海兔素=C15H19BrO ;无色针晶(石油醚)，mp96-98°C ;
[0030]IR vKBrmax cm-1:2952, 2864, 1577, 1487 , 1460 , 1375 , 1308 , 1267 , 1234,1192，1007，904，881862 ;EI_MS m/z (%): 296 [M (81Br) ]+ (100)，294 [M (79Br) ]+ (100)，281 [M (81Br) -CH3]+ (95)，279 [M (79Br) -CH3]+ (95)，239 (45)，237 (45)，200 [Μ—Br]+ (35)，160(16)，115(12)，109(10) ,69(5)；
[0031]1H-匪R(CD3OTCD3, 500MHz) δ:1.06 (3H, d, J=6.5Hz, H_9)，1.04 -1.08(1H,m, H-2a)，1.27 (3H, s, H_10)，1.33 (3H, s, H_12)，1.60 -1.68 (2H, m, H_2b，la)，1.81 -1.86 (2H, m, H_lb，3)，2.26 (3H, s, H-ll)，6.60 (1H, s, H_5)，7.2(1H, s, H_8)；13C-NMR (CD3COCD3, 125MHz) δ:43.0 (C-1) ,31.9 (C_2)，46.6 (C_3)，100.4 (C_3a)，159.4(C-4a)，110.5 (C_5)，137.5 (C_6)，114.3 (C_7)，127.3 (C_8)，137.4(C_8a)，55.1 (C-8b), 13.3 (C_9)，23.1 (C-1O)，23.4 (C_l I)，20.1 (C—12)。
[0032]上述数据与现有技术中文献报道的海兔素一致，因此确定提取到的化合物为海兔素aplysin。结构式如下:
[0033]
【权利要求】
1.海兔素在制备治疗胶质瘤的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的海兔素在制备治疗胶质瘤的药物中的用途，其特征在于:所述海兔素的最佳作用浓度为80 Pg/ml。
3.根据权利要求1或2所述的海兔素在制备治疗胶质瘤的药物中的用途，其特征在于:所述海兔素的最佳作用时间为48h。
4.根据权利要求1所述的海兔素在制备治疗胶质瘤的药物中的用途，其特征在于:在20-80 μ g/ml浓度范围内，随着海兔素浓度的增加，细胞凋亡率明显增高。
5.根据权利要求1或4所述的海兔素在制备治疗胶质瘤的药物中的用途，其特征在于:在20-80 μ g/ml浓度范围内，随着海兔素浓度的增加，处于G0/G1期细胞数增加。
6.根据权利要求1所述的海兔素在制备治疗胶质瘤的药物中的用途，其特征在于:所述海兔素通过抑制Ras/ Raf/ERK-MAPK通路，启动线粒体凋亡程序，促使C6细胞凋亡。
7.根据权利要求1所述的海兔素在制备治疗胶质瘤的药物中的用途，其特征在于:在动物实验中，海 兔素的最佳作用剂量为40 mg/kg*bw0
【文档编号】A61P35/00GK103446083SQ201310382603
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月27日 优先权日:2013年8月27日
【发明者】宫安静, 梁惠, 窦梅, 贺娟 申请人:青岛大学医学院附属医院