基于微囊化化学试剂延时产生一氧化氮的系统和方法

基于微囊化化学试剂延时产生一氧化氮的系统和方法
【专利摘要】本发明公开了一种通过微囊化的水溶性化学试剂在聚合物基质中的反应、长时间持续产生和应用治疗性一氧化氮气体的组合物和方法，所述组合物包含由两种或更多种亚毫米尺度的分别微囊化的试剂颗粒组成的混合物，包括至少一种微囊化的亚硝酸盐颗粒、至少一种微囊化的酸颗粒和至少一种微囊化的还原剂颗粒，所述分别微囊化的试剂在通过添加足够体积的水溶液来初期湿润这些亚毫米尺度的颗粒时缓慢释放，呈现足够的量来反应而产生一氧化氮。所述微囊化试剂可以应用于水凝胶中，也可以直接或者通过医疗器械（比如治疗性的敷料或绷带）应用于治疗部位。在另一些应用中，这些微囊化的化学前体在有限体积内保持物理上彼此密切接近，利用同一体积内存在的有限量的溶剂提取并处理试剂以形成NO。
【专利说明】基于微囊化化学试剂延时产生一氧化氮的系统和方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于局部产生和应用一氧化氮的组合物和方法。
【背景技术】
[0002]在不限制本发明范围的情况下，它的背景可以被描述为有关一氧化氮在医学上的指征的应用，和局部延时产生和应用一氧化氮(NO)的组合物和方法。
[0003]NO的生物学重要性已被证实，见Lancaster JR, Proc Natl AcadSci(1996)91:8137-41;Ignarro et al， Proc Natl Acad Sci(1987)84:9265-69;reviewedin Bredt DS, J CellScience(2003) 115:9-15;reviewed in Murad F, N Engl JMed(2006) 355:2003-11。在哺乳动物中，NO在神经系统、免疫系统和心血管系统的很多生理过程中是一种内源性的生理调节物质。这些作用包括血管平滑肌松弛，导致动脉的血管舒张和血流增加。NO是一种神经递质，与神经元的活动和各种功能有关，从回避学习到男性和女性生殖器勃起(Kim et al., J.Nutritionl34 (2004) 2873S) ? NO也具有部分调节巨噬细胞对微生物和肿瘤细胞的细胞毒性作用。NO除了介导正常的生理功能外，还涉及感染性休克、高血压、中风和神经退行性疾病等不同的病理生理状态。
[0004]NO 以各种形式应用在药理学上。见 Butler and Feelisch, Circulation(2008) I17:2151-59。然而，必须注意的是，NO本身是高活性的，在空气中或在体内是化学不稳定的。因此，其药理应用几乎总是涉及其产生，通过不同的各种单独稳定的前体化合物的化学反应产生。有机和无机硝酸盐作为NO供体，如硝酸甘油和硝普钠，已长期用于纠正NO缺乏状态或调节许多组织的活动。局部应用NO可以帮助创伤和烧伤的伤口愈合、毛发生长、阳痿、以及在需要的地方导致血管扩张(例如，促进由于糖尿病或其它条件受损的患者外周血流量的流通和在孕期子宫颈的成熟)。局部高浓度的NO (例如眼睛、皮肤等)会产生耐受。史密斯等人介绍了被认为是有利于促进愈合的聚合物一氧化氮源(U.S.Pat.N0.5，519，020)。
`[0005]在局部应用的范围内，要求NO的剂量是低的、持久性的。NO作为一个强大的杀菌剂，对抗生素有抗药性的细菌是有效的。在抗菌和其它的局部应用中，需要延长NO与皮肤接触的时间。在抗菌应用中，NO有效治疗剂量是很少的，只有百万分之几(ppm)(见Ghaffariet al., Nitric Oxide Biology and Chemistryl4 (2006) 21-29)),但NO 的有效性取决于维持与皮肤接触的时间长短(Ormerod et al., BMCResearch Notes4 (2011) 458-465)。
[0006]Seitz 等的 U.S.Pat.N0.6，103，275 和一项专利申请(US Ser.N0.13/688，511，filedll-29-2012)公开了一种局部释放NO的技术，其公开内容通过引用包含于此。然而，这种技术提供局部产生NO持续不到一小时，因此需要一个可选的方法，以提供许多治疗性应用所需的长时间的NO皮肤接触的时间。

【发明内容】

[0007]本发明公开治疗上有效量的NO的局部药物应用的组合物、方法和医疗设备，NO是通过试剂反应产生的，其中的部分或全部试剂的初始状态是微囊化的。[0008]在一个实施方式中，微囊化试剂在胶状组合物(包含与微囊化试剂反应的试剂的溶液)中反应，缓慢地从微囊中释放。这个实施方式提供了一种延长时间的缓释NO。
[0009]在另一实施方式中，公开了两个或更多的微囊化的水溶性试剂，反应形成长时间的缓释NO的治疗剂。
[0010]目前公开的还有一个方法，在这个方法中含有水溶性试剂的微粒与一定量的水(这些水只能湿润微粒的表面)接触。这个方法是特别有用的，因为它大大延长了试剂的释放时间，超出了将只有一种类型的微囊浸溃在过量水中时所观察到的释放时间。反过来，与缓释的、基于直接释放的、来源于微囊化载体的单一治疗剂相比，这种方法延长了该治疗剂可用的时间。
[0011]在一个实施方式中，公开了一种产生延时释放治疗性一氧化氮的方法，包括提供了由两种或更多种亚毫米级微粒组成的混合物，其中每个类型的颗粒只包含一种微囊化试剂。该混合物包括至少一种微囊化的亚硝酸盐，至少一种微囊化的酸，至少一种微囊包封的还原剂，和激活体积(足够激活初期润湿微囊试剂颗粒)的水，其特征在于，所述激活体积的水，是添加到微囊化试剂中，延长时间的NO释放通过亚硝酸中间体来引发。在一个实施方式中，抗坏血酸同时作为酸和还原剂。
[0012]在某些实施方式中公开了在伤口敷料或绷带上提供亚毫米级尺度微囊化试剂的混合物。这个亚毫米级微囊化试剂可以在防潮的单位剂量的容器中密封，直至使用。当需要时，打开容器，使试剂给药到需要治疗的组织部位。该容器可以是伤口敷料或绷带，或者是可倒在或洒在组织上的干燥粉末试剂包。在一个实施方式中，配合给药说明，激活体积的无菌水和单位剂量的试剂一起提供。在某些实施方式中，提供了多个预测量的水，包括一个激活体积和一个或多个再激活体积，按照说明书在起始激活后间隔一定时间加入再激活体积的水。在一些实施方式中根据说明提供了套装形式的试剂和激活/再激活的水或水凝胶。
[0013]本发明中通过化学试剂的微囊化生成NO的方法是有用的，因为它公开了通过化学稳定的前体来长时间生产不稳定化合物(如NO)。多个微囊化试剂在干燥的环境中便利地储存，混合和彼此接触产生NO可以通过将少量的水添加到前体混合物从而简单地引发。可选的，这样的微囊化试剂的混合物可以被直接施加到伤口，其中伤口环境本身提供了足够量的水，导致治疗量的NO释放。一个更大的优势是，所用的试剂和水占据的体积相对较小，促进本发明结合到尺寸有限的物品上。这样的物品包括伤口敷料、绷带和其他体型薄的及同样体型小的医疗用品，如血管支架和其他支架、导尿管、心脏起搏器、除颤器、心脏辅助装置、人工瓣膜、电极、整形外科螺丝和销、和其他常规植入或插入体内的医疗物品。
[0014]在另一个实施方式中，微囊化亚硝酸盐与凝胶形态的激活试剂混合。凝胶减慢亚硝酸盐和激活试剂之间的相互作用，产生更高水平的溶解性NO，同时延长了 NO的释放。与将两种或更多种分别含有适当试剂的颗粒一起浸入到过量的水或水性液体中时所观察到的量相比，本实施方式所公开的材料和方法导致在超过几个小时的时间内NO产生量的增加。
【专利附图】

【附图说明】
[0015]图1A是一个实施方式中含有微囊化试剂的混合物(反应生成NO)的垫的剖视图。
[0016]图1B是一个包含保持微粒适当位置的内部组件的垫的剖视图。[0017]图1C是一个实施方式中吸收层包含微囊化试剂(反应产生NO)的垫的剖视图。
[0018]图2反映的是将含有亚硝酸钠与玉米蛋白(一种植物蛋白)的微囊化颗粒IOmg加入到如实施例1中所述的抗坏血酸的酸性溶液中时NO的释放情况。
[0019]图3反映的是实施例3中的amiN0-700探针和所用的微囊化粉末混合物的放置情况。
[0020]图4反映的是将乙基纤维素基质中含有抗坏血酸的微囊化颗粒IOmg与乙基纤维素基质中含有亚硝酸钠的微囊化颗粒IOmg进行混合，在实施例3中所描述的初期潮湿时，释放NO的情况。
[0021]图5反映的是将玉米蛋白基质中含有抗坏血酸的微囊化颗粒IOmg与玉米蛋白基质中含有亚硝酸钠的微囊化颗粒IOmg进行混合，在实施例4中所描述的、用200微升的水使之成为潮湿的糊状物时，释放NO的情况。在零(O)指定的时间，通过加入水到该混合物颗粒中，形成糊状物。
[0022]图6反映的是实施例5中的数据，即在第一组(圆圈)较低浓度的羟乙基纤维素和第二组(十字)较高浓度的乙基纤维素溶液中，加入实施例1中所用类型的亚硝酸钠微粒10毫克(IOmg)后所测量得到的一氧化氮的浓度。第一组和第二组的羟乙基纤维素的浓度分别为0.73g/100ml和2.18g/100ml。第一组和第二组测得的NO浓度的峰值分别是0.022微摩尔/升和0.324微摩尔/升。如两条曲线所示，在指定的时间零(O)时加入微囊化的亚硝酸钠。
[0023]详细说明
[0024]本发明公开了通过微囊化一氧化氮产生试剂来释放长效剂量的一氧化氮在局部应用中的方法、装置和试剂组合物。在一个实施方式中，微囊化载体是一种聚合物基质。所述试剂和基质一起置于亚毫米级的结构内(至少有一个尺度规格不到I毫米)。这种结构可以是微粒、纤维或薄膜。
[0025]本发明采用的药学上可接受产生NO的方式依赖于亚硝酸(HNO2)的化学性质。根据下面的反应式(I)可见，通过无机亚硝酸盐与酸(HA)反应产生亚硝酸。亚硝酸低温时在水溶液中是稳定的，但在室温下，它容易分解成NO和NO2，如反应式(2)所示。
[0026]在还原剂(如抗坏血酸，二羟基抗坏血酸(Asc (OH)2))的存在下，NO2很容易转化为NO，如下面的反应式(3)所示。
[0027]2HA+NaN02 — 2HN02+2NaA (I),
[0028]HA是一种有机酸
[0029]2HN02 — N0+N02+H20 (2),
[0030]亚硝酸分解，生成二氧化氮
[0031 ] N0+N02+H20+Asc (OH)2 — 2N0+2H20+Asc02 (3),
[0032]抗坏血酸反应，除去二氧化氮
[0033]本发明的一个实施方式中，微囊化的试剂与一个组分混合，该组分为延时产生一氧化氮的试剂的释放和反应提供了一个适当的环境。当微囊化材料与水(或水溶液)接触时，液体缓慢渗透微粒，随着时间的推移，产生NO的试剂被缓慢地释放出来，然后参加反应生成NO。
[0034]本发明的一个实施方式中，利用微囊化的亚硝酸盐和足够酸度的酸化水凝胶接触，转化亚硝酸盐为一氧化氮。优选的，在凝胶中包含还原剂，以帮助保持一氧化氮的生物活性。虽然无机酸如硼酸，也可能是合适的，但优选的酸化剂采用有机酸，如柠檬酸。其它酸化剂还可以包括乳酸、甘油酸、甲酸或那些在本【技术领域】的技术人员已知的其它的有机酸。也可以采用生物学上可接受的、有适当PKa值的无机酸(例如上述的硼酸)。酸化剂也可以是还原剂，如抗坏血酸(维生素C)或抗坏血酸衍生物。所述抗坏血酸衍生物包括但不限于3-0-乙基抗坏血酸以及其它3-烷基抗坏血酸、6-0-辛酰基-抗坏血酸、6-0-十二烷酰基-抗坏血酸、6-0-十四烷酰基-抗坏血酸、6-0-十八烷酰基-抗坏血酸和6-0-癸二酰-抗坏血酸。优选的还原剂具有防止或减慢一氧化氮氧化为二氧化氮的还原能力，并且还具有直接还原NO2为NO的能力，从而使由该组合物中释放的气体主要是NO。优选的还原剂包括抗坏血酸、抗坏血酸衍生物、抗坏血酸的盐、生育酚，异抗坏血酸或α_生育酚。凝胶剂包括羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、明胶、琼脂、天然树胶、淀粉和果胶等物质。
[0035]溶解酸和还原剂的介质可以是水介质或非水介质。优选水介质，容易制备凝胶。酸凝胶组合物可另外含有一个或多个所使用的酸的共轭碱。虽然优选的碱是使用的酸的共轭碱，但也可以是那些本【技术领域】的技术人员已知的其它有机碱或无机碱。本发明的实施方式可直接应用于促进皮肤的循环、加快伤口愈合，在头皮上保持一段时间作为一种治疗以促进头发生长，并且可被应用在其它局部释放NO有益的位置。
[0036]本发明的一个实施方式公开了一种套装的酸化的凝胶和微囊化的亚硝酸盐。酸化的凝胶和微囊化的亚硝酸盐，都是单独包装在防潮包装中，在应用混合物前，打开包装，将它们的内容物立即混合在一起。在另一个可供选择的实施方式中，微囊化的亚硝酸盐和酸化剂被一起或单独包上防潮包装。在应用前，打开包装，用定量的水或中性PH的含水凝胶混合它们的内容物。
[0037]另一个实施方式，公开了两种或两种以上微粒的混合物，其中每个类型的微粒只包括一种微囊化试剂。该混合物中包含全部彼此反应产生NO的试剂。比如，在该混合物中，一种类型的颗粒包含亚硝酸钠，另一种类型的颗粒包含抗坏血酸，当它们在溶液中同时释放时反应产生NO。包含微囊化试剂的颗粒们在限定体积内保持相互接近，该限定体积内存在的限定量的水用来萃取和处理试剂，以产生医学上的治疗剂。
`[0038]限定量的水是指足够初期润湿干燥的微囊化的试剂颗粒从而允许试剂相互作用发生化学反应的水。初始润湿是指干燥的试剂颗粒加入液体后，这些液体足够润湿试剂颗粒，不存在多余的液体。
[0039]本发明的一个实施方式，公开了微囊化的亚硝酸盐、微囊化的酸和微囊化的还原剂。各种亚硝酸盐，最常见的无机亚硝酸盐如亚硝酸钠、亚硝酸钾、亚硝酸钙或任何的碱金属亚硝酸盐或碱土金属亚硝酸盐都是可用的。某些情况下选用还原剂从而具有防止或减慢一氧化氮氧化为二氧化氮的还原能力，并且还具有直接还原NO2为NO的能力，从而使由该组合物释放的气体主要是NO。合适的还原剂包括抗坏血酸、抗坏血酸盐、生育酚(特别是包括α-生育酚)、异抗坏血酸、类胡萝卜素、生育三烯酚和硫醇。
[0040]柠檬酸是一种可接受的有机酸。其它酸可包括乳酸、甘油酸、甲酸或其它本【技术领域】的技术人员已知的有机酸。也可以用有适当PKa值的、生物学上可接受的无机酸(例如硼酸)。一个实施方式公开了用抗坏血酸作为酸，此时抗坏血酸既作为有机酸也作还原剂。对于亚硝酸盐,抗坏血酸(维生素C)是一种生物相容性的还原剂。[0041]微囊的一种利记博彩app:将一种试剂的溶解液或聚合物溶液喷雾干燥，产生细小分散的单个微粒(内部包含分散在聚合物基质内的试剂)的粉末。也可以使用其它微囊的利记博彩app，如锅包衣、空气悬浮包衣、离心挤压、纤维纺丝、纤维挤压、喷嘴振动、离子型凝胶化、凝聚相分离、界面交联、原位聚合法和基质聚合。
[0042]为了适用于医疗适应征，本文公开的封装聚合物是生物相容的聚合物。适合的聚合物包括乙基纤维素、天然聚合物如玉米蛋白(一种在某些禾本科植物如玉米和谷物中发现的醇溶种子储存蛋白)、脱乙酰壳多糖、透明质酸、藻酸、可生物降解的聚酯、聚酐、聚乙烯(原酸酯)、聚磷腈或多糖(见 Park et al.，MoleculeslO (2005) 146-161 )。
[0043]上文所述的试剂微囊化的组合物用在药物试剂输送是众所周知的。见Shalabyand Jamiolkowskij US Pat.N0.4，130，639; Buchholz and Meduskij US Pat.N0.6，491，948。然而，在所有这些组合物中，微囊化的试剂是治疗剂本身，治疗剂不是通过微囊化的试剂的反应产生的。涉及一氧化氮加合物/供体的一氧化氮释放聚合物在医学文献中已有描述，例如Arnold, US Pat.N0.7，829，553 ( 二醇二氮烯翁碳基附着在疏水聚合物上);Knapp，USPat.N0.7，135，189 (亚硝基硫醇的前体和一氧化氮供体)。
[0044]本发明实施方式的应用包括直接应用微胶囊化试剂到伤口、伤口敷料、外科敷料、褥疮患者(或可能发展成患者)的床上护具、袜子、适合糖尿病和其它循环障碍患者的其他服装、骨科石膏，以及用于血管扩张剂在治疗性功能障碍时的NO局部递送。本发明还能满足与常规植入或插入身体的医疗用品(如血管支架、导管、心脏起搏器、除颤器、心脏辅助装置、人工阀、电极、以及骨科螺钉和引脚)相关的、对少量而持久的NO剂量的需要。
[0045]本发明可以是一个伤口敷料包或绷带包，所述伤口敷料的一部分包含由一种微囊化试剂的颗粒和另一种含微囊化试剂的颗粒组成的混合物。这部分敷料还结合了一种有保水性能的材料，以保持使颗粒处于潮湿环境时所需的适量的水分。润湿敷料启动试剂反应，敷料开始释放NO。敷料经过设计使得在伤口附近释放NO。
[0046]本发明的一个实施方式公开了一种多用途的、源于分层衬垫的延时释放NO技术。如图1A所示的横截面:两种或多种类型的微粒混合物I包含在层2和层3之间，其中层2和层3中至少一个是面向身体层以传输气态NO，同时至少一个是面朝外的层，这个面朝外的层具有不渗透或有保留水分性能(允许应用的液体传输到微粒里和/或维护微粒处于潮湿环境)。在希望衬垫的一侧提供NO的应用中，层2或层3的其中之一是不渗透NO的。在两种或多种的亚毫米级的微粒混合物中，每种的颗粒只包含一种微囊化试剂。在水溶液环境中，从颗粒转化形成的试剂相互结合产生NO。当水被引入到该衬垫时，试剂开始释放，NO开始产生。
[0047]在如图1B所示的实施方式方式中，，外层2和3被一个隔离层4所分离，层4用于维持外层之间距以及保持微粒层的适当位置。含有的试剂微粒可被嵌入或以其它方式固定在隔离层4上，或者外层2或3中任意一个的内表面上。
[0048]如图1所示类型的衬垫可以制备成任何指定的尺寸和形状。图1A-C中的垂直尺寸没有比例，吸水材料5可以比含有试剂的衬垫厚很多。
[0049]这样的衬垫有多种应用。它们可以通过放置于在伤口上并覆盖一个适宜的黏合医用胶带层而简单地使用。它们也可以纳入预先制成的绷带或敷料。可选的，绷带或敷料配有一个小包，小包含有反应生成NO的微囊化试剂。此外，试剂可以被附着至不同的材料层，然后组装在一起形成完整的绷带或敷料。
[0050]图1所示其它结构的衬垫可以作为长期持久的抗菌擦拭布。这种衬垫可以改编尺寸，插入到循环障碍患者的服装如袜子或紧身裤。通过对材料边缘和包含颗粒的衬垫结构进行合适处理，衬垫本身也可以作为循环障碍患者的袜子、手套和其它服装的织物。这些服装可以通过来自患者皮肤的自然水分激活或通过添加的水分激活。
[0051]本发明的另一个实施方式是图1C所示的层垫，所述垫层由上述含有微粒的衬垫、吸收层或渗透层5和位于它下面的不透水层6组成。这种吸收层垫适合于已经或正在开始发展成褥疮的患者。这类患者通过尿失禁和汗水，会产生适量的水分。水分将激活产生NO的衬垫，并且多余的水分会被衬垫下面的吸收层吸收。这样的安排将褥疮沐浴在NO中，一氧化氮刺激褥疮愈合，防止溃疡面积的进一步扩大。
[0052]在不同的应用中，小剂量的NO局部应用到阴茎从而快速刺激雄性大鼠阴茎勃起已被证明是非常有效的(Han et al., Journal of Sexual Medicine7 (2010) 224)。本发明公开了了用于人类的类似效果的NO的局部应用。目前性功能障碍的全身性药物有多种副作用，而且需要一段时间才能生效。就可控制性和没有预期的全身性副作用而言，这种速效、局部治疗的药物是非常需要的。产生NO的试剂可以被作为适于放置在勃起组织的敷料上的干燥涂层。一个实施方式是用作男用或女用避孕套的内部敷料。将应用到勃起组织的敷料润湿从而激活所述试剂，延时释放NO。
[0053]本发明的另一个实施方式，避孕套内表面涂有涂层，所述涂层包含由分别微囊化的试剂组成的混合物，当在水溶液中时，微囊化试剂相互反应产生NO。本实施方式的微粒尺寸范围可以是0. 01到100微米，优选范围为I一 10微米。较小的微粒尺寸有利于制备涂层时附着于避孕套内表面，NO释放的时间尺度为分钟，而不是小时。在采用这样的实施方式中，用户在戴上避孕套之前将一个含水化合物如K-Y胶状物(由McNEIL-PPC，Inc.，Ft.Washington, PA生产)应用到勃起组织上，。当微粒接触到含水化合物开始释放NO。释放的NO被限制在避孕套内直到其被勃起组织透皮吸收以刺激和延长勃起。
[0054]本发明的另一个实施方式，是一种性唤起的凝胶试剂套装，包含一种类似K-Y胶状物的含水凝胶化合物包装和一种含分别微囊化试剂混合物的防潮包装，所述试剂在在水溶液中一起反应产生NO。使用前，打开包装混合含水凝胶，应用于男性/女性使用者的外生殖器，刺激其血液流动，从而促进阴茎和阴蒂勃起。这种套装可用于治疗性功能障碍，和提高男性和女性的性生活满意度。
[0055]虽然没有人类的临床研究，但是对大鼠的研究表明，Seitz等(US Pat.N0.6，103，275)所描述的凝胶组合物能够刺激毛发生长。众所周知，局部血管扩张药如米诺地尔可有效缓解人类的脱发和刺激头发生长，因此持久的低剂量NO (NO是一种有效的血管舒张剂)的局部应用很可能对脱发有治疗效果。因此，在这里所公开了另一个延时释放的规划应用在于缓解脱发和刺激头发再生的设备和组合物。一个具体的实施方式是由如图1所示材料组成的头形状的帽子，用于治疗脱发。将帽子制作成适合于在病人头部的秃头区域应用，用水湿润来激活它。
【具体实施方式】
[0056]实施例1:从一种类型颗粒缓释的试剂范例[0057]通过喷雾干燥由亚硝酸钠、玉米醇溶蛋白和挥发性溶剂组成的溶液来制备以玉米醇溶蛋白为基质的含有10% (重量百分比)亚硝酸钠的微粒。玉米醇溶蛋白是从玉米中获得的富含脯氨酸的蛋白质，作为包衣和封装的基质可用于加工食品和药品。它由美国食品药物管理局(FDA)列为一般公认安全(GRAS)。该溶液为10%的玉米醇溶蛋白(FloChemicals, 29Puffer St., Ashburnham, MAO1430 (Lot F40000111C6))分散在由乙醇:水(90:10)组成的混合物中。将该溶液分散到使用旋转盘雾化器的干燥器中，以这种方式形成的微粒直径范围在10至100微米之间，这些微粒包含亚硝酸钠分散于其中的玉米醇溶蛋白基质。玉米醇溶蛋白是不溶于水的，当微粒暴露于水时，水慢慢地扩散到玉米醇溶蛋白基质中溶解亚硝酸钠，含有亚硝酸钠的溶液慢慢地从颗粒中扩散出来，从而产生了亚硝酸钠相当长一段时间的释放。
[0058]制备100毫升(100ml)的水溶液，其中含有5.6g柠檬酸、5.2g抗坏血酸和 0.3g 的 PE9010 (一种防腐剂，由 Schiiand Mayr 生产，30Two BridgesRoad Suite225, Fairfield, NJ07004, USA)。将 40 毫升(40ml)的该溶液放置于烧杯中，用配备amiN0-700探针的inNO-T的一氧化氮测量系统(InnovativeInstruments, Inc., Tampa, FL33637)检测溶液中的NO浓度。将10毫克(IOmg)包含玉米醇溶蛋白微囊化的亚硝酸钠的微粒，在指定的时间零时(O )加入到该溶液中，记录溶液中的NO含量，结果如图2所示。图2的曲线显示了在3小时的期间内，NO的产生在加入微粒后被引发，迅速上升到峰值，然后显著减少。约20分钟时，产生的NO从液体中形成，因此测量得到的一氧化氮轮廓线表征NO生产率，所述NO源于从微囊化颗粒中散发的亚硝酸钠和溶液中的酸按照前述反应式(I) - (3)所发生的反应。
[0059]实施例2:当微囊化试剂暴露于过量的水中时最小限度NO产生的范例
[0060]通过喷雾干燥由抗坏血酸、玉米醇溶蛋白和挥发性溶剂组成的溶液制备以玉米醇溶蛋白为基质的10% (重量百 分比)抗坏血酸的微粒。所述微粒的直径在10至100微米之间。将10毫克(IOmg)的抗坏血酸微粒与IOmg实施例1中所用的亚硝酸钠微粒混合。将该混合物加入到含有40毫升去离子水的烧杯中，继续搅拌。水中的NO含量采用与实施例1中使用的相同的装置监测。在三个小时的监测中，没有观察到可检测到的NO。
[0061]实施例3:当微囊化试剂初期润湿时NO长期生成的范例
[0062]通过喷雾干燥由亚硝酸钠、乙基纤维素和挥发性溶剂组成的溶液制备以乙基纤维素为基质的亚硝酸钠的颗粒(亚硝酸钠重量比10%)。该溶液是将12.5%的乙基纤维素(Ethocel Standard7from Dow Chemicals (LotU105013T01))分散于乙醇中制得的。将该溶液使用旋转盘雾化器分散到干燥器中。所得微粒的直径在10至100微米之间。此外，通过喷雾干燥由抗坏血酸、乙基纤维素和挥发性溶剂组成的溶液制备以乙基纤维素为基质的抗坏血酸的颗粒(抗坏血酸重量比10%)。该溶液是将12.5%的乙基纤维素(EthocelStandard7from Dow Chemicals (Lot U105013T01))分散于乙醇中制得的。将该溶液使用旋转盘雾化器分散到干燥器中。所得微粒的直径也在10至100微米之间。
[0063]将每种类型的10毫克微粒混合到一起，放置于一个有小褶皱的称量纸上。如图3所示，amino-700的探针针尖插入并完全由粉末混合物覆盖。用200微升(200 μ I)的去离子水湿润粉末混合物(在图4标记“I”的时间)，用纸吸收多余的水。这样微粒在处于初始湿润状态时，水主要驻留在微粒表面和微粒之间的狭窄间隙。接下来记录NO信号达5个半小时。如图4所示，在前半个小时内NO产量上升，在接下来的4个小时里慢慢地下降，在总时间为4个半小时后，NO信号突然地呈直线下降趋于零。信号中的下降是由于样品中的水全部蒸发。信号下降之后(在图4标记“2”的时间)，额外加入100微升(100 μ I)去离子水，信号再次升高，证实了这个结论。与实施例1中所观察到的相比，此NO释放的长效性的结果是令人惊奇的。
[0064]实施例4:在潮湿的糊剂中微囊化试剂NO长期生成的范例
[0065]在实施例1和实施例2中使用的每个微粒(即，玉米醇溶蛋白基质中含有10% (重量百分比)亚硝酸钠的微粒和玉米醇溶蛋白基质中含有10% (重量百分比)抗坏血酸的微粒)各10毫克(IOmg)混合到一起,置于一个小的塑料半圆柱体中。如图3所示,amino-700的探针针尖完全由粉末混合物覆盖，类似实施例3中使用的布置。用200微升的去离子水湿润混合物，达到一致的润湿糊剂状态，接下来记录NO信号8小时。
[0066]如图5所示的该记录,第一个小时NO产量缓慢上升,然后在接下来至少7个小时(在此时中断实验)内保持相对稳定。与实施例1的结果相比，此NO释放的恒定性和长效性的结果是令人惊奇的。
[0067]首先，值得注意的是，在实施例2 (其中没有观察到NO的释放)、实施例3和实施例4 (大量释放NO)之间，即使用于实验的试剂是相同重量的，测量的NO量却有显著的差异。这种差异是令人惊讶的，但不被理论所限制，至于为什么出现这种情况可以考虑几种可能性。在实施例2中的NO生产过程的环境，本质上与实施例3和4中的不同，而这些差异突出本发明的一些方面。
[0068]NO在空气和体内是不稳定的，作为治疗剂的使用要求单独稳定的前体通过化学反应产生NO。在实施例3和实施例4中，化学前体(例如试剂微囊化的微粒)的储层在有限的体积内保持彼此近距 离的物理接触，存在于同一体积内的有限量的溶剂用来提取和处理试剂以形成NO。如上所述的这些化学前体被微囊化，推动持续的长时间的释放NO。实施例2的特点是试图通过简单的将两个微囊化试剂引入到具有较大体积的水性药物制剂中，或简单地将它们引入血液和消化道，以产生延时释放剂量的NO。试剂从密封的载体中迅速释放，它们之间的相互反应速率显著减慢。此外，在如反应式(I) - (3)所示的生成NO的特定情况下，众所周知反应速率是PH敏感的，溶液pH值接近中性7时，反应速率降低为零。在实施例2中，降低溶液pH值的试剂只有从微囊载体中释放出的抗坏血酸。当抗坏血酸很稀时，它不能引起整个溶液的PH值降到一个允许反应以显著的速率继续产生NO的足够低的值。然而，在实施例3和4 (这是本发明的实施方式)的情况下，试剂被分配到彼此靠近的颗粒中，并且溶解该试剂的溶剂量是非常小的。因此，局部的试剂浓度高于实施例2几个数量级。产生NO的反应可以更迅速地进行，因为高的试剂浓度和使反应的pH值浓度大幅降低的高的局部抗坏血酸浓度，使得反应可以继续以更快的速率进行，在时间单位内产生更多的NO。
[0069]进一步令人惊讶的结果是，实施例1其中NO释放在3小时内大幅度减少)、实施例3 (其中NO释放持续约5小时)和实施例4 (NO释放持续相对恒定的水平至少8小时)在具有时间依赖性的NO释放方面对比显著。
[0070]在实施例1中，含有微囊化的亚硝酸钠颗粒被引入到包括柠檬酸和抗坏血酸的酸溶液中。引入这些颗粒后，溶液立即开始扩散到颗粒中，溶解封装的NaN02。其后，如反应式(O- (3)所示的产生NO的反应发生在颗粒本身内部，或者发生在溶解的NaNO2W颗粒中扩散到酸溶液中之后。这种情况下的特点是，通常应用的微囊化的、随时间释放活性成分的组合物中的活性成分是微囊化的，随后活性组分被引入到一个环境，在该环境中活性成分从微囊载体中释放，活性成分成为这种环境下的少量成分。一般情况下，随着微囊载体的微囊包封材料供应的减少，微囊化物质的释放速率随时间降低。图2展示了实施例1中时间依赖性的NO的产生情况，可以看出这种下降的特征。
[0071]在实施例1中，NO的产生基本上在3小时内显著下降，在实施例3和4中，NO的产生在至少7小时内持续在一个相当恒定的速率。这种差异是令人惊讶的，在某些不同的应用如伤口敷料中，该差异将是特别有用的。因为人们期望保持伤口沐浴在低浓度的NO中，以促进伤口愈合以及提供防止细菌的保护。不受限于理论，这种延时释放特性的有效改进的解释在于化学前体(例如微囊化的试剂微粒)储层的布置，这些化学前体在有限体积内保持物理上彼此密切接近，利用同一体积内存在的有限量的溶剂提取并处理试剂以形成NO。在此配置中，微囊化试剂提取和反应过程的动力学比实施例1所代表的微囊化试剂延迟时间释放的传统应用中的相应动力学更为复杂。在实施例3和4中，从亚毫米级微粒中提取微囊化试剂在极小量水时就可发生，因此在微粒表面的试剂浓度非常高。可能是这些局部升高的浓度，改变了试剂扩散出微粒的动力学，因为颗粒由内到外试剂浓度梯度较小减缓了扩散。
[0072]此外，由于高浓度的试剂存在，一种溶解的试剂扩散到另一种包含可与其反应的试剂的颗粒中将变得更为可能。在发生这种情况时，气态的NO可能在微粒内产生。在发生扩散的通道内产生气体可能减缓在这些通道中的液体扩散，而液体扩散对于将试剂从微囊化的颗粒中携带出来是必要的。因此，总NO产率可能会降低，因为少量的NO形成在颗粒内部
[0073]实施例5微囊化试剂在不同浓度的凝胶剂存在下长时间释放NO的范例
[0074]第一组较低粘度的凝胶形式的酸溶液制备如下:0.73克羟乙基纤维素(HEC)、5.6克柠檬酸、5.2克抗坏血酸和0.3克PE9010混合，添加水至100毫升。第二组较高粘度的凝胶形式的酸溶液制备如下:2.18克羟乙基纤维素(HEC)、5.6克柠檬酸、5.2克抗坏血酸和
`0.3克PE9010混合，添加水至100毫升。这些溶液与实施例1中使用的溶液之间的唯一区别是存在的HEC凝胶，HEC是一种来源于纤维素的水溶性聚合物。在这个实施例中使用的HEC平均分子量750000，当与HEC混合后，溶液变成高粘度的凝胶。用HEC制备的两种溶液与实施例1中使用的溶液相比，粘性增强。两个凝胶溶液用实验室的搅拌装置可以很容易的搅拌，但高HEC浓度的溶液粘性更大。
[0075]制备的第一组溶液25毫升(25ml)放置在烧杯中，连续不停地搅拌。用配置amiN0-700探针的inN0_T —氧化氮测量系统检测溶液凝胶中的NO浓度。将实施例1中所使用的10毫克(IOmg)的NaNO2微粒，弓丨入到凝胶溶液中，记录凝胶溶液中的NO浓度3小时。当微粒被引入到凝胶溶液中，可以观察到微粒的周围生成小气泡。
[0076]制备的第二组溶液25毫升(25ml)放置在烧杯中，连续不停地搅拌。用配置amiN0-700探针的inN0_T —氧化氮测量系统检测溶液凝胶中的NO浓度。将实施例1中所使用的10毫克(IOmg)的NaNO2微粒，引入到凝胶溶液中，记录凝胶溶液中的NO浓度8小时。当微粒被引入到凝胶溶液中，与第一组相比，观察到的泡沫生成要少，泡沫产生的时间要短。[0077]图6所示是在第一组(圆圈)低粘度的溶液和第二组(十字)高粘度溶液中，分别引入实施例1中使用类型的的亚硝酸钠微粒10毫克(IOmg)后测得的NO浓度比较。较高浓度的HEC溶液释放NO的时间明显更长。第二组溶液(含有2.18g/100ml HEC)中的NO浓度达到的峰值超出第一组溶液一个数量级，大约在8小时衰减到其峰值的一半，而第一组溶液(含有0.73g/100ml HEC)的NO浓度大约在I小时衰减到其峰值的一半。差异是显著的。当HEC浓度较高时，初始微囊化试剂的化学反应释放的一氧化氮能更有效的转移到溶液中。
[0078]不受理论约束，要理解NO浓度在高浓度和低浓度的HEC凝胶剂之间的差异，有两种效果要考虑。这些效果是从微粒中移走NaNO2的动力学以及液体中形成的NO的转移。
[0079]从微粒中移走NaNO2的动力学，取决于水扩散到微粒中和含有溶解NaNO2的溶液扩散到微粒外的情况。微粒溶液的扩散流动在微粒内不规则地发生，为溶液流动提供通道。HEC是大的、水溶性分子聚合物，当它存在于溶液中，它显著地增加溶液的粘度，并抑制在微粒中通道内的溶液的扩散流动。因此，NaNO2W微粒中到溶液外的释放是大幅度放缓的。可以预见，颗粒内外扩散的减慢和预先用于微粒中的HEC的浓度成比例，而且这样的扩散减慢是与当颗粒被引入高HEC浓度的溶液后观察到的微粒四周形成气泡的数量减少相一致的。[0080]当富含NaNO2的溶液最终从微粒中扩散出来，NaNO2在酸性环境中迅速反应产生NO。NO相当缓慢地溶解到周围的溶液中，如果NO的产生率比较高，NO填充的气泡将形成于微粒的表面，当气泡变得足够大时，气泡会迁移到液体中。一旦气泡在液体中变得游离漂浮，它将前往液体的表面，破裂，把NO分散到液体上方的空气中。在气泡形成的过程和在液体的运输过程中，NO也溶解到液体中。如果气泡的形成过程是快速的，气泡驻留在微粒表面的时间很短，它们被迅速释放到液体中。如果气泡通过液体上升迅速，它们将有效地运输大部分NO逸出液体，这些NO是不会溶解的。
[0081]HEC减缓微粒中的NaNO2扩散(与HEC的浓度成比例)，因此，减缓了最初发生在微粒表面上的气泡的形成过程。反过来，较慢气泡的形成提供了气泡中的气态NO和液体之间一段较长时间的接触，增加了 NO溶解到液体中的部分。事实上，如果从微粒中释放的NO足够慢，NO的释放速率可能会等于或小于NO溶解在液体中的速率，没有游离的气泡被释放进入到液体中，所有的NO将被溶解。因此，由于较高浓度的HEC降低NO的生产速率，更大部分的NO将溶解于较高浓度的HEC溶液中。
[0082]另一个较高浓度的HEC溶液增加溶解NO量的因素是，因为较高浓度的HEC溶液比低浓度的HEC溶液的粘性凝胶的粘性高，如果NO气泡离开微粒的表面，成为游离的NO气泡，它们驻留在液体中的时间更长。这种游离NO气泡的缓慢运输，提供了额外的NO溶解在液体中的一个额外的机会。
[0083]在较高浓度的HEC中，上述动力学效果更显著。因此，在较高浓度的HEC溶液中，因为可减少NO的形成速率，以及随之而来地提高了 NO向液体中的转移，较高浓度的HEC溶液形成了一个非常显著高的NO浓度，而且长时间的保持NO的高浓度，如图6所示。
[0084]在此公开和要求权利保护的所有的组合物和/或方法，在目前的公开下可以不经过度的实验而制造和执行。虽然以优选实施例的形式描述了本发明的组合物和方法，对本领域技术人员显而易见的是，可以将变形应用于组合物和/或方法，以及本文所述方法的步骤或步骤的顺序，而不脱离本发明的概念、精神和范围。更具体地，显而易见地，化学和生理上相关的一些药物可以替代本文所述的药物而达到类似的结果。所有这些对本领域技术人员显而易见的替 代和改变都被认为是在所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念内。
【权利要求】
1.一种治疗性一氧化氮的延时释放系统，其包含由两种或更多种亚毫米尺度的分别微囊化的试剂颗粒组成的混合物，包括至少一种微囊化的亚硝酸盐颗粒、至少一种微囊化的酸颗粒和至少一种微囊化的还原剂颗粒，所述分别微囊化的试剂在通过添加足够体积的水溶液来初期湿润这些亚毫米尺度的颗粒时缓慢释放，呈现足够的量来反应而产生一氧化氮。
2.根据权利要求1所述的治疗性一氧化氮的延时释放系统，其特征在于，所述亚硝酸盐是亚硝酸钠、亚硝酸钾、亚硝酸钙、碱金属亚硝酸盐和碱土金属亚硝酸盐中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的治疗性一氧化氮的延时释放系统，其特征在于，所述酸是下列有机酸中的一种或多种:柠檬酸、乳酸、甘油酸、甲酸和抗坏血酸。
4.根据权利要求1所述的治疗性一氧化氮的延时释放系统，其特征在于，所述酸是硼酸。
5.根据权利要求1所述的治疗性一氧化氮的延时释放系统，其特征在于，所述还原剂是抗坏血酸、抗坏血酸衍生物、抗坏血酸盐、生育酚、异抗坏血酸、类胡萝卜素、生育三烯酚和硫醇中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的治疗性一氧化氮的延时释放系统，其特征在于，所述酸是柠檬酸，所述还原剂是抗坏血酸。
7.根据权利要求1所述的治疗性一氧化氮的延时释放系统，其特征在于，所述试剂被封装在下列一种或多种聚合物中:乙基纤维素、玉米醇溶蛋白、脱乙酰壳多糖、透明质酸、藻酸、可生物降解的聚酯、聚酐、聚乙烯(原酸酯)、聚磷腈和多糖。
8.根据权利要求1所述的治疗性一氧化氮的延时释放系统，其特征在于，所述微囊化的酸和微囊化的还原剂均为微囊化的抗坏血酸或微囊化的抗坏血酸衍生物。
9.根据权利要求1所述的治疗性一氧化氮的延时释放系统，其特征在于，所述混合物被布置在一个分层的衬垫中，分层衬垫含有由亚毫米级的微囊化试剂组成的混合物。
10.根据权利要求9所述的治疗性一氧化氮的延时释放系统，其特征在于，所述分层衬垫包括一个朝向外部的不渗透层、朝向身体的透水层和夹在中间的由亚毫米尺度的微囊化试剂组成的混合物层。
11.根据权利要求9所述的治疗性一氧化氮的延时释放系统，其特征在于，所述分层衬垫设置成适合于伤口敷料或绷带的尺寸。
12.根据权利要求9所述的治疗性一氧化氮的延时释放系统，其特征在于，所述分层衬垫的尺寸设置成适合于插入到袜子、手套、帽子和其他服装中或作为制作的袜子、手套、帽子和其他服装的一部分。
13.根据权利要求9所述的治疗性一氧化氮的延时释放系统，其特征在于，所述分层衬垫设置成适合于床垫的尺寸。
14.根据权利要求9所述的治疗性一氧化氮的延时释放系统，其特征在于，所述分层衬垫设置成适合于抗菌抹布的尺寸。
15.根据权利要求1-8任一权利要求所述的治疗性一氧化氮的延时释放系统，其特征在于，所述混合物被布置在避孕套中。
16.根据权利要求1-11中任一权利要求所述的治疗性一氧化氮的延时释放系统在促进伤口愈合方面的应用。
17.根据权利要求1-10和权利要求12中任一权利要求所述的治疗性一氧化氮的延时释放系统在促进脱发再生方面的应用。
18.根据权利要求1-10中任一权利要求所述的治疗性一氧化氮的延时释放系统在克服性功能障碍方面的应用。
19.一种提供延时释放的治疗性一氧化氮的方法，包括如下步骤: 将至少一种微囊化的亚硝酸盐、至少一种微囊化的酸和至少一种微囊化的还原剂混合，制得亚毫米级的微囊化试剂的混合物； 加入足够体积的用于激活的水溶液来初期润湿微囊化的试剂，通过亚硝酸中间体反应来引发NO的延时释放。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述微囊化的酸和微囊化的还原剂共同由微囊化的抗坏血酸和/或微囊化的抗坏血酸衍生物提供。
21.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，将所述微囊化的试剂置于伤口敷料或绷带上。
22.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，将所述微囊化的试剂置于床垫上。
23.根据权利要求19所述方法，其特征在于，将所述微囊化的试剂置于安全套内。
24.一种为患者提供延时释放的治疗性一氧化氮的成套用品，包括: 亚毫米级微囊化试剂的混合物，所述混合物包括至少一种微囊化的亚硝酸盐，至少一种微胶囊化的酸和至少一种微胶囊化的还原剂； 一个激活体积的水或水凝胶，足以与微囊化试剂混合； 所述微囊化的试剂通过添加水或水凝胶而缓慢释放，和水或水凝胶呈现足够的量来通过亚硝酸中间体反应而生成一氧化氮。
25.根据权利要求24所述的成套用品，其特征在于，所述微囊化的酸和微囊化的还原剂共同由微囊化的抗坏血酸和/或微囊化的抗坏血酸衍生物提供。
26.根据权利要求24或25所述的成套用品，其特征在于，所述微囊化试剂置于伤口敷料或绷带上，所述一个激活体积的水或水凝胶置于一个预先测量好的容器中。
27.根据权利要求24或25所述的成套用品，其特征在于，还包括说明书，指导患者将所述亚毫米尺度的微囊化试剂混合物应用于患处，并添加激活体积的水或水凝胶于试剂。
28.根据权利要求27所述的成套用品，其特征在于，所述说明书还指导患者在试剂变干燥时加入再激活体积的水或水凝胶于试剂。
29.根据权利要求24或25所述的成套用品，其特征在于，还包括至少一个再激活体积的、置于预先测量好的容器内的水或水凝胶。
【文档编号】A61P17/02GK103690490SQ201310356220
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年8月15日 优先权日:2012年8月23日
【发明者】陈振兴, 费里德·穆拉德, 肯尼斯·史密斯, 威廉·赛茨, 威廉·梅尔, 安里克斯安德鲁·巴拉班 申请人:台湾尼奥克斯生物科技股份有限公司