专利名称：一种诱导多发性骨髓瘤细胞线粒体凋亡的药物组合物的利记博彩app
技术领域：
本发明属生物制药领域，具体涉及一种用于诱导多发性骨髓瘤细胞线粒体凋亡发生的药物组合物。
背景技术：
多发性骨髓瘤是骨髓浆细胞异常增生的恶性肿瘤，其发病率居恶性血液肿瘤的第二位。传统化疗药物、靶向药物以及外周血造血干细胞移植是多发性骨髓瘤主要治疗方法，但其疗效欠佳且易耐药复发，现阶段多发性骨髓瘤仍是一种不可治愈的恶性血液肿瘤。因此，发展新型安全有效的治疗方法以提高多发性骨髓瘤患者生存期具有非常重要的意义。近年三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)单独或与其他药物联合应用治疗多发性骨髓瘤取得了一定的进展，但其总体疗效不如急性早幼粒细胞白血病等恶性血液病显著。主要原因是多发性骨髓瘤好发于中老年(中位发病年龄70岁)，其骨髓组织发生不同程度的病变，多数患者对常规剂量的三氧化二砷治疗产生骨髓抑制、感染、出血等现象。因此，设计安全有效的药物组合方案，提高三氧化二砷抗多发性骨髓瘤的作用效应并减少其对正常骨髓细胞的抑制作用，是当前亟待解决的问题。促凋亡蛋白Bax和Bak在肿瘤细胞线粒体凋亡过程中发挥关键的正调控作用，Bax和Bak转运至线粒体，促进线粒体通透性转运孔(mitochondrial permeabilitytransition pore,MTP)开放和线粒体凋亡发生。抗凋亡分子Bcl_2和survivin在肿瘤细胞线粒体凋亡过程中发挥关键的负调控作用，Bcl-2与促凋亡蛋白Bax结合后，抑制线粒体通透性转运孔(mitochondrial permeability transition pore, MTP)形成和线粒体凋亡发生；survivin直接抑制凋亡终末效应酶Caspase-3和Caspase-7的活性以阻断细胞凋亡发生。本发明人发现As2O3单独作用骨髓瘤细胞U266后,抗凋亡蛋白Bcl-2和survivin表达上调，隐丹参酮单独作用骨髓瘤细胞U266后，抗凋亡蛋白Bcl-2和survivin的表达水平未发生明显变化，而As2O3和隐丹参酮联合作用Bcl-2和survivin显著下调。同时As2O3和隐丹参酮联合作用骨髓瘤细 胞U266后，促凋亡蛋白Bax和Bak从胞浆向线粒体转移定位增力口，细胞色素C由线粒体向胞浆释放增加，而As2O3或隐丹参酮单独用药组Bax和Bak从胞浆向线粒体转移定位以及细胞色素C由线粒体向胞浆释放未发生明显变化。进一步研究发现，线粒体凋亡通路标记蛋白剪切型Caspase 9、Caspase 3和PARP表达水平明显上调,而As2O3或隐丹参酮单独用药组剪切型Caspase 9,Caspase 3和PARP未发生明显变化。以上结果说明As2O3和隐丹参酮联合应用可协同诱导骨髓瘤细胞U266线粒体凋亡发生。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于诱导多发性骨髓瘤细胞线粒体凋亡发生的药物组合，由As2O3和隐丹参酮组成，且As2O3:隐丹参酮=(0.25 I) iiM:(10 20) PM。优选以As2O3:隐丹参酮=0.5 ii M: 15 ii M组合。本发明提供的隐丹参酮是从唇形科植物丹参干燥根及根茎中分离纯化获得的二萜醌类化合物，其化学结构为:
本发明的另一个目的是提供所述的一种诱导多发性骨髓瘤细胞线粒体凋亡的药物组合物在制备诱导多发性骨髓瘤细胞线粒体凋亡的药物中的应用。本发明采用As2O3和隐丹参酮联合诱导骨髓瘤细胞线粒体凋亡作用影响进行体外实验，结果显示在(0.25 I) iiM As2O3:( 10 20) U M隐丹参酮的选定剂量范围内，两者联合应用具有协同抑制骨髓瘤细胞增殖的作用，随着作用浓度的增高，协同抑制骨髓瘤细胞增殖的作用逐渐增强。I U M As2O3单独应用或与(10 20) ii M隐丹参酮联合应用会对原代正常骨髓细胞增殖活性产生不同程度的抑制作用，随着作用浓度的增高，原代正常骨髓细胞增殖活性抑制作用逐渐增强。20 ii M隐丹参酮单独应用或与(0.25 I) ii M As2O3联合应用同样会对原代正常骨髓细胞增殖活性产生不同程度的抑制作用，随着作用浓度的增高，原代正常骨髓细胞增殖活性抑制作用逐渐增强。0.5uM As2O3和15 ii M隐丹参酮联合应用不仅具有较强的抗骨髓瘤作用，而且对原代正常骨髓细胞的增殖活性基本无影响。因此，本发明人选择0.5 ii M As2O3和15 ii M隐丹参酮联合应用作为安全有效的抗骨髓瘤药物组合。本发明对0.5iiM As2O3和15iiM隐丹参酮联合应用药物组合诱导骨髓瘤细胞凋亡进行相关作用机理研究，结果显示该组合药物能显著抑制骨髓瘤细胞U266抗凋亡蛋白Bcl-2和survivin的表达水平,增加促凋亡蛋白Bax和Bak从胞衆向线粒体转移定位以及细胞色素C由线粒体向胞浆释放，上调线粒体凋亡通路标记蛋白剪切型Caspase 9、Caspase 3和PARP的表达水平。因此，As2O3和隐丹参酮组合物能有效诱导骨髓瘤线粒体凋亡发生，在制备诱导骨髓瘤细胞凋亡药物中具有广阔的应用开发前途。
图1是隐丹参酮(CPT)和三氧化二砷(iAsm)体外联合应用对骨髓瘤细胞U266凋亡标记蛋白的影响。 图2是隐丹参酮(CPT)和三氧化二砷(As2O3)联合应用对骨髓瘤细胞U266抗凋亡蛋白Bcl-2和survivin表达水平的影响。图3是隐丹参酮(CPT)和三氧化二砷(As2O3)联合应用对骨髓瘤细胞U266促凋亡蛋白Bax线粒体转移定位的影响。图4是隐丹参酮(CPT)和三氧化二砷(As2O3)联合应用对骨髓瘤细胞U266促凋亡蛋白Bak线粒体转移定位的影响。图5是隐丹参酮和三氧化二砷(As2O3)联合应用对骨髓瘤细胞U266细胞色素C线粒体释放的影响。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例1:隐丹参酮和三氧化二砷联合应用对骨髓瘤细胞U266增殖活性的影响 骨髓瘤细胞U266 (购自中国科学院细胞库)在含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640 (购
自Gibco)中培养(37°C、5% C02、饱和湿度)，取第四代细胞按4 XioVml的浓度接种200 U I于96孔培养板。设定对照组、隐丹参酮(购自成都曼斯特生物技术有限公司)组、三氧化二砷组、二者合用组及溶剂二甲基亚砜(DMSO)空白对照组，每组均做3复孔。待细胞生长密度达60-70%，分别加入隐丹参酮(10、15或20 11] )、三氧化二砷(0.25、0.5或1 y M)以及隐丹参酮和三氧化二砷的联合应用组，继续培养24小时后，加入5 mg/ml的四甲基偶氮唑盐(MTT)20 溶液，继续培养4小时后，终止培养，离心去除培养液，每孔加入150 U IDMS0,振荡10 min后,在Thermo Varioskan Flash全自动酶标仪上选择波长490 nm测定各孔吸光值(A值)，上述实验重复3次。根据A值计算细胞抑制率，计算公式为:细胞抑制率(％)=(阴性对照组A值-加药组A值)/阴性对照组A值X 100%。结果参见表1，隐丹参酮10、15 PM或三氧化二砷0.25、0.5 U M单独作用24小时均对骨髓瘤细胞U266无明显增殖抑制作用，但两者合用可见明显的协同抑制效应，其中15V- M的隐丹参酮与0.5 V- M的三氧化二砷联合应用的抑制率最大,达66±8.9% ;隐丹参酮20 UM或三氧·化二砷I U M单独作用24小时对骨髓瘤细胞U266增殖具有一定的抑制作用，当20 PM的隐丹参酮与0.25 PM或0.5 U M的三氧化二砷联合应用可见显著的增殖抑制效应(56.1±10.6%和80.4±16.8%)，1 y M的三氧化二砷与10 yM或15 PM的隐丹参酮联合应用亦可见显著的增殖抑制效应(81.9±10.3%和92.2±6.7%)。
权利要求
1.一种诱导多发性骨髓瘤细胞线粒体凋亡的药物组合物，其特征是:该药物由As2O3和隐丹参酮组成，且As2O3:隐丹参酮=0.25 I ii M: 10 20 ii M。
2.根据权利要求1所述的一种诱导多发性骨髓瘤细胞线粒体凋亡的药物组合物在制备诱导多发性骨髓瘤细胞线粒体凋`亡的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种诱导多发性骨髓瘤细胞线粒体凋亡发生的药物组合，由0.25～1μMAs2O3和10～20μM隐丹参酮组成。本发明实验证明三氧化二砷和隐丹参酮联合作用显著诱导骨髓瘤细胞U266发生凋亡，其作用机制是抗凋亡蛋白Bcl-2、survivin和XIAP表达下调，促凋亡蛋白Bax和Bak从胞浆向线粒体转移定位增加，细胞色素C由线粒体向胞浆释放增加，线粒体凋亡通路标记蛋白Caspase9、Caspase3和PARP活化，进而诱导骨髓瘤细胞U266发生线粒体凋亡。本发明所述的药物组合物通过促进线粒体凋亡而达到抑制多发性骨髓瘤细胞的目的，因此As2O3和隐丹参酮组合物在制备诱导骨髓瘤细胞凋亡药物中具有广阔的应用开发前途。
文档编号A61P35/00GK103099816SQ20131004202
公开日2013年5月15日 申请日期2013年2月4日 优先权日2013年2月4日
发明者那仁满都拉, 陈喆, 刘培, 徐石 申请人:浙江大学