一种含山梨醇成分的水痘疫苗冻干保护剂的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种含山梨醇成分的水痘疫苗冻干保护剂，该保护剂的各组分包括山梨醇、人血清白蛋白、蔗糖、右旋糖酐、海藻糖、精氨酸、谷氨酸钠和尿素，并且所述保护剂中不含有明胶；还公开了该保护剂的制备方法和用途，本发明提供的水痘疫苗冻干保护剂的组分简单，配比合理，含山梨醇和重组人血清白蛋白，无明胶，去除了动物源性成分，并且使疫苗内毒素含量明显降低，极大地降低了疫苗对人体的刺激性及危害性，提高了疫苗的安全性和稳定性。而且制备方法的工艺简易、易于实现，生产效率高，能快速制备出水痘疫苗冻干保护剂。本发明水痘疫苗冻干保护剂能有效提高冻干水痘疫苗的稳定性和安全性，但不局限于水痘疫苗，适用范围广。
【专利说明】一种含山梨醇成分的水痘疫苗冻干保护剂
【技术领域】
[0001] 本发明属于疫苗【技术领域】，具体涉及一种含山梨醇成分的水痘疫苗冻干保护剂及 其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 预防性疫苗的应用使常见流行性传染病得到了有效的控制，有效地降低了 了这些 传染病的发病率和死亡率。但是，在疫苗的流通领域中发现，疫苗的储存、运输和临床使用 过程中，存在诸如稳定性差、有效期短、不良反应率高等问题。随着疫苗的广泛应用和对不 良反应诱因的深入研究，发现很多问题与疫苗的保护剂和佐剂直接相关，尤其是疫苗产品 中的保护剂，其中明胶和明胶衍生物能直接引起被接种者的变态反应。1993年，Keslo等报 道，有些孩子对MMR联合疫苗的过敏，是由于疫苗中的明胶在被接种者机体内产生抗明胶 分子的IgE抗体所致。明胶既可以引起细胞介导的免疫反应，也可以引起非细胞介导的免 疫反应；另外明胶也是细菌内毒素的主要来源，可导致人体产生发热反应。为了减轻或避免 疫苗使用过程中出现的不良反应，使用明胶替代品或直接生产不含明胶的疫苗产品是必然 的趋势。
[0003] 目前，人血清白蛋白在疫苗领域被广泛应用于细胞培养和冻干保护剂。常见的人 血清白蛋白大多是从人的血浆中提取，这样的生产方式不仅受到血浆供应的限制，而且还 可能含有危险的传染病病原体，如肝炎病毒、HIV病毒等，这使得人们对于使用血浆中提取 的人血清白蛋白存在巨大的担忧。随着现代DNA重组和合成技术的发展，人们开始利用DNA 重组技术生产人血清白蛋白替代传统的生产方式。国际上以重组人血清白蛋白替代血源性 产品的应用已成为趋势，目前国内已有企业利用水稻胚乳表达技术，研发出重组人清血白 蛋白产品，并成功实现重组人血清白蛋白规模化和产业化，完全摆脱了相关制约，具有纯度 更高、无动物组分、安全、高效、绿色环保、廉价、无限量供应等优势。
[0004] 目前使用疫苗进行免疫接种已经成为世界各国预防流行病的主要手段。然而，现 有疫苗产品的冻干保护剂多数是以明胶、蔗糖为主要成分。随着科技的进步，国家对疫苗安 全性要求逐渐提高，行业中对产品中所含动物源性成分加以限制，冻干保护剂中去除明胶 和血液源性白蛋白的需求变得更加迫切。
【发明内容】
[0005] 针对上述的不足，本发明目的之一在于，提供一种配方合理，制备工艺简单，用于 水痘疫苗的冻干保护，不含动物源性成分，并且使疫苗内毒素含量明显降低，极大地降低了 对人体的刺激性及危害性，提高了疫苗的安全性和稳定性的含山梨醇成分的水痘疫苗冻干 保护剂。
[0006] 本发明目的之二在于，提供一种上述含山梨醇成分的水痘疫苗冻干保护剂的制备 方法。
[0007] 本发明目的之三在于，提供一种上述含山梨醇成分的水痘疫苗冻干保护剂的用 途。
[0008] 为实现上述目的，本发明所提供的技术方案是：
[0009] -种含山梨醇成分的水痘疫苗冻干保护剂，该保护剂的各组分及其在冻干原液中 的终浓度为：山梨醇l-l〇g/L、人血清白蛋白5-30g/L、蔗糖10-30g/L、右旋糖酐10-50g/L、 海藻糖40-60g/L、精氨酸0. 5-4g/L、谷氨酸钠5-15g/L、尿素2-8g/L，并且所述保护剂中不 含有明胶。
[0010] 作为本发明的一种改进，所述山梨醇的终浓度为2-8g/L。
[0011] 作为本发明的一种改进，所述蔗糖终浓度为15-25g/L。
[0012] 作为本发明的一种改进，海藻糖终浓度为45-55g/L。
[0013] 作为本发明的一种改进，所述人血清白蛋白为重组人血清白蛋白。
[0014] 作为本发明的一种改进，所述右旋糖酐为右旋糖酐40。
[0015] 一种水痘疫苗冻干保护剂的制备方法，在冻干过程中采用权利要求1至6任一项 所述的保护剂。
[0016] 作为本发明制备方法的一种改进，其包括以下步骤：
[0017] (1)复苏MRC-5细胞：从液氮中取出冻存的MRC-5细胞，立即放入36?38°C水浴 中解冻，900?llOOrpm离心4?6min，弃去上层冻存液，加入新鲜培养液，轻轻混勻置36? 38°C培养2?4天至细胞长满单层；培养液为含9?11%小牛血清、0.8?1.2%谷氨酰胺 的MHM液，疫苗生产过程中不加抗生素；
[0018] (2)消化传代：待细胞长成均匀、致密的单层，倾去培养瓶中培养液，加入胰酶消 化液消化至细胞附着松动、细胞边缘卷起且细胞间的间隔加大，倒去胰酶消化液，加入新鲜 细胞培养液后吹打，得到细胞悬液，按1 : 2的比例传代扩增到新培养瓶中；
[0019] (3)反应器扩大培养：重复步骤（2)制备细胞悬液，接种14L生物反应器，其中反 应器中预先加入7?9g/L处理好的无菌微载体，接种细胞终浓度为5X 105cellS/mL，然后 在36?38°C、pH7. 1?7. 3、溶氧18?22%、搅拌转速30?50rpm的条件下培养6?8天， 至细胞在微载体上长满单层；
[0020] (4)病毒接种与繁殖：取工作种子批毒种按0. 01?0. 1M0I比例，接种于培养好的 MRC-5细胞，加入维持液，调整培养温度34. 5?35. 5°C，至出现10?30%病变时，停止搅 拌，弃去维持液，用二倍以上原培养液量的Earle' s液冲洗细胞面，去除牛血清，并换以维 持液继续培养，维持液为含〇. 1 % g/mL人血白蛋白的MEM培养基；
[0021] (5)疫苗原液收获：观察细胞出现病变达80%以上时，加入保护剂收集病毒液，保 护剂是含有终浓度为：山梨醇l-l〇g/L、人血清白蛋白5-30g/L、蔗糖10-30g/L、右旋糖酐 10-50g/L、海藻糖40-60g/L、精氨酸0· 5-4g/L、谷氨酸钠5-15g/L、尿素2-8g/L的综合培养 基，将细胞培养物经_80°C冻融，经澄清过滤后即为原液；
[0022] (6)冻干：将原液分装于西林瓶中，每支0.6mL，经半加塞后置于冻干箱内，预冻 至-44?-46 °C并在此温度保温1. 5?2. 5小时，然后抽真空至0. lmbar，同时隔板升温 至-25°C开始一次升华9?11小时，于32. 5?33. 5°C控温4. 5?5. 5小时，即完成冻干。
[0023] 所述保护剂用于提高冻干水痘疫苗的稳定性和安全性，但不局限于水痘疫苗。
[0024] 本发明的有益效果为：本发明提供的水痘疫苗冻干保护剂的组分简单，配比合理， 含山梨醇和重组人血清白蛋白，无明胶，去除了动物源性成分，并且使疫苗内毒素含量明显 降低，极大地降低了疫苗对人体的刺激性及危害性，提高了疫苗的安全性和稳定性。而且制 备方法的工艺简易、易于实现，生产效率高，能快速制备出水痘疫苗冻干保护剂。本发明水 痘疫苗冻干保护剂能有效提高冻干水痘疫苗的稳定性和安全性，但不局限于水痘疫苗，适 用范围广。
[0025]
【具体实施方式】
[0026] 实施例1 :本实施例提供了一种含山梨醇成分的水痘疫苗冻干保护剂，该保护剂 的各组分及其在冻干原液中的终浓度为：山梨醇l-l〇g/L、人血清白蛋白5-30g/L、蔗糖 10-30g/L、右旋糖酐10-50g/L、海藻糖40-60g/L、精氨酸0· 5-4g/L、谷氨酸钠5-15g/L、尿素 2_8g/L，并且所述保护剂中不含有明胶。
[0027] 所述山梨醇的终浓度为2_8g/L。
[0028] 所述蔗糖终浓度为15_25g/L。
[0029] 海藻糖终浓度为45_55g/L。
[0030] 所述人血清白蛋白为重组人血清白蛋白。
[0031] 所述右旋糖酐为右旋糖酐40。
[0032] -种水痘疫苗冻干保护剂的制备方法，在冻干过程中采用权利要求1至6任一项 所述的保护剂。其包括以下步骤：
[0033] (1)复苏MRC-5细胞：从液氮中取出冻存的MRC-5细胞，立即放入36?38°C水浴 中解冻，900?llOOrpm离心4?6min，弃去上层冻存液，加入新鲜培养液，轻轻混勻置36? 38°C培养2?4天至细胞长满单层；培养液为含9?11%小牛血清、0.8?1.2%谷氨酰胺 的MHM液，疫苗生产过程中不加抗生素；
[0034] (2)消化传代：待细胞长成均匀、致密的单层，倾去培养瓶中培养液，加入胰酶消 化液消化至细胞附着松动、细胞边缘卷起且细胞间的间隔加大，倒去胰酶消化液，加入新鲜 细胞培养液后吹打，得到细胞悬液，按1 :2的比例传代扩增到新培养瓶中；
[0035] (3)反应器扩大培养：重复步骤（2)制备细胞悬液，接种14L生物反应器，其中反 应器中预先加入7?9g/L处理好的无菌微载体，接种细胞终浓度为5X 105cellS/mL，然后 在36?38°C、pH7. 1?7. 3、溶氧18?22%、搅拌转速30?50rpm的条件下培养6?8天， 至细胞在微载体上长满单层；
[0036] (4)病毒接种与繁殖：取工作种子批毒种按0. 01?0. 1M0I比例，接种于培养好的 MRC-5细胞，加入维持液，调整培养温度34. 5?35. 5°C，至出现10?30%病变时，停止搅 拌，弃去维持液，用二倍以上原培养液量的Earle' s液冲洗细胞面，去除牛血清，并换以维 持液继续培养，维持液为含〇. 1 % g/mL人血白蛋白的MEM培养基；
[0037] (5)疫苗原液收获：观察细胞出现病变达80%以上时，加入保护剂收集病毒液，保 护剂是含有终浓度为：山梨醇l-l〇g/L、人血清白蛋白5-30g/L、蔗糖10-30g/L、右旋糖酐 10-50g/L、海藻糖40-60g/L、精氨酸0· 5-4g/L、谷氨酸钠5-15g/L、尿素2-8g/L的综合培养 基，将细胞培养物经_80°C冻融，经澄清过滤后即为原液；
[0038] (6)冻干：将原液分装于西林瓶中，每支0.6mL，经半加塞后置于冻干箱内，预冻 至-44?-46 °C并在此温度保温1. 5?2. 5小时，然后抽真空至0. lmbar，同时隔板升温 至-25°C开始一次升华9?11小时，于32. 5?33. 5°C控温4. 5?5. 5小时，即完成冻干。
[0039] 所述保护剂用于提高冻干水痘疫苗的稳定性和安全性，但不局限于水痘疫苗。
[0040] 实施例2,其与实施例1基本相同，区别在于：
[0041] (1)复苏MRC-5细胞：从液氮中取出冻存的MRC-5细胞，立即放入37°C水浴中解 冻，lOOOrpm离心5min，弃去上层冻存液，加入新鲜培养液，轻轻混匀置37°C培养3天至细 胞长满单层；培养液为含10 %小牛血清、1 %谷氨酰胺的MEM液，疫苗生产过程中不加抗生 素；
[0042] (2)消化传代：待细胞长成均匀、致密的单层，倾去培养瓶中培养液，加入胰酶消 化液消化至细胞附着松动、细胞边缘卷起且细胞间的间隔加大，倒去胰酶消化液，加入新鲜 细胞培养液后吹打，得到细胞悬液，按1 : 2的比例传代扩增到新培养瓶中；
[0043] (3)反应器扩大培养：重复步骤（2)制备细胞悬液，接种14L生物反应器，其中 反应器中预先加入8g/L处理好的无菌微载体，接种细胞终浓度为5X 105cellS/mL，然后在 37°C、pH7. 2、溶氧20%、搅拌转速40rpm的条件下培养7天，至细胞在微载体上长满单层；
[0044] (4)病毒接种与繁殖：取工作种子批毒种按0. 01?0. 1M0I比例，接种于培养好的 MRC-5细胞，加入维持液，调整培养温度35°C，至出现10?30%病变时，停止搅拌，弃去维 持液，用二倍以上原培养液量的Earle' s液冲洗细胞面，去除牛血清，并换以维持液继续培 养，维持液为含〇. 1 % g/mL人血白蛋白的MEM培养基；
[0045] (5)疫苗原液收获：观察细胞出现病变达80%以上时，加入保护剂收集病毒液，保 护剂是含有终浓度为：3g/L山梨醇、10g/L重组人血清白蛋白、10g/L蔗糖、20g/L右旋糖 酐、60g/L海藻糖、3g/L精氨酸、5g/L谷氨酸钠、3g/L尿素的199综合培养基，将细胞培养物 经-80°C冻融，经澄清过滤后即为原液；
[0046] (6)冻干：将原液分装于西林瓶中，每支0.6mL，经半加塞后置于冻干箱内，预冻 至-45°C并在此温度保温2小时，然后抽真空至0. lmbar，同时隔板升温至-25°C开始一次升 华10小时，于33°C控温5小时，即完成冻干。
[0047] 实施例3,其与实施例2基本相同，区别在于：步骤（5)中收集病毒使用的保护剂 为：5g/L山梨醇、20g/L重组人血清白蛋白、20g/L鹿糖、30g/L右旋糖酐、50g/L海藻糖、lg/ L精氨酸、15g/L谷氨酸钠、5g/L尿素的199综合培养基。
[0048] 实施例4,其与实施例2基本相同，区别在于：步骤（5)中收集病毒使用的保护剂 为9g/L山梨醇、20g/L重组人血清白蛋白、30g/L鹿糖、40g/L右旋糖酐、40g/L海藻糖、2g/L 精氨酸、l〇g/L谷氨酸钠、8g/L尿素的199综合培养基。
[0049] 实施例5,其与实施例2基本相同，区别在于：步骤（5)中收集病毒使用的保护剂 为：lg/L山梨醇、30g/L人血清白蛋白、10g/L蔗糖、50g/L右旋糖酐、40g/L海藻糖、4g/L精 氨酸、5g/L谷氨酸钠、8g/L尿素的综合培养基。
[0050] 实施例6,其与实施例2基本相同，区别在于：步骤（5)中收集病毒使用的保护剂 为：10g/L山梨醇、5g/L人血清白蛋白、30g/L蔗糖、10g/L右旋糖酐、60g/L海藻糖、0. 5g/L 精氨酸、15g/L谷氨酸钠、2g/L尿素的综合培养基。
[0051] 对照实例：本实施例的步骤与实施例2相类似，区别在于：步骤（5)中收集病毒使 用的保护剂为l〇g/L明胶、30g/L蔗糖、lg/L精氨酸、15g/L谷氨酸钠、5g/L尿素的199综合 培养基。
[0052] 上述实施例仅为本发明较好的实施方式，本发明不能--列举出全部的实施方 式，凡采用上述实施例之一的技术方案，或根据上述实施例所做的等同变化，均在本发明保 护范围内。
[0053] 对上述实施实例2-4和对照实例制得的冻干水痘疫苗进行内毒素含量检测，然后 分别于2_8°C和37°C放置不同时间，检测样品稳定性（水分和病毒滴度）。
[0054] 样品中的内毒素按《中华人民共和国药典》（2010年版三部）附录ΧΠ E进行。
[0055] 样品中的水分按《中华人民共和国药典》（2010年版三部）附录VII D项进行，用 卡尔-费休氏水分测定仪检测，应不高于3. 0 %。
[0056] 病毒滴度通过蚀斑法测定，具体步骤如下：
[0057] 取人二倍体细胞MRC-5,以pH7. 4、含10%小牛血清的MEM细胞培养基接种六孔板， 置37°C、5% C02培养箱培养3天，待MRC-5细胞形成均匀、致密的细胞单层后，接种用含3% 小牛血清、5%蔗糖和1 %谷氨酸钠的PBS缓冲液稀释的病毒液0. lmL/孔，置37°C、5% C02 吸附60分钟，期间每20分钟轻轻摇动一次。吸附完毕补加 pH7. 6、含5%小牛血清的MEM 培养基维持液，3ml/孔，置37°C、5% C02培养7天，培养到期后，吸出培养液，用PBS缓冲液 洗涤细胞表面2次，加染色液lmL/孔，置室温5分钟，吸出染色液，流水冲洗晾干后计数蚀 斑形成单位。
[0058] 试验结果见以下各表：
[0059] 表1为不同实施实例生产的水痘疫苗内毒素检查结果
[0060] 表 1
[0061]
【权利要求】
1. 一种含山梨醇成分的水痘疫苗冻干保护剂，其特征在于，该保护剂的各组分及其在 冻干原液中的终浓度为：山梨醇Ι-lOg/L、人血清白蛋白5-30g/L、蔗糖10-30g/L、右旋糖酐 10-50g/L、海藻糖40-60g/L、精氨酸0· 5-4g/L、谷氨酸钠5-15g/L、尿素2-8g/L，并且所述保 护剂中不含有明胶。
2. 根据权利要求1所述的含山梨醇成分的水痘疫苗冻干保护剂，其特征在于，所述山 梨醇的终浓度为2-8g/L。
3. 根据权利要求1所述的含山梨醇成分的水痘疫苗冻干保护剂，其特征在于，所述蔗 糖终浓度为15_25g/L。
4. 根据权利要求1所述的含山梨醇成分的水痘疫苗冻干保护剂，其特征在于，海藻糖 终浓度为45-55g/L。
5. 根据权利要求1所述的含山梨醇成分的水痘疫苗冻干保护剂，其特征在于，所述人 血清白蛋白为重组人血清白蛋白。
6. 根据权利要求1所述的含山梨醇成分的水痘疫苗冻干保护剂，其特征在于，所述右 旋糖酐为右旋糖酐40。
7. -种水痘疫苗冻干保护剂的制备方法，其特征在于，在冻干过程中采用权利要求1 至6任一项所述的保护剂。
8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤： (1) 复苏MRC-5细胞：从液氮中取出冻存的MRC-5细胞，立即放入36?38°C水浴中解 冻，900?1 lOOrpm离心4?6min，弃去上层冻存液，加入新鲜培养液，轻轻混匀置36?38°C 培养2?4天至细胞长满单层；培养液为含9?11 %小牛血清、0. 8?1. 2 %谷氨酰胺的MEM 液，疫苗生产过程中不加抗生素； (2) 消化传代：待细胞长成均匀、致密的单层，倾去培养瓶中培养液，加入胰酶消化液 消化至细胞附着松动、细胞边缘卷起且细胞间的间隔加大，倒去胰酶消化液，加入新鲜细胞 培养液后吹打，得到细胞悬液，按1 : 2的比例传代扩增到新培养瓶中； (3) 反应器扩大培养：重复步骤（2)制备细胞悬液，接种14L生物反应器，其中反应器 中预先加入7?9g/L处理好的无菌微载体，接种细胞终浓度为5X 105cellS/mL，然后在 36?38°C、ρΗ7· 1?7. 3、溶氧18?22%、搅拌转速30?50rpm的条件下培养6?8天， 至细胞在微载体上长满单层； (4) 病毒接种与繁殖：取工作种子批毒种按0. 01?0. 1M0I比例，接种于培养好的 MRC-5细胞，加入维持液，调整培养温度34. 5?35. 5°C，至出现10?30%病变时，停止搅 拌，弃去维持液，用二倍以上原培养液量的Earle' s液冲洗细胞面，去除牛血清，并换以维 持液继续培养，维持液为含〇. 1 % g/mL人血白蛋白的MEM培养基； (5) 疫苗原液收获：观察细胞出现病变达80%以上时，加入保护剂收集病毒液，保护 剂是含有终浓度为：山梨醇l-l〇g/L、人血清白蛋白5-30g/L、蔗糖10-30g/L、右旋糖酐 10-50g/L、海藻糖40-60g/L、精氨酸0· 5-4g/L、谷氨酸钠5-15g/L、尿素2-8g/L的综合培养 基，将细胞培养物经_80°C冻融，经澄清过滤后即为原液； (6) 冻干：将原液分装于西林瓶中，每支0. 6mL，经半加塞后置于冻干箱内，预冻 至-44?-46 °C并在此温度保温1. 5?2. 5小时，然后抽真空至0. lmbar，同时隔板升温 至-25°C开始一次升华9?11小时，于32. 5?33. 5°C控温4. 5?5. 5小时，即完成冻干。
9.权利要求1至6任一项的保护剂用于提高冻干水痘疫苗的稳定性和安全性，但不局 限于水痘疫苗。
【文档编号】A61K47/42GK104117070SQ201310148970
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2013年4月26日 优先权日:2013年4月26日
【发明者】阮承迈, 孙卫华, 王志刚 申请人:辽宁茂康源生物科技有限公司