趋化因子ccl20及其基因的应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及生物技术和医药领域，揭示了骨桥蛋白与趋化因子CCL20及毒性弥漫性甲状腺肿的关系，将趋化因子CCL20及基因和mRNA应用于制备或筛选治疗毒性弥漫性甲状腺肿（Grave’s甲亢）的药物、制备毒性弥漫性甲状腺肿诊断试剂及制备或筛选调控骨桥蛋白的药物。
【专利说明】趋化因子CCL20及其基因的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术和医药领域，具体为趋化因子CCL20及其基因的应用.【背景技术】
[0002]Graves’病甲允(Graves’ disease,⑶)又称毒性弥漫性甲状腺肿，是一种常见的抗体介导的器官特异性自身免疫性内分泌疾病，主要是由于体内存在促甲状腺激素受^ I thyrotropic-stimulating hormone receptor, TSHR)的自身抗体 Cthyrotrophinreceptor antibody, TRAb)，与甲状腺细胞膜上的TSHR结合，过度刺激TSHR而引起甲状腺机能亢进及弥漫性甲状腺肿。目前全世界对于Graves’病甲亢的治疗仍以药物为主，但是ATD的高复发率以及疗程太长，给患者带来诸多的不便。因此Graves’病甲亢要改善治疗方法、缩短疗程，就必须深入研究Graves’病甲亢引起TRAb产生的致病机制。
[0003]目前Graves’病的发病机制仍不完全明确，虽然遗传因素及环境因素在Graves’病发病过程中发挥着重要作用，然而与Graves’病的发病最直接、最核心仍然是免疫因素。近年来丙肝患者经IFN-a治疗后，部分患者诱发了自身免疫性甲状腺疾病，因此干扰素与甲状腺疾病间的关系受到重视。
[0004]体外试验树突状细胞DC主要通过分泌I型干扰素IFN- a对初始T细胞具有更明显的诱导分化功能和干扰Treg细胞正常免疫抑制功能，使其更容易发展为凋亡，Treg细胞数明显下降。进ー步研究IFNa对甲状腺细胞的影响，用重组人干扰素刺激原代培养的甲状腺细胞时，干扰素能够刺激⑶的甲状腺细胞高表达MHC-1I分子(HLA-DR3和HLA-DR5)，TSHR，和干扰素受体本身，使得甲状腺滤泡细胞本身转分化，把増加了的TSHR呈递给活化的T、B淋巴细胞，最后产生针对TSHR (促甲状腺激素TSH受体)的抗体TRAb (促甲状腺素受体抗体)，最终导致Graves’病的产生。
`[0005]骨桥蛋白(OPN) 1980年首次被报道，是ー种分泌型磷酸化糖蛋白，可经过磷酸化、糖基化、凝血酶剪切修饰发挥不同的生物效应，通过与细胞表面的OPN受体相互作用发挥细胞信号转导。OPN是ー种具有趋化、促炎因子分泌和整合素性能的胞外基质蛋白，与多种自身免疫性疾病发病相关，如多发性硬化(MS)、类风湿关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、克隆恩病、自身免疫性肝炎等，成为近年来研究的热点。前期工作也发现GD患者外周血中OPN明显升高，且与血清中的IFN a、IFN Y、TRAb存在线性正相关关系。
[0006]CCL20是近年来发现的ー种cc亚族的趋化因子，又称为巨噬细胞炎症蛋白3a(MIP-3a)、肝脏活化调节趋化因子(LARC)，其功能是，经与配体CCR6的作用直接參与了树突状细胞、T细胞的定向迁移，并在肿瘤免疫、自身免疫病等方面发挥作用。
【发明内容】
[0007]本发明g在提供趋化因子CCL20及基因和mRNA在制备或筛选治疗毒性弥漫性甲状腺肿(Grave’ s甲亢)的药物中的应用。
[0008]本发明还提供了 CCL20在制备毒性弥漫性甲状腺肿诊断试剂中的应用。[0009]本发明还提供了 CCL20在制备或筛选调控骨桥蛋白的药物中的应用。
[0010]通过分析检测发现，CCL20在u⑶患者(初发⑶患者)血浆中表达升高，而在e⑶(甲功正常的⑶患者)和n⑶患者(TRAb转阴的⑶患者)血浆中下降。此外，CCL20水平与⑶诊断相关的多项临床指标存在明显的相关性。因此CCL20可能成为⑶诊断、监测和⑶病情发生与发展、检测复发的新的分子标志物。
[0011]此外，血浆CCL20水平与血浆OPN存在明显的正相关关系。并发现初发⑶患者血浆在体外实验中可以诱导⑶4+T细胞表达CCL20，并且这ー过程可以被OPN抗体阻断，这说明说明⑶患者血浆中发挥激活作用的是0PN。因此我们进ー步体外实验用人重组OPN论证了这ー观点，结果发现OPN作用于⑶4+T表面的P 3受体通过NF- K B和MAPK信号通路的激活诱导CCL20的表达，并且这ー效应部分是通过炎症因子IL-17介导的。初发GD患者来源的血浆诱导⑶4+T细胞表达CCL20，并且这ー过程可以被OPN抗体阻断。
[0012]因此，本发明掲示了 CCL20与骨桥蛋白OPN及毒性弥漫性甲状腺肿之间的联系，提供了 CCL20作为分子标志物和靶点在制备药物及诊断试剂中的应用，可用于诊断治疗毒性弥漫性甲状腺肿，或者作为标志物和靶点制备筛选调控OPN的药物，为开发药物提供了新的思路。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1的A和B为⑶组与正常对照组血浆CCL20水平及⑶4+T细胞中CCL20mRNA的表达水平，图1C为用甲状腺素T3处理外周血单个核细胞诱导CCL20和OPN表达。
[0014]图2为⑶组与正常对照组血浆OPN水平。
[0015]图3为⑶组血浆OPN与CCL20相关性分析。
[0016]图4为⑶治疗过程中各阶段`及正常对照组血清OPN水平。
[0017]图5为血浆OPN诱导CD4+T细胞表达CCL20。
[0018]图6为rOPN以时间-浓度梯度依赖的模式诱导CCL20mRNA和蛋白的表达
[0019]图7为OPN受体P 3抗体阻断OPN诱导的CCL20基因的表达。
[0020]图8为OPN受体@ 3抗体阻断OPN诱导的CCL20的蛋白表达。
[0021]图9为IL-17抗体阻断OPN诱导的CCL20基因和蛋白的表达。
[0022]图10为IKK、p38、JNK和MEK-l/2抑制剂阻断0PN诱导的CCL20基因和蛋白的表达。
【具体实施方式】
[0023]实施例1
[0024]门诊筛选50名初发⑶患者(u⑶)、15名甲功正常的⑶患者(e⑶)、12名TRAb转阴的⑶患者(n⑶)及35名正常志愿者(MD)作为研究对象，收集临床资料及外周血标本。正常志愿者作为正常对照组。CD4+T细胞通过免疫磁珠阳性分选的方法从外周血单核细胞PBMCs中获取。分别通过qPCR和ELISA的方法检测CCL20、IL_17mRNA和蛋白水平的表达。
[0025]初发⑶的筛选标准:1)患者均为初发，未经过任何治疗；2)均符合⑶的诊断标准:有甲状腺功能亢进症的临床表现和体征，如怕热、多汗、食欲亢进、消痩、疲惫、无カ及心情易冲动、性情耐心、失眠、眼球突出、手舌哆嗦等；甲状腺超声显示甲状腺弥漫性肿大；实验室甲状腺功能检查:游离T3(FT3)、游离T4(FT4)升高、超敏促甲状腺激素(sTSH)水平降低，促甲状腺激素受体抗体TRAb阳性，和/或甲状腺同位素吸碘率升高。
[0026]治疗后甲功正常的⑶的筛选标准:初发⑶患者经过甲巯咪唑治疗1-3个月后甲功恢复到正常的水平但是TRAb仅轻微的降低。[0027]TRAb转阴的患者的筛选标准AD患者经规范的药物甲巯咪唑治疗1_2年后TRAb转阴，并连续停药超过3个月以上。
[0028]u⑶组的FT3、FT4、sTSH、TRAb, TPOAb, TGAb均显著高于正常组，差异有统计学意义(a P<0.001) ;u⑶组的FT3、FT4、sTSH均显著高于e⑶组，差异有统计学意义(blP〈0.01)，但两组之间的抗体TRAb、TPOAb, TGAb无显著差异(b2P > 0.05) ;u(?组的FT3、FT4、sTSH、TRAb, TPOAb, TGAb均显著高于n⑶组，差异有统计学意义(。P<0.001)。
[0029]表1⑶患者组与正常对照组临床资料
[0030]
【权利要求】
1.趋化因子CCL20用于制备和筛选治疗毒性弥漫性甲状腺肿的药物。
2.趋化因子CCL20的基因用于制备和筛选治疗毒性弥漫性甲状腺肿的药物。
3.趋化因子CCL20的mRNA用于制备和筛选治疗毒性弥漫性甲状腺肿的药物。
4.趋化因子CCL20用于制备检测毒性弥漫性甲状腺肿的诊断试剂。
5.趋化因子CCL20用于制备检测毒性弥漫性甲状腺肿初发或复发的诊断试剂。
6.趋化因子CCL20的mRNA用于制备检测毒性弥漫性甲状腺肿初发或复发的诊断试剂。
7.趋化因子CCL20用于制备和筛选`调控骨桥蛋白的药物。
【文档编号】A61K49/00GK103495183SQ201310300962
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年7月17日 优先权日:2013年7月17日
【发明者】宁光, 李晓丽, 王曙 申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院