水黄皮素或水黄皮提取物在抗流感病毒药物中的应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了水黄皮总黄酮提取物或水黄皮素在制备用于治疗和/或抗流感病毒药物中的应用。所述水黄皮总黄酮提取物是从水黄皮茎枝和/或叶提取而得，总黄酮的含量为50％～70％重量；其中，含有水黄皮素；所述总黄酮的含量以水黄皮素为对照品，采用紫外分光光度法测定；水黄皮素的含量为5％～10％重量。
【专利说明】水黄皮素或水黄皮提取物在抗流感病毒药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药【技术领域】，具体涉及水黄皮总黄酮提取物或水黄皮素的应用。
【背景技术】
[0002] 流感病毒属正粘病毒科（Orthomyxoviridae),具有包膜的8个片段，共编码11种 蛋白质的单链负RNA病毒。流感病毒是引起流行性感冒的病原，分为甲、乙、丙三型，其中以 甲型流感对人类威胁最大。人流感病毒主要是HI、H2和H3亚型，其中以H1N1亚型病死率 最高，因此本发明主要以H1N1型流感病毒为研究对象对水黄皮总黄酮提取物和水黄皮素 的抗病毒活性进行研究。
[0003]目前，流感仍属未能有效控制的急性上呼吸道传染病，具有传染性高、传播迅速、 已发生流行等特点。由于流感病毒的抗原变异能力强，而疫苗只对己知的流感病毒亚型有 预防作用，而对于由抗原性漂移或抗原性转换所产生的新型流感病毒无效，因此，每隔几年 流感病毒就有一次较大范围的流行。据统计，全世界平均每年有50-100万人死于流感。由 此可见，流感作为一种病毒性传染病不仅严重威胁着公众健康，而且给国家和社会带来了 沉重的经济负担。虽然已知的流感病毒已经得到控制，但是，由于流感病毒的抗原变异能力 极强且相当频繁，疫苗的研制和生产相对滞后，对于易感人群的保护率不高，因此，新的流 感大流行随时都有可能爆发。在这种情形下，寻找具有预防和治疗作用的抗流感病毒药物 就显得尤为重要和紧迫。
[0004] 水黄皮Pongamia pinnata(L_ )Merr.为豆科（Leguminosae)水黄皮属的半红树植 物，别名水流豆。水黄皮属全世界仅有1种，广泛分布于印度、马来西亚及我国南部沿海。 在我国民间用其种子搾出的油治疗疥癞、脓疮及风湿。在印度，其种子和种子油用来治疗 白斑病、麻风病、风湿病，叶子用于治疗痔疮、肿瘤、伤口消炎等。现代药理研究表明，水黄 皮总黄酮提取物具有抑菌、抗炎、镇痛、抗疱疹病毒、抗溃疡等活性，但尚未见有抗流感病毒 的报道（黄欣碧，龙盛京.半红树植物水黄皮的化学成分和药理作用研究进展[j].中草 药，2004, 35(9) : 1073-1076.)。本发明经试验证明，水黄皮总黄酮提取物及水黄皮素对甲型 流感病毒感染的MDCK细胞具有很好的抗流感病毒作用；另外，在小鼠流感动物模型中同样 表现出了很好的抗流感病毒活性。这提示水黄皮总黄酮提取物及水黄皮素在治疗甲型流感 病毒感染性疾病领域具有很好的开发利用前景。 u
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是提供水黄皮总黄酮提取物或水黄皮素在治疗和/或预防流 感病毒药物中的应用，为临床上流感病毒性疾病的治疗提供一种安全有效的天然药物'。 [0006]本发明的技术方案为：
[0007] 水黄皮总黄酮提取物或水黄皮素在制备用于治疗和/或抗流感病毒药物中的应 用。
[0008] 进一步地，所述水黄皮总黄酮提取物是从水黄皮茎枝和/或叶提取而得，总黄_ 的含量为50 %?70 %重量；
[0009] 其中，含有水黄皮素；
[0010]所述总黄酮的含量以水黄皮素为对照品，采用紫外分光光度法测定；
[0011] 水黄皮素的含量为5%?10%重量。
[0012]本发明所述的f黄皮总黄酮提取物通过下述方法制备： _3] ⑴取水黄皮莲枝和/或叶，以50%?9〇%乙醇回流提取1?3次，每次提取1? 3小时，合并提取液；
[00M] (2)将步骤1所得提取液减压浓缩至无醇味，离心，取上清液；
[0015] (3)将步骤2所得的上清液通过聚酰胺层析柱分离，用水洗脱2?5个柱体积，再 用2〇?7〇%乙醇洗脱2?10个柱体积，收集乙醇洗脱液； _6]⑷浓缩、千燥乙醇洗脱液得到水黄皮总黄酮提取物。
[0017]进一步地，所述水黄皮总黄酮提取物的制备方法，包括以下步骤： _8] ⑴取水黄皮茎枝和/或叶，以80%乙醇回流提取2次，每次提取2小时，合并提取 液；
[0019] (2)将步骤1所得提取液减压浓缩至无醇味，离心，取上清液；
[0020] (3)将步骤2所得的上清液通过聚酰胺层析柱分离，用水洗脱3个柱体积，再用 50%乙醇洗脱5个柱体积，收集乙醇洗脱液；
[0021] (4)浓缩、干燥乙醇洗脱液得到水黄皮总黄酮提取物。
[0022]本发明所述水黄皮素具有如图4所示的HPLC色谱图，其中，色谱图的特征峰为：水 黄皮素保留时间：10. 8min ;
[0023]色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲 醇-0· 2%HAc(43:57);流速：lml/min ;检测波长：260nm。
[0024] 本发明所述水黄皮素是从水黄皮总黄酮提取物中提纯而得，包括以下步骤：
[0025] (1)通过反相硅胶层析柱分离，以30%?60%乙醇洗脱，得到水黄皮素粗品；
[0026] (2)用无水乙醇溶解步骤⑴所得的水黄皮素粗品，加水至乙醇浓度为5%?30%， 放置重结晶，即得。
[0027]优选的水黄皮素的制备方法，包括以下步骤：
[0028] ⑴通过反相硅胶层析柱分离，以40%乙醇洗脱，得到水黄皮素粗品；
[0029] (2)用无水乙醇溶解步骤（1)所得的水黄皮素粗品，加水至乙醇浓度为10%，放置 重结晶，即得。
[0030] 本发明的又一个目的是提供一种抗流感病毒的药物组合物，所述药物组合物含有 本发明所述的水黄皮素和/或水黄皮总黄酮提取物。
[0031] 进一步地，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1是水黄皮表的结构式。
[0033] 图2是利巴韦林的细胞毒性和对流感病毒的抑制作用图。
[0034]图3是水黄皮总黄酮提取物及水黄皮素的MDCK细胞毒性及对流感病毒H1N1的抑 制作用；
[0035] 其中，左图NEP009表示水黄皮总黄酮提取物，右图NEP014表示水黄皮素。
[0036]图4是水黄皮素的HPLC色谱图。
【具体实施方式】
[0037] 通过以下实施例可以进一步理解本发明的优点和特点，不应该理解为是对本发明 范围的限制。
[0038] 以下实施例中所用仪器和试剂，除特殊说明以外均为普通市售。
[0039] 【实施例1】水黄皮总黄酮提取物的制备及分析
[0040] 取水黄皮枝叶lKg，粉碎，加80%乙醇10L加热回流提取两次，每次提取2h，合并提 取液，用旋转蒸发仪减压浓缩至无醇味（浓缩至v/w?3?4)，离心，取上清液，加载到先 用乙醇洗去残留溶剂后以纯化水为初始溶剂的聚酰胺层析柱上（柱体积1L)，上样流速为 每小时1个柱体积；然后，先用纯化水洗脱3个柱体积，再用50%乙醇洗脱5个柱体积，洗脱 流速为每小时2个柱体积，收集50%乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，得到水黄皮总黄酮提取物 I3· 6g，以水黄皮素为对照品（制备方法如下文实施例2所述，纯度为99. 5%),在260nm波 长下，经紫外分光光度法测定提取物中总黄酮含量以水黄皮素计为53. 2% ;以高效液相色 谱法（色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-0. 2%HAc (43:57);流速： lml/min ;检测波长：260nm)测定总黄酮提取物中水黄皮素含量为13. 1%。
[0041] 【实施例2】水黄皮素的制备及含量分析
[0042] 取实施例1获得的水黄皮总黄酮提取物10g，加50mL乙醇加热溶解后，缓缓加 入水100mL，离心，取上清液加载到已用40%平衡好的反相硅胶层析柱上；以40%乙醇洗 脱，薄层色谱检视洗脱液，收集含水黄皮素的流份，减压千燥得到水黄皮素粗品2. 7g，将 水黄皮素粗品以无水乙醇溶解后，加水至乙醇浓度约为10%，放置，重结晶，得到水黄皮 素2. 3g，以高效液相色谱法（色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲 醇-0.2%HAc(43:57);流速：lml/min;检测波长 ：260mn)测定提取物中水黄皮素含量为 98· 2%。
[0043]【实施例3】水黄皮总黄酮提取物或水黄皮素的体外抗流感病毒作用 [0044] 毒株：甲型流感病毒（A/PR/8/34H1N1),购自中国典型微生物保藏中心。
[0045] 细胞模型：狗肾细胞系MDCK，购自上海博研生物科技有限公司；培养条 件：DMEM+10% 胎牛血清，37 °C，5%C02。
[0046] 药物的细胞毒性检测：米用了 alatnarBlue? (Invitrogen)试剂盒检测药物对细 胞的毒性作用。实验原理：alaniarBhie?是一种氧化还原指示剂，能根据代谢活性产生吸 光度变化和荧光信号。alamarBlue⑩易溶于水，其氧化形式进入细胞后经线粒体酶还原 产生可测量的荧光及颜色变化，用于细胞活性和细胞增殖的定量分析以及体外细胞毒性研 究。这种测定是基于具有代谢活性的细胞将试剂转换成荧光和比色指示剂的能力，受损和 无活性细胞具有较低的天然代谢活性，对应的信号较低。因此荧光信号强弱，可以反映细胞 活性的高低。
[0047]方法步骤:MDCK细胞接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用。用细胞维持液 (DMEM+5%血清）将药物从2倍起始浓度连续3倍梯度稀释6个梯度，每浓度梯度单孔检测。 加药培养72h后，光镜下观察药物引起的细胞病变效应（CPE)，加入37°C孵 育2h,荧光检测alamarB丨ue?的还原情况，激发光57〇nm，发射光595nm。
[0048] 细胞活性（%) =(样品孔-空白对照）八细胞对照-空白对照）X100%
[0049] 药物对流感病毒的抑制试验：鉴于基于病毒引起的细胞病变效应检测不够灵敏和 不便于定量分析。本发明采用检测流感病毒神经氨酸酶活性来代表病毒的复制水平。实验 原理：流感病毒神经氨酸酶（NA)，又称唾液酸酶，是一种表面糖蛋白，具有酶活性，对A、B型 流感病毒的复制有重要作用。它可以裂解细胞表面流感病毒受体末端的唾液酸残基，帮助 子代病毒粒子的释放,并防止病毒粒子聚集，促进病毒的扩散。神经氨酸酶是抗流感病毒药 物研发的重要靶点。本发明采用MUNANA作为底物检测流感病毒NA活性。MUNANA(4-methy lumbelliferyl-a -N-acetyl-neuraminate)是流感病毒ΝΑ的特异性底物，在ΝΑ作用下产 生的催化产物在355nm激发光照射下，可以产生460nm荧光，荧光强度的变化，可以灵敏反 映神经氨酸酶活性。病毒感染细胞并加药培养一定时间后，取培养液上清进行神经氨酸酶 活性检测，在反应底物过量时，酶促反应的速度与酶浓度是呈正比的，所以根据此原理可以 检测NA酶活来反映上清中病毒粒子的滴度。
[0050] 方法步骤：
[0051] (1)细胞铺板：将MDCK细胞接种于96孔细胞培养板中备用。
[0052] (2)病毒感染细胞：药物从2倍最高测试浓度起连续3倍梯度稀释6个梯度；将孔 板中培养基弃去，同时加入药物和病毒液于细胞孔中，37°C细胞培养箱中孵育U后，弃上 清培养基，PBS洗涤后，再次加入梯度稀释药物。置于3rc细胞培养箱培养48h，辅以观察 细胞病变（CPE)。取培养液上清进行神经氨酸酶活力检测。
[0053]实验设空白对照孔（正常细胞），酶活对照孔（病毒感染后未加药物孔），阳性药 物对照孔(感染后加利巴韦林)。
[0054] (3)神经氨酸酶活性检测：
[0055]实验操作：96孔黑色微量板中加入20 μ L底物（MUNANA)，吸取病毒培养液40 μ L 上清加入^板中，避光置于WC孵育60min，加入100 μ L终止液/孔终止反应，多功能检测 仪上测定荧光值。激发波长为：355nm，发射波长485nm。计算各检测孔中被抑制率。
[0056]抑制率（％) =1〇〇-(样品孔-空白对照）/ (酶活对照-空白对照）X 100%
[0057]结果：
[0058]纖样品C存浓度，最高毒性测试浓度，最高活性测试浓度，cc5。，ECs。以及 SI(选 择指数）如表1所示。
[0059] 表1·各药物样品实验结果
[0060]
【权利要求】
1. 水黄皮总黄酮提取物或水黄皮素在制备用于治疗和/或抗流感病毒药物中的应用。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水黄皮总黄酮提取物是从水黄皮茎枝 和/或叶提取而得，总黄酮的含量为50%?70%重量； 其中，含有水黄皮素； 所述总黄酮的含量以水黄皮素为对照品，采用紫外分光光度法测定； 水黄皮素的含量为5%?10%重量。
3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水黄皮总黄酮提取物由下述方法制备： ⑴取水黄皮茎枝和/或叶，以50 %?90%乙醇回流提取1?3次，每次提取1?3小 时，合并提取液； (2) 将步骤1所得提取液减压浓缩至无醇味，离心，取上清液； (3) 将步骤2所得的上清液通过聚酰胺层析柱分离，用水洗脱2?5个柱体积，再用 20 %?70%乙醇洗脱2?10个柱体积，收集乙醇洗脱液； (4) 浓缩、干燥乙醇洗脱液得到水黄皮总黄酮提取物。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述水黄皮总黄酮提取物由下述方法制备： ⑴取水黄皮茎枝和/或叶，以60 %?80%乙醇回流提取2?3次，每次提取2?3小 时，合并提取液； (2) 将步骤1所得提取液减压浓缩至无醇味，离心，取上清液； (3) 将步骤2所得的上清液通过聚酰胺层析柱分离，用水洗脱3?4个柱体积，再用 40 %?60%乙醇洗脱4?7个柱体积，收集乙醇洗脱液； (4) 浓缩、干燥乙醇洗脱液得到水黄皮总黄酮提取物。
5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述水黄皮总黄酮提取物由以下方法制备： (1) 取水黄皮茎枝和/或叶，以80%乙醇回流提取2次，每次提取2小时，合并提取液； (2) 将步骤1所得提取液减压浓缩至无醇味，离心，取上清液； (3) 将步骤2所得的上清液通过聚酰胺层析柱分离，用水洗脱3个柱体积，再用50%乙 醇洗脱5个柱体积，收集乙醇洗脱液； (4) 浓缩、干燥乙醇洗脱液得到水黄皮总黄酮提取物。
6. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水黄皮素具有如图4所示的HPLC色谱 图，其中，色谱图的特征峰为：水黄皮素保留时间：10. 8min ; 色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-0. 2%HAc (43:57);流 速：lml/min ;检测波长：260nm。
7. 如权利要求1或6所述的应用，其特征在于，所述水黄皮素是从水黄皮总黄酮提取物 中提纯而得，包括以下步骤： (1) 通过反相硅胶层析柱分离，以30%?60%乙醇洗脱，得到水黄皮素粗品； (2) 用无水乙醇溶解步骤（1)所得的水黄皮素粗品，加水至乙醇浓度为5%?30%，放置 重结晶，即得。
8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述水黄皮素的提纯步骤包括： (1) 通过反相硅胶层析柱分离，以40%乙醇洗脱，得到水黄皮素粗品； (2) 用无水乙醇溶解步骤（1)所得的水黄皮素粗品，加水至乙醇浓度为10%，放置重结 晶，即得。
9. 一种抗流感病毒的药物组合物，其特征在于，含有水黄皮素或水黄皮总黄酮提取物。
10. 权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，进一步包含药学上可接受的载体和/ 或赋形剂。
【文档编号】A61K127/00GK104248654SQ201310259698
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年6月26日 优先权日:2013年6月26日
【发明者】严启新, 谭道鹏, 曾伟珍, 陈艳萍, 王宇, 冯汉林 申请人:深圳海王药业有限公司