一种用于肺部给药的干扰素-白蛋白中空性纳米聚集颗粒的利记博彩app
【专利摘要】本发明提出了一种具有中空性结构的干扰素-白蛋白纳米聚集颗粒，制剂形式为干粉吸入剂。该颗粒圆整，表面有凹陷，显示中空性球状壳结构，空气动力学半径为3.47μm，可吸入粒子比例(FPF)为83.7％。该制剂在保持干扰素药物活性、降低给药剂量、减小副作用等方面具有一定的优势，是一种具有前景的新型干扰素干粉吸入剂。该颗粒的制备工艺为：采用吸附法和包载法制备干扰素-白蛋白纳米溶液，然后通过喷雾干燥技术制得纳米聚集颗粒，所用载体为乳糖。最优工艺参数为：入口温度：130℃，蠕动泵转速为5，压缩空气压力为0.6MPa；喷雾溶液固体含量为3％。
【专利说明】一种用于肺部给药的干扰素-白蛋白中空性纳米聚集颗粒
【技术领域】 [0001] 该发明提出了一种干扰素-白蛋白中空性纳米聚集颗粒，其用途为肺 部给药治疗病毒性肺炎，制剂形式为干粉吸入剂。该制剂由干扰素-白蛋白纳米溶液与乳 糖混合后经喷雾干燥制备而得，本发明优化了干扰素-白蛋白纳米粒的制备工艺和处方， 以及筛选了喷雾干燥工艺参数，得到了肺部沉积率高、稳定性好、具有肺部缓释特征的一种 干扰素肺部给药制剂，属于药学中纳米给药系统和生物制药。
【背景技术】 [0002] 干扰素是一种多功能的高活性蛋白质，分子量约为20000Da 【背景技术】 [1]。目前临 床上应用最广泛的是干扰素 α。作为一种广谱抗病毒剂，干扰素作用机制主要是通过与细 胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，抑制病毒复制，同时还可增强ΝΚ细胞、巨噬细胞 和Τ淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用 【背景技术】 [2]。
[0003] 1973年，Merigan等首先证实了干扰素能预防呼吸道病毒感染[3]，现在国内外不 少学者开始将干扰素 α应用于小儿病毒性呼吸道感染，在急性上呼吸道感染，喘憋性肺 炎、病毒性肺炎等方面取得了一定疗效。现已有多种干扰素产品用于呼吸道病毒感染的防 治 [4]。但现行的干扰素干粉吸入剂仍存在一些问题：（1)肺部沉积率不高，仅为20%左右
[5]。经口吸入给药后，大部分滞留于口腔和咽喉部位，造成较大部分的药物浪费；（2)干扰 素到达肺泡后快速释放，易被肺清除系统快速清除，与细胞作用时间短，需要频繁给药；(3) 干扰素的不良反应如发热、头痛、寒战等流感样症状与剂量具有相关性 [6]。
[0004] 近期研究表明，在纳米技术的基础上，通过将纳米粒溶液或纳米粒和辅料的混 合液进行喷雾干燥，可制得的中空性纳米聚集颗粒，也称多孔性纳米粒聚集颗粒（porous nanoparticle-aggregate particles, PNAPs)[7]。这种"中空颗粒"有助于提高颗粒的分散 性质，提高肺部沉积率，同时，还能发挥纳米给药系统的优势，在病灶部位缓慢释放药物可 以达到长效、降低药物不良反应等效果。2002年，Tsapis等人 [8]最先制备了这样的中空纳 米粒聚集颗粒。在Tsapis的基础上，Hadinoto等人[9' 1CI]发表了多篇关于PNAPs的研究文章。 他们首先使用了干粉制备中常用的乳糖作为辅料，分别以不载药的多种粒径（20_170nm) 的聚丙烯酸酯和二氧化硅纳米粒为模型，通过喷雾干燥，制成大的孔性空壳颗粒。这种多孔 性纳米粒聚集颗粒有利于药物的储存和吸收，将药物递送至支气管和肺泡区域，能够起到 局部或全身治疗的效果。但需引起我们注意的是，该PNAPs中用到的聚丙烯酸酯和二氧化 硅为降解缓慢甚至为不能够被生物降解的材料，其到达肺部后若不能及时被清除，很容易 造成纳米粒在肺部的沉积，引起砂肺甚至肺组织纤维化，给用药安全带来隐患。
[0005] 白蛋白是一种不具有调理作用的蛋白，有毒性低、内源性、生理相容性好等优点， 此外，白蛋白还具有在肿瘤和炎症组织中聚集的特性[11]，这些优势使其成为抗肿瘤药物 及抗炎药物传递系统的理想材料。在肺部给药干粉吸入剂中，白蛋白和二棕榈酰磷脂酰胆 碱也常用作内源性物质添加到干粉吸入剂中。如C 〇dr〇ns[12]在甲状旁腺激素（PTH)干粉吸 入剂处方中、美国Inhale公司在制备以干扰素（IFN)为主的干粉配方中均添加了白蛋白。 白蛋白纳米粒是以白蛋白为载体，包封或吸附药物，经过固化分离而形成的实心球体。20世 纪70年代已有制备自蛋白纳米粒的相关报道。经过40年的发展，白蛋白纳米粒已经成为 一种相对成熟的药物传递系统 [13]。目前人血清白蛋白紫杉醇纳米粒已经获得FDA批准。然 而，长期以来，关于白蛋白纳米粒的载药研究多集中于化学药物，对于载蛋白多肽类药物鲜 见报道，曾一度有人怀疑，白蛋白纳米粒载蛋白多肽类药物的可行性。
[0006] 综上所述，白蛋白用于肺部给药的经验为本发明奠定了良好的基础，但经文献检 索，尚未见白蛋白纳米粒应用于肺部给药的研究，更没有干扰素-白蛋白中空纳米聚集颗 粒的研究报道。本发明从理论分子相互作用的角度，通过计算分析，找到了白蛋白分子和干 扰素分子的作用区域，为白蛋白纳米粒装载干扰素提供了理论依据；继而，通过实验进一步 验证了白蛋白纳米粒载干扰素的可行性，优化得到了干扰素包封率高于70%、载药率高于 1. 25%的干扰素-白蛋白纳米粒制备工艺和处方。在此基础上，应用喷雾干燥技术，制备了 干扰素-白蛋白中空性纳米聚集颗粒作为肺部给药的干粉吸入剂，其不仅具有良好的肺部 沉积率，而且具有较高的干扰素生物活性和较高的肺部药物滞留浓度，在保持药物活性、降 低给药剂量、减小副作用等方面具有一定的优势，是一种具有前景的新型干扰素干粉吸入 剂。
【发明内容】
[0007] 1.该发明的创新点之一是从理论和实验两个方面证实了白蛋白装载干扰素形成 纳米粒的可行性。
[0008] 本发明首次系统研究了干扰素和白蛋白分子结合的可能性，在理论上使用蛋白质 对接程序在线服务ZDOCK Server (http ：//zdock. umassmed. edu/)将两个蛋白质分子进行 刚性对接，并进行了拉伸动力学的模拟计算，结果发现氢键和盐桥是白蛋白和干扰素结合 中的主要相互作用，其中白蛋白（BSA)的第503号残基GLU和干扰素（IFN)的第125号残 基ARG，BSA的第537号残基LYS和IFN的第5号残基GLU，BSA的第493号残基ASP和IFN 的第2号残基ASP更是起着至关重要的作用。在实验中，通过PH值、两种蛋白质量比例及 固化剂戊二醛的用量筛选，得到了包封率约为70%，粒径约为250nm的干扰素-白蛋白纳米 溶液。
[0009] 白蛋白装载化学药物的研究已有40余年的历史，人血清白蛋白载紫杉醇药物已 经FDA批准上市，但对于白蛋白载蛋白多肽类药物，一直是这个领域的空白地带。本发明在 理论上和实验上同时证实了白蛋白装载干扰素的可行性，为白蛋白作为纳米粒载体装载蛋 白多肽类药物提供了依据，属于新体系创新。
[0010] 2.该发明的创新点之二在于提出了具有中空结构的干扰素-白蛋白纳米聚集颗 粒及其制备工艺。
[0011] 本发明以干扰素-白蛋白纳米粒溶液为基础，与乳糖等载体混合后，制备成一定 浓度的原溶液，经对喷雾干燥参数进行优化，得到了一种具有中空结构的干扰素-白蛋白 纳米聚集颗粒及其制备工艺。
[0012] 制备工艺：将适量乳糖加入至干扰素-白蛋白纳米溶液中，配制成总固体浓度为 1 %?5%的溶液，其中干扰素-白蛋白纳米粒与乳糖的质量比例为1 : 4?1 : 8;喷雾干 燥仪器参数为：入口温度：90?130°C，出口温度：50?70°C，蠕动泵转速为5?10,氮气流 量为20?50。
[0013] 最优工艺参数为：入口温度：130°c，蠕动泵转速为5,氮气流量为50 ;喷雾溶液固 体含量为3%。
[0014] 经扫描电镜观测发现制备的干扰素-白蛋白纳米聚集颗粒具有中空结构，几何粒 径约为2. 0?4. 0 μ m，纳米粒聚集颗粒复溶效果较好，复溶系数Sf/Si接近于1，表明该聚集 颗粒复溶后粒径基本上能恢复到原纳米溶液水平。经多级撞击器测定该聚集颗粒的平均空 气动力学半径为3. 47 μ m，可吸入粒子比例FPF达到83. 7%。
[0015] 本发明所得到的干扰素-白蛋白纳米聚集颗粒未曾见报道，填补了纳米聚集颗粒 的空白，为新体系创新。本发明提出的制备工艺参数也未见相关系统性筛选的报道，属于工 艺方法创新。
[0016] 3.该发明的创新点之三在于干扰素-白蛋白纳米粒溶液的制备工艺。
[0017] 虽然曾有白蛋白装载干扰素Y的研究报道，但其没有系统地进行研究，所得到的 白蛋白干扰素载药率仅为1 μ gIFN/mgBSA，即0. 1% [14]。而且其稳定性欠佳，易于沉积聚 团。本发明在进行单因素考察的基础上，优化了 pH值、两种蛋白质量比例、固化剂用量等影 响因素，通过两种方法，即包载法和吸附法两种工艺制备了干扰素-白蛋白纳米粒溶液，包 封率约70%，载药率约为1. 25%，粒径约为250nm。制剂具有良好稳定性，4°C下放置一周， 能够重新分散，分散后平均粒径约为250nm。
[0018] 包载法制备工艺：用蒸馏水配制1%白蛋白溶液，加入一定量干扰素原液，调节pH 值7. 0,在500rpm电动搅拌下，逐滴滴加无水乙醇，然后加入适量戊二醛乙醇溶液，继续搅 拌3小时。搅拌完成后，于40°C水浴中减压蒸馏，除去乙醇，得到干扰素-白蛋白纳米粒混 悬液。
[0019] 吸附法制备工艺：用蒸馈水配制1%的白蛋白溶液，在500rpm?lOOOrpm电动搅 拌下，逐滴滴加无水乙醇，然后加入适量的戊二醛乙醇溶液，继续搅拌3小时，得到空白白 蛋白纳米粒；40°C水浴中减压蒸馏，除去乙醇，剩余的溶液用适量蒸馏水稀释后调节pH值 为5. 5,加入干扰素，持续搅拌一段时间，得到干扰素-白蛋白纳米粒溶液。
[0020] 其中关键技术为pH值，包载法为7. 0,而吸附法为5. 5,白蛋白与干扰素质量比为 80 : 1?160 : 1，固化剂选为戊二醛，其用量为0.032%?0.1%。
[0021] 4.该发明的创新点之四在于干扰素-白蛋白纳米粒与干扰素相比较具有更高的 生物活性。
[0022] 干扰素为生物活性物质，常会受到溶剂、温度、搅拌等因素的影响。因此经BSA纳 米粒载药后，有必要对其生物活性进行测定评价。
[0023] 本发明中，根据中国药典中收载的细胞病变抑制法（CPE)来测定干扰素生物活性 效价。测定结果表明，本发明干扰素经白蛋白纳米粒包载或吸附后，其抗病毒活性不但没有 因此被掩盖或丧失，反而得到一定的提高，是干扰素药物生物活性的150%。分析其原因，干 扰素抗病毒机制为干扰素通过与细胞表面的IFN特异性受体结合后，刺激产生N0,并诱导 抗病毒蛋白生成，如蛋白激酶、磷酸二酯酶、2'-5'寡腺苷酸合成酶等，从而抑制病毒蛋白的 翻译，抑制病毒繁殖。干扰素被白蛋白纳米粒包载或吸附后，有助于滞留在细胞外液中，与 细胞表面受体结合，促进了抗病毒活性的提高。
[0024] 终上所述，本发明所提出的干扰素-白蛋白纳米粒与干扰素相比较，具有更高的 生物活性，这有助于降低给药剂量、减小毒副作用，是-种极具应用前景的干扰素纳米药 物。这种提高生物活性的新制剂形式未见报道。
[0025] 5.该发明的创新点之五在于干扰素-白蛋白纳米粒在小鼠肺部给药中具有较好 的药物滞留浓度，具有缓释特征。
[0026] 本发明的干扰素-白蛋白纳米粒经小鼠气管给药后，在肺组织的分布浓度高于干 扰素组，给药9小时药物浓度为干扰素组的2. 6倍，消除速率为干扰素组的41. 4%，在肺部 滞留时间明显提高，有利于降低给药剂量和给药频率。白蛋白具有良好的生物相容性，其代 谢产物是组织的营养物质，毒性低，因此干扰素经白蛋白装载后作为肺部给药新制剂的载 体具有一定优势和良好的应用前景。 【专利附图】
【附图说明】
[0027] 附图1 ZD0CK评价体系给出的5个最优的蛋白质对接模型。灰色的是BSA，彩色的 是各个模型中IFN。IIIA区域BSA与IFN结合几率最大的区域。
[0028] 附图2 Modell和Model2中BSA和IFN之间的静电作用能（a)和范德华作用能 (b)在拉伸动力学（SMD)中随时间的变化趋势。附图2(a)表示了 Modell和Model2中BSA 和IFN之间的静电作用能随时间的变化趋势。可以看到Model2中的静电作用能（红）约 在-550kJ/mol上下波动，Modell中的静电作用能（黑）约在-350kJ/mol上下波动。在 5000ps以后，Model2中的BSA与IFN之间的静电作用能明显比Modell中更大。附图2(b) 表示了 Modell和Model2中BSA和IFN之间的范德华作用能随时间的变化趋势。Model2 中BSA和IFN之间的范德华作用能（红）在-200kJ/mol至-400kJ/mol之间波动，最后稳 定在-300kJ/mol左右。而Modell中BSA和IFN之间的范德华作用能（黑）在-50kJ/mol 至-250kJ/mol之间波动。整个过程中，Model2中的BSA与IFN之间的范德华作用能始终 比Modell中更大。综上，Model2中的BSA和IFN之间相互作用能量比Modell更大，这也 进一步证明了 Model2中BSA和IFN之间的结合方式比Modell更加合理稳定。
[0029] 附图3拉力与质心距离随时间的变化关系。从此图上还可以看出某些力的峰值与 氢键断裂的对应关系。经分析，存在氢键1 :BSA的GLU5030El-IFN-alb的ARG125HE ;氢键 2 :BSA 的 GLU5030E2-IFN-alb 的 ARG125HE。
[0030] 附图4附图4-a :GLU503-ARG125形成的氢键。附图4-b :LYS537-GLU5形成的氢 键；附图4-CASP493-ASP2形成的氢键白色的虚线表示氢键，形成氢键的原子由绿色的字母 和数字表示。白色数字表示氢键的长短，单位是又。
[0031] 附图5干扰素-白蛋白纳米粒小鼠肺部给药后，在肺组织（a)和在血（b)中的药 物浓度随时间的变化。从图中可见，干扰素-白蛋白纳米粒组在肺组织的药物浓度高于游 离干扰素组，入血浓度低于干扰素组。显示干扰素经白蛋白纳米粒装载后在肺组织有较高 的药物滞留浓度，对发挥药效具有一定积极意义。
[0032] 附图6干扰素-白蛋白纳米聚集颗粒扫描电镜图谱。从图中可见，颗粒圆整，几何 粒径约为2.0?4.0 μ m，表面凹陷，为中空球状壳结构。
[0033] 附图7干扰素-白蛋白纳米聚集颗粒的空气动力学半径分布图。Stage : 1) 8. 1 μ m， 2) 4. 4 μ m, 3) 2. 8 μ m, 4) 1. 7 μ m, 5) 0. 94 μ m, 6) 0. 55 μ m, 7) 0. 34 μ m. 【具体实施方式】
[0034] 实施例1白蛋白装载干扰素可行性的理论佐证
[0035] (1)模拟方法：
[0036] 蛋白质的对接：为了找到两个蛋白质的潜在结合位点，使用蛋白质对接程序在线 服务ZDOCK Server (http ://zdock. umassmed. edu/)将两个蛋白质讲行刚件对接。将经过 MD优化后的两个蛋白质三维结构提交至该在线服务，找到可能的潜在位点。
[0037] 蛋白质潜在位点的筛选和比较：使用GR0MACS4. 5对Modell和Model2进行30ns 的动力学模拟，优化结构，根据时间的变化筛选出最合理的结合方式。
[0038] 拉伸动力学（SMD)对结合方式的论证：固定BSA的骨架原子，以保持BSA的位置不 变，但允许BSA的侧链原子自由运动。而对于IFN则没有任何限制，骨架和侧链均可以自由 运动。将拉力作用于IFN上，沿Y轴负方向，以lnm/ns的恒定速度将IFN和BSA拉开，拉动 时间2. 8ns，以获得这个拉动过程中拉力和两个蛋白质的质心距离随时间的变化情况，寻求 拉力与相互作用位点的关系。
[0039] (2)模拟结果：
[0040] ZDOCK Server根据其评价体系，一共给出了排名前5的最优的蛋白质对接模型， 分别为此(^11，]\1〇(1612，]\1〇(1613，]\1〇(1614，]\1〇(1615。如附图1所示，灰色的是854，彩色的是各 个模型中IFN。其中Model2，Model3，Model4中的IFN都集中在BSA的IIIA区域。我们选 择IIIA区域中排名最靠前的Model2进一步分析。同时，由于Modell是排名第一的模型， 也不能随意忽略，因此将Modell和Model2 -起进行动力学模拟，作比较分析。
[0041] 经过了 30ns的分子动力学模拟以后，分析出Modell和Model2在整个MD过程中 的能量变化。Modell和Model2的静电作用能和范德华能图谱见附图2,从图中可以看出， Model2中的BSA和IFN之间相互作用能量比Modell更大，进一步证明了 Model2中BSA和 IFN之间的结合方式比Modell更加合理稳定。
[0042] 使用VMD可视化软件，通过拉伸动力学对BSA与IFN质点距离和拉力进行相关性 分析，发现了拉力与氢键的断裂之间的对应关系（附图3)，BSA的第503号残基GLU和IFN 的第125号残基形成氢键的情况如附图4所示，在这两个残基之间可以形成1至4个氢键， 其中GLU5030E1-ARG125HE和GLU5030E2-ARG125HE形成的氢键强度最大（附图4-a)。同 时，BSA的第537号残基LYS和IFN的第5号残基GLU也可以形成氢键（附图4-b)，BSA的 第493号残基ASP和IFN的第2号残基ASP之间的氢键（附图4-c)存在时间长达1450ps， 且一直保持着较强的相互作用。
[0043] BSA和IFN在形成某些氢键的过程，存在带正电的氨基和带负电的羧基，则氨基与 羧基通过静电作用相互吸引形成盐桥。盐桥也被认为有增强蛋白质之间的相互作用的效 果。
[0044] 【结论】：IFN与BSA的IIIA区域相互作用的可能性最大，IIIA区域是两者的结合 位点。氢键和盐桥是蛋白质结合中的主要相互作用。其中BSA的第503号残基GLU和IFN 的第125号残基ARG，BSA的第537号残基LYS和IFN的第5号残基GLU，BSA的第493号 残基ASP和IFN的第2号残基ASP更是起着至关重要的作用。
[0045] 实施例2干扰素-白蛋白纳米粒的制备工艺和性质
[0046] (1)包载法：
[0047] 用蒸馏水配制1 % BSA溶液，加入一定量IFN原液，调节pH值，在500rpm电动搅 拌下，逐滴滴加无水乙醇，然后加入适量戊二醛乙醇溶液，继续搅拌3小时。搅拌完成后，于 40°C水浴中减压蒸馏，除去乙醇，得到干扰素-白蛋白纳米粒混悬液。采用高速离心法测定 纳米粒的包封率，激光光散射仪测定粒径。
[0048] pH值、BSA与IFN的比例、戊二醛用量三个因素对包封率有显著影响，结果如表1 所示。
[0049] 表1.包载法中影响因素考察
[0050]
【权利要求】
1. 一种用于肺部给药的干扰素（IFN)-白蛋白（BSA)中空性纳米聚集颗粒。其特征在 于，该制剂由干扰素-白蛋白纳米粒与载体组成，具有中空的球状壳结构，干扰素-白蛋白 纳米粒分散在载体中，构成颗粒的壳，所述载体选自乳糖。
2. 根据权利要求1所述的干扰素-白蛋白中空性纳米聚集颗粒的剂型，其特征在于干 粉吸入剂。
3. 根据权利要求1所述的制剂的制备工艺，其特征在于先制备干扰素-白蛋白纳米粒 溶液，然后将适量乳糖加入至干扰素-白蛋白纳米溶液中，配制成1 %?5%的溶液，其中干 扰素-白蛋白纳米粒与乳糖的质量比例为80 : 1?160 : 1;喷雾干燥仪器参数为：入口 温度：90?130°C，蠕动泵转速为5?10,氮气流量为20?50。
4. 根据权利要求1所述的制剂的性质，其特征在于空气空力学平均粒径为3. 47 μ m，可 吸入粒子比例（FPF)高于80%，比表面积为2. 38 士 0. 23m2/g，休止角为42. 3±3. 5°，复溶 后粒径为250nm左右，复溶系数接近为1。
5. 根据权利要求3所述的干扰素-白蛋白纳米粒溶液的制备方法，其特征在于采用吸 附法制备，用蒸馈水配制1%的白蛋白溶液，在500rpm?lOOOrpm电动搅拌下，逐滴滴加无 水乙醇，然后加入0. 4%的戊二醛乙醇溶液，继续搅拌3小时，得到空白白蛋白纳米粒；40°C 水浴中减压蒸馏，除去乙醇，剩余的溶液用适量蒸馏水稀释后调节pH值为5. 5,加入干扰素 原液，4°C下持续搅拌一段时间，得到干扰素-白蛋白纳米粒溶液。
6. 根据权利要求3所述的干扰素-白蛋白纳米粒溶液的制备方法，其特征在于采用包 载法制备，用蒸馏水配制1 % BSA溶液，加入一定量IFN原液，调节pH值为7. 0,在500rpm 电动搅拌下，逐滴滴加无水乙醇，然后加入适量戊二醛乙醇溶液，继续搅拌3小时；搅拌完 成后，于40°C水浴中减压蒸馏，除去乙醇，得到干扰素-白蛋白纳米粒溶液。
7. 根据权利要求5和权利要求6所述的干扰素-白蛋白纳米粒溶液的性质，其特征在 于其包封率为70 %以上，载药率高于1. 25 %，粒径为250nm左右，贮存稳定性好，4°C贮存1 周后粒径无明显变化，生物学活性为游离干扰素的150%。
8. 根据权利要求5所述的干扰素-白蛋白纳米粒溶液的体内性质，经气管穿刺给药后， 在小鼠肺部的药物滞留浓度明显高于游离干扰素，并具有缓释特征。
【文档编号】A61K9/14GK104116712SQ201310141203
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2013年4月23日 优先权日:2013年4月23日
【发明者】谢英, 王艺辉, 刘畅, 涂盈锋, 丁源, 徐海峰 申请人:北京大学