白鲜碱在制备抗白色念珠菌药物中的应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了白鲜碱在制备抗白色念珠菌药物中的应用，并且研究发现，白鲜碱对白色念珠菌的最小抑菌浓度为312.5μg/ml，使用体积分数≦4%Tween-80作为增溶剂。本发明的优点在于：本发明首次发现了白鲜碱抑制体外悬浮白色念珠菌的活性，且证实白鲜碱具有抗白色念珠菌生物膜潜能，是一味值得研究开发的抗真菌药物。
【专利说明】白鲜碱在制备抗白色念珠菌药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药领域，更具体的讲，涉及白鲜碱在制备抗白色念珠菌药物中的应 用。
【背景技术】
[0002] 念珠菌是一种常见条件致病菌。白色念珠菌是致病力最强的念珠菌中之一，也是 引起人类念珠菌病的主要病原体。口腔是白色念珠菌最常见的定殖部位。目前，白色念珠 菌所引起的口腔念珠菌感染已经是关乎人类健康的一个重要问题。口腔白色念珠菌感染常 见于免疫缺陷宿主，包括HIV阳性以及艾滋病人，接受器官移植的病人，化疗病人等。由于 广谱抗生素的滥用，免疫抑制剂、糖皮质激素在临床上的广泛应用，恶性肿瘤发病率升高， 加之目前我国艾滋病疫情处于快速上升期，口腔白色念珠菌感染的病例急剧上升。与口腔 黏膜病有关的白色念珠菌感染主要包括口腔念珠菌病、口腔扁平苔鲜、白斑等。白色念珠菌 作为口腔黏膜多种感染的致病因子的作用已得到肯定。白色念珠菌感染会使口腔黏膜许多 原有疾病的病情加重，例如口腔黏膜癌前病变因有白念的反复感染而增加了癌变几率，其 中国际公认的口腔癌前病变白斑，伴有念珠菌感染者，其癌变倾向较大。最新的研究显示， 白色念珠菌在4-NQ0诱导的大鼠口腔肿瘤模型中对黏膜增生起到了关键的促进作用。由于 口腔白色念珠菌常以生物膜形态存在，使得白色念珠菌的致病性和耐药性明显增加。因此， 如何有效控制口腔白色念珠菌感染成为临床上颇为棘手而又亟需解决的重要问题。
[0003] 目前临床常用的抗真菌药物有多烯类（如两性霉素 B)，唑类（如氟康唑、伊曲康 唑）以及嘧啶类（如5-FC)等。它们主要是通过影响真菌细胞膜麦角固醇的合成，以及损 害细胞膜脂质结构和功能，最终导致真菌死亡。目前，通过抗真菌药物的药物敏感性实验， 选择合适的抗真菌药物越来越受到重视。药物敏感性实验方法很多，如微量稀释法、纸片扩 散法、E-TEST法等。1982年，美国国家临床实验标准化委员会（NCCLS)成立了真菌药敏试 验分会，以期建立一个标准化药敏实验方案。目前国内外多采用NCCLS的M27方案为酵母 菌的标准化药敏实验方法。由于有效的抗真菌药物品种很有限，而目前临床应用的抗真菌 药物从高效低毒、抗菌谱和耐药性方面评价尚不能令人满意。具有两千多年用药历史和完 整理论体系的中医药，为新药的发现提供了一条有效捷径。因此，从祖国传统医学宝藏中挖 掘具有抗真菌潜力，并且毒副作用低的新药是一个非常重要的研究方向。
[0004] 来源于古方的五白汤已在临床上用于口腔白色念珠菌感染病例，前期研究应用五 白汤治疗口腔黏膜糜烂病例取得满意效果，尤其是对伴白色念珠菌感染病例，其疗效与氟 康唑相似，且无明显毒副作用。但是尚不明确五白汤抗白色念珠菌究竟是复方中的哪些药 物起主导作用，是否可用中药简单成分替代原药,形成成分处方，以提高药效和向中药制剂 的标准化推进？
[0005] 白鲜皮为云香科植物白鲜（Dictamnus dasycarpus Turcz)和狭叶白鲜 (Dictamnus angustifolius G.Don)的干燥根皮，具有清热燥湿、祛风解毒的功效，主治皮 肤瘙痒，风疹，湿疹，疥癣，黄疸，风湿痹痛，筋骨痿弱，小儿惊厥。白鲜皮主要化学成分为生 物碱，而白鲜碱为其重要活性成分，同时也为其较特征性成分。中医药指纹图谱研究表明， 不同产地的白鲜皮药材中均含有白鲜碱，而且是其含量较高的主要成分。本发明选择白鲜 皮的有效成分白鲜碱，研究其抗白色念珠菌活性。
[0006] 白鲜碱（dictamnine)，又称白鲜胺，分子式为C15H1()0 5，分子量为270. 24,属呋喃喹 啉类生物碱，无色棒状结晶，熔点：129--131°C。既往有文献(李福凤，李果刚，吴友忠， 等·小儿哮喘花剥苔产生的免疫机制研究[JL中西医结合学报，2005, 3(6) :446-449)报 道，白鲜碱可有效抑制有些植物致病真菌孢子的萌发。叶笑味等(地图舌儿童血清锌铜测 定的意义[J].浙江预防医学，2006, 18(8) :54-54)报道了白鲜皮多种二甲氯提取物中，白 鲜碱是最有效的抑制植物致病真菌--黄瓜黑星病菌的化合物。李伏虎等(微量元素锌等 与幼儿地图舌的关系[J].浙江临床医学，2006)最新的研究显示，从中药两面针根部提取 的白鲜碱对稻瘟病菌这一植物致病真菌有明确的抑制作用。Muzyka BC等（Prevalence of HIV-land oral lesions in pregnant women in rural Malawi[J]. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2001Jul, 92(1) :56-61)的研究发现了白鲜碱对模式真 菌啤酒酵母的抗菌活性。目前国内外尚无关于白鲜碱对白色念珠菌抑制作用的报道。关于 白鲜碱抗真菌作用的机制，国内外亦有研究。已有研究应用激光扫描共聚焦显微镜观察方 法，并作细胞扫描图像分析，定量描述细胞形状、面积和DNA，RNA含量，认为白鲜碱直接或 间接影响了真菌细胞遗传物质的正常合成，以致不能完成正常细胞周期，从而抑制真菌生 长甚至导致死亡。Pfyffer 等（Pfyffer GE，Towers GH. Photochemical interaction of dictamnine,a furoquinoline alkaloid, with fungal DNA[J]. Can J Microbiol,1982, 28 (5) :468-73)报道了白鲜碱对真菌DNA的作用，在近紫外光下引起丝状真菌的致死性损 伤，结果支持了以前其基于小牛胸腺DNA的体外实验结果，认为DNA是生物碱的体内光毒性 的主要作用靶点。而白鲜碱对白色念珠菌抑制作用的机制需要更进一步的研究加以探索。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供白鲜碱在制备抗白色念珠菌药物中的应用。
[0008] 为实现以上目的，本发明公开以下技术方案：白鲜碱在制备抗白色念珠菌药物中 的应用。
[0009] 作为一个优选方案，白鲜碱对白色念珠菌的最小抑菌浓度为312. 5 μ g/ml。
[0010] 作为又一个优选方案，使用体积分数兰4%Tween-80作为増溶剂。
[0011] 本发明的优点在于：本发明首次发现了白鲜碱抑制体外悬浮白色念珠菌的活性， 且证实白鲜碱具有抗白色念珠菌生物膜潜能，是一味值得研究开发的抗真菌药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1为Tween-80溶液对白色念珠菌菌悬液吸光度的影响。
[0013] 图2为Tween-80与DMS0的混合溶液对白色念珠菌菌悬液吸光度的影响。
[0014] 图3为白鲜碱以及氟康唑对白色念珠菌生物膜的影响。
[0015] 图4为白鲜碱对白色念珠菌生物膜吸光度的影响。 t〇〇16] 图5为氟康唑对白色念珠菌生物膜吸光度的影响。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无 特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途 径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0018] 实施例1. Tween-80对白色念珠菌体外生长的影响
[0019] 1材料与方法
[0020] 1. 1 材料
[0021] 1. 1. 1药物及试剂
[0022] Tween-80购自国药集团化学试剂有限公司，批号F20080324。
[0023] DMS0购自上海鼎国生物技术有限公司，Sigma分装，批号86C00150。
[0024] 氟康唑购自中国药品生物制品检定所，批号100314-200503。
[0025] 1. 1. 2试验菌株
[0026]国际标准菌株ATCC76615,由上海市口腔医学研究所口腔微生物实验室提供，经酵 母菌生化卡（Vitek,批号E23K)鉴定为白色念珠菌（Bionumber555017411)，见附录1。
[0027] 1. 1. 3 培养基
[0028] ①沙保劳氏琼脂(上海伊华医学科技有限公司，批号20080303) 63g，加氯霉素 50mg，蒸馈水1000ml，高压灭菌。
[0029] ②RPMI1640液体培养基：RPMI1640粉剂（GIBC0,批号1381654)(含谷氨酰胺， 不含碳酸氢钠）10. 4g，三氮吗啡啉丙磺酸34. 53g (SIGMA，批号018K0724)，蒸馏水900ml， 以lmol/1的NaOH调节pH至7. 0,加蒸馏水定容至1000ml，用Millipore滤过灭菌（滤膜 0. 22μπι)，置4°C冰箱备用。
[0030] 1. 1. 4主要仪器
[0031] 超净工作台（苏州YJ_875DA)、麦氏比浊管（biomerieux806814701)、紫外分光光 度仪（日本岛津UV-1601)。
[0032] 1. 2 方法
[0033] 参照NCCLS MW _ A2[8]推荐的肉汤常量稀释法酵母菌药敏性试验进行。
[0034] 1. 2. 1药物及标准品的制备
[0035] Tween-8〇经RPMI1Μ0液体培养基稀释后，配制成体积分数为8%的贮存液。 Tween-80与DMS0按体积4 :1的比例混合，经RPMI1M0液体培养基稀释后，配制成Tween-80 体积分数为8%，DMS0体积分数为2%的混合溶液贮存液。上述两种贮存液分别用Millipore 滤过灭菌（滤膜〇· 22 μ m)，分装后置-80°C冰箱贮存备用。
[0036] 氟康唑用无菌蒸馏水配制成1280 μ g/ml的贮存液，用Millipore滤过灭菌(滤膜 0. 22 μ m)，分装后置-80°C冰箱贮存备用。
[0037] 1. 2. 2菌悬液制备
[0038] 将白色念珠菌(ATCC76615)接种在沙堡氏琼脂培养基上，置35°C，传代培养。挑取 生长24小时的菌落，用0. 85%的无菌氯化钠水溶液制成菌悬液，经麦氏比浊管调整其浊度 达到〇· 5麦氏标准，相当于每毫升含1?5 X 106菌落形成单位（CFU/ml)，用RPMI1640液体 培养基1 :5〇稀释后再1 :20稀释（共稀释1000倍）至菌含量为1?5X103，CFU/ml (2倍 于终浓度)。
[0039] 1. 2· 3药物稀释及接种物接种
[0040] 取无菌试管（100mm)12支。排成一排，第2至12管内分别加入lmlRPMI1640液体 培养基。在第1管加入受试药物原液2ml，然后从第一管内吸取lml至第2管。混匀后再吸 取lml至第3管，如此连续倍比稀释至第10管。并从第1〇管中吸取lml弃去。第η管为 不含受试药物的生长对照，第12管为阴性对照。此时各管受试药物浓度依次为1倍、1/2倍、 1/4倍、1/8倍、1/16倍、1/32倍、1/64倍、1/128倍、1/256倍、1/512倍的受试药物原浓度。 然后在每管内加入制备好的菌悬液接种物各lml。使每管最终菌液浓度约为〇. 5X 103? 2. 5X103CFU/ml。第1管至第10管受试药物达到终浓度，此时各管受试药物浓度依次为 1/2 倍、1/4 倍、1/8 倍、1/16 倍、1/32 倍、1/64 倍、1/128 倍、1/256 倍、1/512、1/1024 倍受试 药物原浓度。Tween-8〇溶液的体积分数为4%?0· 0〇78丨25%。Tween-80与DMS0的混合溶 液中Tween-80的体积分数为4%?〇. 0078125%，DMS0的体积分数为1%?〇. 001953125%， Tween_8〇与DMS0保持4 :1的比例不变。
[0041] 1.2. 4培养及结果判定
[0042]将上述试验管置35°C培养48小时，观察白色念珠菌生长情况，读取结果。结果判 断的前提是生长对照良好，空白对照无菌生长清晰。判读标准如下：与生长对照管比较，对 试管内菌株生长情况进行评分，0分为肉眼观察清晰；1分为轻度模糊；2分为浊度显著降低 (约抑制 5〇%受试菌生长);3分为浊度轻度降低；4分为浊度不减低。并在紫外分光光度仪， 波长 55〇nm条件下测管内液体的吸光度。每种受试药物均重复三次实验，吸光度取平均值。 本实验以氟康唑作为阳性对照药物，参照NCCLS M27-A2[8]推荐的肉汤微量稀释法酵母菌药 敏性试验进行，其MIC值位于M2 7-A2规定的范围，则认为该次实验结果有效。
[0043] 2 结果
[0044] 35°C培养48小时后，肉眼观察各试管白色念珠菌（ATCC76615)生长情况。生长对 照管均生长良好，空白对照管无菌落生长清晰且阳性对照药物氟康唑MIC值位于M27-A2规 定的范围。分别加入Tween-80溶液及Tween-80与DMS0的混合溶液的试管与生长对照管 比较，其浊度不减低，均判定为4分。
[0045] 35 °C培养48小时后，紫外分光光度仪550nm波长条件下测定每一试管内液体吸光 度的均值见表1，吸光度的均值均为去除RPMI-1640液体培养基对吸光度影响后的数值。
[0046] 表lTween-80溶液及Tween-8〇与DMS0混合溶液处理后各试管内液体吸光度均值
[0047]
【权利要求】
1. 白鲜碱在制备抗白色念珠菌药物中的应用。
2. 根据权利要求1所述的白鲜碱在制备抗白色念珠菌药物中的应用，其特征在于，白 鲜碱对白色念珠菌的最小抑菌浓度为312. 5 μ g/ml。
3. 根据权利要求1所述的白鲜碱在制备抗白色念珠菌药物中的应用，其特征在于，使 用体积分数=4%TWeen-80作为增溶剂。
【文档编号】A61P1/02GK104248637SQ201310261421
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年6月26日 优先权日:2013年6月26日
【发明者】周曾同, 施琳俊 申请人:上海交通大学医学院附属第九人民医院