专利名称：结合超临界二氧化碳发泡技术制备具有双孔结构组织工程支架的方法
技术领域：
本发明涉及一种结合超临界二氧化碳发泡技术制备具有双孔结构组织工程支架的方法。
背景技术：
组织工程学的提出为众多具有组织缺陷和器官功能衰竭病人的治疗带来了希望，因其能够避免组织或器官移植过程中资源有限、排斥反应以及并发症等问题而受到越来越广泛的关注。组织工程学的研究领域涉及材料学、工程学及生命科学。细胞、支架和生长信息构成了组织工程学的三个基本要素，其中支架材料的开发对推动组织工程学的发展具有至关重要的作用，也是组织工程学研究的热点和难点，它的开发具有广泛的应用前景和潜在的巨大经济效益。理想的组织工程支架应具有良好的生物相容性和生物可降解性，并具有三维立体多孔结构，为细胞和组织的生长提供足够的空间和物质交换通道，同时要求支架具有可塑性及一定的机械强度，为新生组织的生长提供支撑。不同组织的生长对支架孔径范围有不同的要求，如骨组织要求支架具有100-400 μ m结构的泡孔，表皮细胞生长需要20-100 μ m的孔结构，而一般更小孔径的泡孔则成为营养物质及细胞代谢废物传递的通道。现有的制备多孔材料的方法，主要包括纤维粘结法、溶剂浇铸/颗粒滤浙以及相分离法等。采用传统方法制备的支架材料在材料成型、孔大小、孔隙率及生物相容性等方面取得了可喜的进展，然而由于大多数制备过程均涉及大量有机溶剂的使用，因而限制了其在组织工程领域的应用。近年来，随着超临界流体技术研究的深入，利用超临界二氧化碳(SC-CO2)发泡技术制备多孔组织工程支架越来越受到重视。利用SC-CO2制备多孔材料时，SC-CO2先扩散溶解进入聚合物基质，由于SC-CO2的增塑作用会降低聚合物的玻璃化转变温度σρ，使其低于实验温度；随后因 系统泄压或升温导致体系热力学失稳，大量气核在聚合物基质内形成并生长；随着CO2从聚合物中扩散出来，聚合物基质的Tg不断上升，当Tg高于实验温度时，聚合物基质固化，即得到聚合物的多孔结构。利用SC-CO2发泡法制备多孔材料具有诸多优势:(1)制备过程可以完全避免有机溶剂的使用，简化了后续操作，是一种绿色工程技术；(2) SC-CO2具有很好的传质性能，能迅速溶入聚合物基质并均匀分布，且SC-CO2的性质可以随着压力和温度的变化方便调节；(3) SC-CO2具有较低的临界温度(31.06 0C)和降低聚合物Tg的能力，可避免生物活性物质如蛋白质生长因子的变性失活；(4)可以根据需要结合其他传统聚合物处理方法进行材料预处理，脱除有机溶剂残留。因此，采用超临界发泡法制备多孔支架用于组织工程领域的前景是可以预期的。
发明内容
本发明的目的是提供一种结合超临界二氧化碳发泡技术制备具有双孔结构组织工程支架的方法。
结合超临界二氧化碳发泡技术制备具有双孔结构组织工程支架的方法包括如下步骤:
1)选用氯化钠或海藻糖作为致孔剂，利用筛网筛分得到50-400ym粒径的颗粒，与聚合物粉末经物理震荡混合后压片形成致孔剂质量分数含量为10-90%的圆柱形模片；
2)将圆柱形模片置于超临界二氧化碳发泡系统的高压釜内，通入二氧化碳，在温度为35-75 °C、压力为8-30 MPa以及平衡时间大于2 h的条件下使二氧化碳达到超临界状态，超临界二氧化碳和圆柱形模片充分接触并使超临界二氧化碳在圆柱形模片中达到溶解平衡，最终以0.05-0.20 MPa/s速率泄压，在圆柱形模片内形成孔径小于20 μ m的泡孔，得到经超临界二氧化碳发泡处理后的聚合物-致孔剂样片；
3)将经超临界二氧化碳发泡处理后的聚合物-致孔剂样片浸泡于去离子水中，室温震荡脱盐处理72 h，用冷冻干燥的方法除去支架中残留的水分，致孔剂颗粒洗脱后留下的印迹形成孔径50-400 μ m的大孔，得到具有双孔结构组织工程支架；
所述超临界二氧化碳发泡系统包括CO2钢瓶、冷却器、流量计、高压泵、恒温预热器、高压釜、可控电加热夹套、压力表和自动背压阀；C02钢瓶与冷却器、流量计、高压泵、恒温预热器、高压釜、自动背压阀顺次相连，高压釜外设有可控电加热夹套，高压釜上部与压力表相连。所述的聚合物为聚酯类聚合物，聚酯类聚合物为聚乳酸、聚乙醇酸、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物或聚己内酯。
本发明采用生物可降解聚合物作为支架材料，添加致孔剂并结合SC-CO2对聚合物的塑化作用形成双孔结构，获得具有连通孔道的多孔支架材料。其中致孔剂洗脱印迹产生的50-100 μ m结构的大孔有利于表皮细胞在支架上的黏附生长，100-400 μ m结构的大孔有利于成骨细胞在支架上的黏附生长，而由聚合物在SC-CO2中发泡产生的孔径小于20 μ m泡孔则成为营养物质传递的通道。本发明具有不使用有机溶剂、操作条件温和、操作工艺简单并且通过过程参数的调节能够很好地控制泡孔结构等优点。
图1为超临界二氧化碳发泡系统示意 图2为实施例1中所制得的具有双孔结构组织工程支架截面的电子扫描显微镜照片； 图3为实施例2中所制得的具有双孔结构组织工程支架截面的电子扫描显微镜照片。
具体实施例方式如图1所示，结合超临界二氧化碳发泡技术制备具有双孔结构组织工程支架的方法包括如下步骤:
1)选用氯化钠或海藻糖作为致孔剂，利用筛网筛分得到50-400ym粒径的颗粒，与聚合物粉末经物理震荡混合后压片形成致孔剂质量分数含量为10-90%的圆柱形模片；
2)将圆柱形模片置于超临界二氧化碳发泡系统的高压釜内，通入二氧化碳，在温度为35-75 °C、压力为8-30 MPa以及平衡时间大于2 h的条件下使二氧化碳达到超临界状态，超临界二氧化碳和圆柱形模片充分接触并使超临界二氧化碳在圆柱形模片中达到溶解平衡，最终以0.05-0.20 MPa/s速率泄压，在圆柱形模片内形成孔径小于20 μ m的泡孔，得到经超临界二氧化碳发泡处理后的聚合物-致孔剂样片；
3)将经超临界二氧化碳发泡处理后的聚合物-致孔剂样片浸泡于去离子水中，室温震荡脱盐处理72 h，用冷冻干燥的方法除去支架中残留的水分，致孔剂颗粒洗脱后留下的印迹形成孔径50-400 μ m的大孔，得到具有双孔结构组织工程支架；
所述超临界二氧化碳发泡系统包括CO2钢瓶1、冷却器2、流量计3、高压泵4、恒温预热器5、高压釜6、可控电加热夹套7、压力表8和自动背压阀9 ；C02钢瓶I与冷却器2、流量计
3、高压泵4、恒温预热器5、高压釜6、自动背压阀9顺次相连，高压釜6外设有可控电加热夹套7，高压釜6上部与压力表8相连。所述的聚合物为聚酯类 聚合物，聚酯类聚合物为聚乳酸、聚乙醇酸、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物或聚己内酯。实施例1:聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)双孔结构支架的制备
首先将PLGA (乳酸:乙醇酸=85:15，分子量200 kDa)粉末与NaCl颗粒(200 μ m)以60% (NaCl质量分数)的比例在震荡器中进行物理混合，利用压片机形成圆柱形模片。将PLGA-NaCl圆柱形模片置于高压釜内，用冷却槽将CO2钢瓶流出的气体CO2冷却成液体，CO2由高压泵输送至高压釜，高压釜内温度和压力由计算机分别设定为35 °(:和15 MPa, CO2在高压釜中达到超临界状态，系统平衡2h。平衡结束后，关闭CO2钢瓶、冷却槽、高压泵，并以
0.20 MPa/s的速率快速泄压使体系达到热不稳定状态，CO2在聚合物基质内成核生长形成泡孔。经SC-CO2发泡处理后，打开高压釜取出PLGA-NaCl样片，将该样片浸泡于去离子水中脱盐处理72 h，随后用冷冻干燥机脱除样片中剩余的水分，NaCl洗脱印迹即得到大孔。最终得到具有两种孔结构并且大孔间相互连通的PLGA支架，经扫描电子显微镜观察大孔孔径为200 μ m,小孔孔径5-15 Mm。比重法测得总孔隙率为69.83 ±2.86%。具备双孔结构PLGA支架截面的扫面电子显微镜照片如图2所示
实施例2:聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)双孔结构支架的制备首先将PLGA (乳酸:乙醇酸=85:15，分子量200 kDa)粉末与NaCl颗粒(200 μ m)以80% (NaCl质量分数)的比例在震荡器中进行物理混合，利用压片机形成圆柱形模片。将PLGA-NaCl圆柱形模片置于高压釜内，用冷却槽将CO2钢瓶流出的气体CO2冷却成液体，CO2由高压泵输送至高压釜，高压釜内温度和压力由计算机分别设定为35 °(:和15 MPa, CO2在高压釜中达到超临界状态，系统平衡2h。平衡结束后，关闭CO2钢瓶、冷却槽、高压泵，并以
0.20 MPa/s的速率快速泄压使体系达到热不稳定状态，CO2在聚合物基质内成核生长形成泡孔。经SC-CO2发泡处理后，打开高压釜取出PLGA-NaCl样片，将该样片浸泡于去离子水中脱盐处理72 h，随后用冷冻干燥机脱除样片中剩余的水分，NaCl洗脱印迹即得到大孔。最终得到具有两种孔结构并且大孔间相互连通的PLGA支架，经扫描电子显微镜观察大孔孔径为200 μ m，小孔孔径5-15 Mm0比重法测得总孔隙率为80.76± 1.83 %。具备双孔结构PLGA支架截面的扫面电子显微镜照片如图3所示。实施例3:聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)双孔结构支架的制备
首先将PLGA (乳酸:乙醇酸=85:15，分子量200 kDa)粉末与海藻糖颗粒(400 μ m)以90% (海藻糖质量分数)的比例在震荡器中进行物理混合，利用压片机形成圆柱形模片。将PLGA-海藻糖圆柱形模片置于高压釜内，用冷却槽将CO2钢瓶流出的气体CO2冷却成液体，CO2由高压泵输送至高压釜，高压釜内温度和压力由计算机分别设定为45 °(:和15 MPa7CO2在高压釜中达到超临界状态，系统平衡2h。平衡结束后，关闭CO2钢瓶、冷却槽、高压泵，并以0.20 MPa/s的速率快速泄压使体系达到热不稳定状态，CO2在聚合物基质内成核生长形成泡孔。经SC-CO2发泡处理后，打开高压釜取出PLGA-海藻糖样片，将该样片浸泡于去离子水中脱盐处理72 h，随后用冷冻干燥机脱除样片中剩余的水分，海藻糖洗脱印迹即得到大孔。最终得到具有两种孔结构并且大孔间相互连通的PLGA支架，经扫描电子显微镜观察大孔孔径为400 μ m,小孔孔径5-20 Mm0比重法测得总孔隙率为90.76 + 1.83 %。实施例4:聚乳酸(PLA)双孔结构支架的制备
首先将PLA (分子量200 kDa)粉末与NaCl颗粒(200 μ m)以10% (质量分数)的比例在震荡器中进行物理混合，利用压片机形成圆柱形模片。将PLA-NaCl圆柱形模片置于高压釜中，用冷却槽将CO2钢瓶流出的气体CO2冷却成液体，CO2由高压泵输送至高压釜，高压釜内温度和压力由计算机分别设定为45 0C和8 MPa, CO2在高压釜中达到超临界状态，系统平衡2h。平衡结束后，关闭CO2钢瓶、冷却槽、高压泵，并以0.05 MPa/s的速率快速泄压使体系达到热不稳定状态，CO2在聚合物基质内成核生长形成泡孔。经SC-CO2发泡处理后，打开高压釜取出PLA-NaCl样片，将该样片浸泡于去离子水中脱盐处理72 h，随后用冷冻干燥机脱除样片中剩余的水分，NaCl洗脱印迹即得到大孔。最终得到具有两种孔结构并且大孔间相互连通的PLA支架，经扫描电子显微镜观察:大孔孔径为200 μ m，小孔孔径15-25 Mm。比重法测得总孔隙率为65.54±2.43 %。实施例5:聚乙醇酸(PGA)双孔结构支架的制备
首先将PGA (分子量200 kDa)粉末与NaCl颗粒(50 μ m)以10% (NaCl质量分数)的比例在震荡器中进行物理混合，利用压片机形成圆柱形模片。将PGA-NaCl圆柱形模片置于高压釜中，用冷却槽将CO2钢瓶流出的气体CO2冷却成液体，CO2由高压泵输送至高压釜，高压釜内温度和压力由计算 机分别设定为45 °(:和30 MPa, CO2在高压釜中达到超临界状态，系统平衡2h。平衡结束后，关闭CO2钢瓶、冷却槽、高压泵，并以0.20 MPa/s的速率快速泄压使体系达到热不稳定状态，CO2在聚合物基质内成核生长形成泡孔。经SC-CO2*泡处理后，打开高压釜取出PGA-NaCl样片，将该样片浸泡于去离子水中脱盐处理72 h，随后用冷冻干燥机脱除样片中剩余的水分，NaCl洗脱印迹即得到大孔。最终得到具有两种孔结构并且大孔间相互连通的PGA支架，经扫描电子显微镜观察:大孔孔径为50 μ m,小孔孔径3-5Mm。比重法测得总孔隙率为85.78± 1.74 %。实施例6:聚己内酯(PCL)双孔结构支架的制备
首先将PCL (分子量200 kDa)粉末与NaCl颗粒(200 μ m)以80% (NaCl质量分数)的比例在震荡器中进行物理混合，利用压片机形成圆柱形模片。将PCL-NaCl圆柱形模片置于高压釜中，用冷却槽将CO2钢瓶流出的气体CO2冷却成液体，CO2由高压泵输送至高压釜，高压釜内温度和压力由计算机分别设定为75 °(:和15 MPa, CO2在高压釜中达到超临界状态，系统平衡2h。平衡结束后，关闭CO2钢瓶、冷却槽、高压泵，并以0.20 MPa/s的速率快速泄压使体系达到热不稳定状态，CO2在聚合物基质内成核生长形成泡孔。经SC-CO2发泡处理后，打开高压釜取出PCL-NaCl样片，将该样片浸泡于去离子水中脱盐处理72 h，随后用冷冻干燥机脱除样片中剩余的水分，NaCl洗脱印迹即得到大孔。最终得到具有两种孔结构并且大孔间相互连通的PCL支架，经扫描电子显微镜观察:大孔孔径为200 μ m,小孔孔径25-45Mffl0比重法测得总孔隙率为68.92±3.23 %。
权利要求
1.一种结合超临界二氧化碳发泡技术制备具有双孔结构组织工程支架的方法，其特征在于包括如下步骤 1)选用氯化钠或海藻糖作为致孔剂，利用筛网筛分得到50-400ym粒径的颗粒，与聚合物粉末经物理震荡混合后压片形成致孔剂质量分数含量为10-90%的圆柱形模片； 2)将圆柱形模片置于超临界二氧化碳发泡系统的高压釜内，通入二氧化碳，在温度为35-75 °C、压力为8-30 MPa以及平衡时间大于2 h的条件下使二氧化碳达到超临界状态，超临界二氧化碳和圆柱形模片充分接触并使超临界二氧化碳在圆柱形模片中达到溶解平衡，最终以O. 05-0. 20 MPa/s速率泄压，在圆柱形模片内形成孔径小于20 μ m的泡孔，得到经超临界二氧化碳发泡处理后的聚合物-致孔剂样片； 3)将经超临界二氧化碳发泡处理后的聚合物-致孔剂样片浸泡于去离子水中，室温震荡脱盐处理72 h，用冷冻干燥的方法除去支架中残留的水分，致孔剂颗粒洗脱后留下的印迹形成孔径50-400 μ m的大孔，得到具有双孔结构组织工程支架； 所述超临界二氧化碳发泡系统包括CO2钢瓶(I)、冷却器(2)、流量计(3)、高压泵(4)、恒温预热器(5)、高压釜(6)、可控电加热夹套(7)、压力表(8)和自动背压阀(9) ;0)2钢瓶(I)与冷却器(2)、流量计(3)、高压泵(4)、恒温预热器(5)、高压釜(6)、自动背压阀(9)顺次相连，高压釜(6)外设有可控电加热夹套(7)，高压釜(6)上部与压力表(8)相连。
2.根据权利要求I所述的一种结合超临界二氧化碳发泡技术制备具有双孔结构组织工程支架的方法，其特征在于所述的聚合物为聚酯类聚合物，聚酯类聚合物为聚乳酸、聚乙醇酸、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物或聚己内酯。
全文摘要
本发明公开了一种结合超临界二氧化碳发泡技术制备具有双孔结构组织工程支架的方法。引入商品致孔剂与聚合物粉末经过物理混合后压片；将该模片置于高压釜内，于超临界二氧化碳中保压一段时间后，通过快速泄压使聚合物基质中产生大量发泡核心并且泡核生长形成泡孔；最后将致孔剂颗粒洗脱形成相互连通的具有双孔结构的多孔支架。本发明具有操作条件温和、操作工艺简单、过程稳定的特点，支架制备过程中不涉及有机溶剂的使用，可应用于多孔组织工程支架的制备。
文档编号A61L27/50GK103254459SQ20131020322
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月28日 优先权日2013年5月28日
发明者关怡新, 刘倩倩, 杜哲, 唐川, 辛新, 陈传鑫, 姚善泾 申请人:浙江大学