系列低分子鱼精蛋白模拟肽及其应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及人为设计并通过人工合成的方式制备的系列鱼精蛋白模拟肽，该系列多肽分子特征是由9-20个碱性氨基酸组成，通过人工合成的方式制备成为直链多肽分子。本发明阐明的系列多肽分子具有替代鱼精蛋白拮抗肝素的抗凝血作用从而引起血浆凝集，本发明可应用在临床及生物医药领域用于取代鱼精蛋白对肝素的拮抗作用。
【专利说明】系列低分子鱼精蛋白模拟肽及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及人为设计并通过人工合成的方式制备含有氨基酸组成的直链多肽分子，其组成包含9至20个碱性氨基酸主要由精氨酸(Arg或R)组成的多肽分子。本发明阐述的多肽分子具有替代鱼精蛋白在血液中对肝素的中和与拮抗作用，可用于临床上消除或中和血液中肝素的作用从而引起血浆凝集，本发明属于生物医药领域。
技术背景
[0002]生物体的遗传基因被存储在多聚核苷酸链上，遗传基因编码着执行生物学功能的蛋白质。生物体内的蛋白质多种多样，它们行使着各种生物学功能维持生命活动。蛋白质的种类虽然多不胜举，但它们基本上都是由20个自然界存在的天然氨基酸组成。由于氨基酸的组成和排列顺序的差异导致了蛋白质的千差万别。一般来说，含有50个以上氨基酸的分子被称为蛋白质，般超过10个氨基酸的肽链被称为多肽，少于10个氨基酸的肽链被称做寡肽。目前发现最小的功能小肽只有2个氨基酸。
[0003]由于人类基因组计划的完成和人类蛋白组计划的开展，已有越来越多的蛋白质功能片段被发现并被作为药物应用到生物医药领域中来。现已在临床上得到应用的多肽药物有“催产素”、“胸腺肽α 1”、“胸腺五肽”等，有在天然肽链的基础上进行人工改构制备成为用于治疗消化道出血和肢端肥大症的多肽药物“奥曲肽”和抗凝血作用的“水蛭肽”等。蛋白质中的功能片段常常能筛选到含有几十个或小到只有二个氨基酸组成的多肽片段，它们为人工合成多肽功能片段并将它们投入应用奠定了基础。
[0004]1963年美国洛克菲勒大学的Robert Bruce Merrifield教授建立了固相多肽合成法，这是一种革命性的有机固相合成法，它可快捷，简便高效的合成多肽，在此基础上为多肽机械自动化合成奠定了基础并在60年代末年世界上首次出现多肽自动合成仪的雏形，随着技术进步及对多肽研究的需求，多肽合成仪的种类从合成量上分，可分为微克级、毫克级、克级和公斤级；从功能上分，可分为研究型、小试型、中试型、普通生产型和GMP生产型；从自动化程度上分，可分为全自动、半自动和手动型；从通道上分，可分为单通道的和多通道合成仪。R.Merrifield教授因此获得1984年诺贝尔化学奖。
[0005]如今多肽合成已成为一种商业化技术服务项目，可按照客户的需求进行多肽合成及多肽修饰等服务。
【发明内容】
[0006]心血管疾病患者在实施心外循环或支架介入的手术之前需向血管中注射抗凝药肝素，以避免在手术过程中产生血栓。但在手术完成后需要及时消除血管中的肝素避免发生流血不止的恶性事件。目前临床上用于拮抗肝素的唯一药物是鱼精蛋白，到目前为止还未有其它可拮抗肝素的鱼精蛋白替代药物出现。 [0007]使用鱼精蛋白的缺点或弊端:
[0008]1.鱼精蛋白是从鲑鱼、鳟鱼、鲱鱼的成熟精子的细胞核中提取的蛋白，它包含的是一类蛋白分子群，其分子量在8000道尔顿以下，主要分子区间在4000-6000道尔顿范围，因此严格地说鱼精蛋白不是单一分子的纯蛋白制品；
[0009]2.由于鱼精蛋白成品是非均一态的分子群，因此其拮抗肝素的作用量随制备鱼精蛋白的批次不同而不同，其质量难以达到均一性及一致性；
[0010]3.鱼精蛋白是从鱼的成熟精子中提取，从生产原料的资源角度限制并制约了鱼精蛋白的出产。
[0011]4.鱼精蛋白是外源大分子蛋白，人体会对其产生过敏反应，尤其对再次使用鱼精蛋白的病人可能会造成重大医疗事故，存在临床使用的风险。
[0012]鉴于以上问题，本发明阐述通过人为设计并人工合成的方式制备可取代鱼精蛋白的多肽分子(鱼精蛋白模拟肽)，使得鱼精蛋白模拟肽具有以下优势可取代鱼精蛋白在临床上的应用:
[0013]1.本发明阐述的鱼精蛋白模拟肽是人为设计的多肽分子，是由单纯天然碱性氨基酸组成的多肽分子，具有明确的氨基酸组成及分子序列；
[0014]2.鱼精蛋白模拟肽通过人工合成的方式在短时间、大批量、高纯度地制备完成，不仅摆脱了使用天然鱼类资源的问题又满足了临床大批量需求的需要。
[0015]3.本发明阐述的 鱼精蛋白模拟肽的分子量比鱼精蛋白小，其分子量在1000-2000之间，分子单一，肽纯度可达>99%，达到肽类药物制备的国际纯度标准，降低了临床使用的致敏率，因此比使用鱼精蛋白具有更好的安全性。
[0016]4.由于鱼精蛋白模拟肽是由单一分子构成，因此在质量标准的建立及检测、中和肝素的使用剂量将更加严谨和精确。
【具体实施方式】
[0017]为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合实施例对依据本发明提出的对多肽产物的设计方式和具体应用实施方式、特征及其功效做以下说明。
[0018]1963年美国科学家R.B.Merrifield发明创立了将目的肽的羧基端氨基酸的羧基端(C端)固定在不溶性树脂上，树脂上结合的氨基酸的氨基端(N端)与有待连接的氨基酸的羧基端进行缩合反应达到延长肽链的固相合成法。多肽合成的顺序是从多肽的羧基端(C端)开始逐个氨基酸缩合连接向肽段的氨基端(N端)方向逐个延伸。当进行氨基酸的羧基接合反应时要将其氨基和侧链基团保护起来避免发生反应，目前常用的有叔丁氧羰基(Boc)保护法和芴甲氧羰基(Fmoc)保护法，因此每连接上一个氨基酸就要经历一次以结合在固相载体上的氨基酸作为氨基的脱保护基并同过量的下一个有待连接的氨基酸的活化羧基发生缩合反应延长肽链。通过这样的步骤反复多次地进行下去，即达到缩合一>洗涤一>去保护一> 中和和洗涤一>下一轮缩合(再接上一个氨基酸)，直至达到所需要合成的肽链长度。多肽合成完成后再将合成的多肽产物从固相树脂上裂解下来，经过高效液相色谱的纯化最终得到合成产物。基于以上的原理，多肽合成可以是手工操作合成，也可以采用多肽合成仪经过输入合成序列和程序自动化合成。
[0019]目前多肽合成的商业服务可根据客户的特定要求提供合成产物，在此只着重阐述多肽分子的氨基酸序列设计和应用。关于多肽合成的具体细节和原理在此不再累叙，请参见由盛树力主编，科学技术文献出版社(1998年)出版的“多肽激素的当代理论和应用”一书。
[0020]实施例1
[0021]试验目的:
[0022]检测合成的系列链长鱼精蛋白模拟肽在体外对血浆中肝素抗凝的拮抗作用。所合成的多肽系列及对肝素的中和作用如下:
[0023]实验原理:
[0024]本次实验主要是针对7种小分子鱼精蛋白模拟肽拮抗肝素的活性进行实验。肝素拮抗剂的原理是鱼精蛋白所带正电荷中和与抗凝血酶III(AT-1II)结合的肝素的负电荷，从而把抗凝血酶III(AT-1II)释放出来，活化II a、IXa、Xa、XIa、XIIa凝血因子，促使凝血激活酶的形成；使凝血酶原变成凝血酶，加速纤维蛋白原变成纤维蛋白。
[0025]实验材料:
[0026]采用固相合成的方式合成系列多肽如标识所示，系列鱼精蛋白拮抗肽(R9、R15、R467、R779、R1081、R1092、R1145)，纯度均> 98%，批号20130321，水溶性良好，水溶分装后
经冷冻干燥呈白色絮状物。
[0027]肝素钠，国药集团化学试剂有限公司，批号F20110919，比活150U/mg
[0028]硫酸鱼精蛋白注射液，生产厂家:北京悦康凯悦制药有限公司，国药准字H11020246。09121002，有效期至 2015.09。
[0029]新西兰兔2只，大鼠5只，购自军事医学科学院实验动物中心。
[0030]新鲜人全血来源于研究室内部，女性成年健康自愿者。
[0031]实验步骤:
[0032]1.准确称取一定量的肝素钠0.02571g，加入生理盐水12.86ml，充分混合均匀，配置肝素钠的浓度为:2mg/ml ;取肝素拮抗肽(R3、R5、R7、R9、R15和R20)各一瓶，加入生理盐水，肝素拮抗肽系列化合物的终浓度为lmg/ml。
[0033]2.实验管中，取50mL EP管4只，分为2组，分别加入ImL和2mL的2mg/ml的肝素钠(活性为≥150U/mg)，全血加入EP管刻度，即每毫升全血中肝素的量为6U和12U，混合均匀。另取2ml EP管，每管中加入Iml的全血，设为不含肝素的空白对照。
[0034]3.取上述每管中含肝素6U组EP管，加入系列浓度的不同分子大小的鱼精蛋白模拟肽，混合均匀，计时，放入37°C水浴箱中孵育，每间隔10秒倾斜一次EP管，观察血液是否凝固。记录血凝时间。
[0035]数据处理:
[0036]记录肝素抗凝血。加入系列鱼精蛋白模拟肽后的凝集时间，并与非肝素抗凝的血浆凝集试验设为对照凝集时间，计算各凝集试验的平均值，以加入模拟肽的nmol浓度比上中和IIU肝素作为模拟肽的抗肝素能力指数(抗肝素能力指数=多肽/肝素，nmol/U)。
[0037]实验结果:
[0038]表1.大鼠肝素化全血中系列鱼精蛋白模拟肽体外中和肝素作用试验结果
[0039]
【权利要求】
1.本发明阐述的系列多肽分子，其特征为由9-20个碱性氨基酸组成的直链多肽分子，包括由精氨酸(Arg，R)或赖氨酸(Lys，K)或组氨酸(His，H)组成的直链多肽分子。
2.本发明阐述的多肽分子包含9至20个碱性氨基酸的多肽分子，它们可以是由9-20个任意碱性氨酸组成的多肽分子。
3.本发明阐述的多肽分子包含9至20个碱性氨基酸的多肽分子，它们可以是由9-20个单纯精氨酸组成的多肽分子，可以是其中任意一个精氨基酸被替换为组氨酸(His或H)的多肽分子。
4.本发明阐述的多肽分子包含9至20个碱性氨基酸的多肽分子，它们可以是由9-20个赖氨酸组成的多肽分子，可以是其中任意一个赖氨基酸被替换为组氨酸(His或H)的多肽分子。
5.本发明阐述的多肽分子包含9至20个碱性氨基酸的多肽分子，它们可以是由9-20个组氨酸组成的多肽分子。
6.本发明所阐述的系列多肽分子具有替代鱼精蛋白在临床用以中和、消除或拮抗血液中肝素的作用从而引起血浆凝集。
7.本发明所阐述的系列多肽分子在临床中替代鱼精蛋白的作用，用于对肝素的拮抗相关领 域。
【文档编号】A61P7/04GK103739674SQ201310109830
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年4月1日 优先权日:2013年4月1日
【发明者】窦桂芳, 韩苏, 孟志云, 朱晓霞, 甘慧, 顾若兰, 吴卓娜, 刘桃云, 李俭 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所, 韩苏