用于炎性病症治疗的重组人α-1-抗胰蛋白酶的利记博彩app

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【专利摘要】在一个方面，本公开涉及包含α-1-抗胰蛋白酶(AAT)的组合物及其制备。在一些实施方案中，AAT是重组产生的。本公开还涉及给药包含α-1-抗胰蛋白酶(AAT)的组合物的方法。
【专利说明】用于炎性病症治疗的重组人α-1-抗胰蛋白酶
[0001]相关申请
[0002]本申请依据35U.S.C.§ 119要求于2011年12月19日提交的美国临时专利申请N0.61/577，289的优先权，其全部内容引入本文作为参考。

【技术领域】
[0003]本发明涉及治疗炎性病症，其包括哮喘、气肿、慢性阻塞性肺病和慢性肉芽肿性肺病，即结节病。特别地，本发明涉及使用重组人α-1-抗胰蛋白酶治疗这些病症。

【背景技术】
[0004]重组蛋白质为许多危及生命的疾病提供有效治疗。使用闻表达水平的系统例如细菌、酵母菌和昆虫细胞产生的治疗性蛋白质仅限于没有广泛翻译后修饰的小的蛋白质。产生许多所需要的翻译后修饰的哺乳动物细胞系统，由于需要复杂且高级的培养系统而更加昂贵。而且，在这些高级的细胞培养方法中，降低的蛋白质表达水平是常见的。一些哺乳动物细胞培养系统的局限性已通过在转基因哺乳动物或鸟类中重组蛋白质的表达而被克服。蛋白质产生于各种转基因动物的乳腺中，该动物具有的表达水平以每年数百公斤蛋白质的规模适用于成本效益生产。
[0005]发明概沭
[0006]在一个方面，本公开提供了重组人α-1-抗胰蛋白酶(AAT)。在一个方面，重组产生的重组人α -1-抗胰蛋白酶(AAT)给药于需要AAT的患者。
[0007]出乎意料地，已发现在肺中给药重组人α -1抗胰蛋白酶(AAT)，相比给药相应剂量的血浆衍生的ΑΑΤ，能提供较高效力。不受任何特定理论的限制，认为相比于血浆衍生的AAT的糖基化性质，在转基因山羊的奶中产生的重组AAT的糖基化性质提供了更高的肺中蛋白质定位。
[0008]在一个方面，本公开提供了包含α-1-抗胰蛋白酶(AAT)的组合物，其中该AAT是重组产生的。在一些实施方案中，AAT产生于非人类哺乳动物的乳腺上皮细胞中。在一些实施方案中，AAT产生于转基因非人类哺乳动物中。在一些实施方案中，所述非人类哺乳动物是山羊、绵羊、野牛、骆驼、牛、猪、兔、水牛、马、大鼠、小鼠或美洲驼羊。在一些实施方案中，该非人类哺乳动物是山羊。在一些实施方案中，重组产生的AAT与血浆衍生的AAT相比，其具有增强的脱氧己糖糖基化作用。在一些实施方案中，已将重组产生的AAT修饰，以增强其在AAT糖基序上的唾液酸化作用。
[0009]在一个方面，本公开提供了包含AAT的组合物，其中所述AAT具有高水平的脱氧己糖糖基化作用。在一个方面，本公开提供了包含AAT的组合物，其中所述AAT在AAT糖基序上具有高水平的唾液酸化作用。在一个方面，本公开提供了包含AAT的组合物，其中所述AAT具有高水平的脱氧己糖糖基化作用以及在AAT糖基序上具有高水平的唾液酸化作用。
[0010]在本文所述的任意AAT组合物的一些实施方案中，所述组合物还包含奶。在本文所述的任意AAT组合物的一些实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的载体。
[0011]在一个方面，本公开提供了产生本文所述组合物的AAT的乳腺上皮细胞。在一个方面，本公开提供了包含本文公开的乳腺上皮细胞的转基因非人类哺乳动物。
[0012]在一个方面，本公开提供了给药至有此需要受试者本文公开的AAT组合物的方法。在一些实施方案中，所述受试者具有α-1-抗胰蛋白酶缺乏症。在一些实施方案中，所述受试者具有炎性病症。在一些实施方案中，所述炎性病症为气肿。在一些实施方案中，所述组合物以30mg/kg至约60mg/kg AAT的剂量给药。在一些实施方案中，所述组合物由静脉给药。在一些实施方案中，所述组合物通过吸入给药。
[0013]在一个方面，本公开提供了降低肺内弹性蛋白酶活性的方法，该方法包括给予受试者足够量的本文公开的AAT组合物以降低肺内弹性蛋白酶活性。

【专利附图】

【附图说明】
[0014]附图是示例性的，并且不是实施本发明所必须。
[0015]附图1描述了大鼠肺泡灌洗(BAL)样品的考马斯染色(Coomassie staining)(附图1A)和从BAL得到的AAT的染色的定量(附图1B和1C)。该样品依据从BAL得到的白蛋白进行标准化。
[0016]附图2描述了 GR0/CINC-1酶联免疫吸附测定的水平(生长调节基因产物/细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子)，该水平与IL-8和用AAT处置的大鼠的支气管肺泡灌洗样品中的炎症模型相关。
[0017]附图3描述了对照AAT(电泳泳道2-5)和支气管肺泡灌洗得到的AAT(电泳泳道7-10)的弹性蛋白酶活性。弹性蛋白酶的结合由AAT的分子量的增加表征。
[0018]附图4A和B描述了通过获自大鼠支气管肺泡灌洗的AAT的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS page)测定出的检测量，该大鼠以30mg/kg的AAT剂量进行给药。
[0019]附图5描述了通过获自大鼠支气管肺泡灌洗的AAT的点杂交分析(Dot blotanalysis)测定出的检测量,该大鼠以30mg/kg的AAT剂量进行给药。
[0020]附图6描述了在暴露于30mg/kgAAT的大鼠中的AAT的药代动力学。
[0021]附图7描述了大鼠血中和肺中的AAT的相对水平，该大鼠以3mg/kg或30mg/kg的AAT剂量进行给药。
[0022]附图8描述了重组产生的AAT的糖基化作用模式。
[0023]附图9描述了血浆衍生的AAT的糖基化作用模式。
[0024]附图1OA和B描述了通过获自大鼠支气管肺泡灌洗的AAT的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定出的检测量，该大鼠以3mg/kg的AAT剂量进行给药。
[0025]附图11描述了通过获自大鼠支气管肺泡灌洗的AAT的点杂交分析测定出的检测量，该大鼠以3mg/kg的AAT剂量进行给药。
[0026]附图12描述了 GR0/CINC-1酶联免疫吸附测定的水平(生长调节基因产物/细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子)，该水平与IL-8和用AAT处置的大鼠的支气管肺泡灌洗样品中的炎症模型相关。
[0027]附图13描述了暴露于30mg/kgAAT的大鼠的BAL分析。
[0028]附图14描述了暴露于3mg/kgAAT的大鼠的BAL分析。
[0029]附图15描述了暴露于30mg/kgAAT的大鼠的肺研究的药代动力学。
[0030]附图16描述了暴露于3mg/kgAAT的大鼠的肺研究的药代动力学。
[0031]附图17描述了抗弹性蛋白酶活性/倍数。
[0032]附图18描述了根据本文提供的方法进行的实验的结果与设计。
[0033]发明详沭
[0034]在一个方面，本公开提供了包含重组产生的α-1-抗胰蛋白酶(AAT)的组合物以及将重组产生的AAT给药至有此需要的受试者的方法。
[0035]α-1-抗胰蛋白酶是分子量为53，000的糖蛋白，其分子量由沉降平衡离心测定的。该糖蛋白由多肽单链组成，其中多个寡糖单元(糖基序)共价结合至所述多肽单链。人α-1-蛋白酶抑制剂的功能是通过内源性丝氨酸蛋白酶控制组织的破坏。AAT是自杀抑制剂，其是通过以下进行操作的:其在与酶(主要是弹性蛋白酶)结合后，与所述酶形成稳定的四面体中间体。裂解反应的完成是依赖于C-端肽(离去基团)和活性位点丝氨酸的水解。在大多数情况下，发生第一次水解，并且该酶被转运通过β折叠并被“打碎”，使得破坏了活性位点并致使酶失活进而无法完成第二水解，这使得该酶被束缚在AAT上。如果确实发生了第二次水解，AAT从酶上释放，所述AAT少了 36个氨基酸的肽。α -1-蛋白酶抑制剂抑制人胰腺弹性蛋白酶和白细胞弹性蛋白酶。参见例如，Pannell等人，B1chemistry13, 5339 (1974) ； Johnson 等人，B1chem B1phys Res Comm, 7233 (1976) ；Del Mar 等人,B1chem B1phys Res Commun, 88, 346 (1979)；和 Heimburger 等人,Proc.1nt.Res.Conf.Proteinase Inhibitors 1st, 1-21 (1970)。
[0036]α -1-蛋白酶抑制剂的遗传缺陷，其占血浆中的胰蛋白酶抑制能力的90%，已证明是与肺气肿的过早发展相关。与气肿相关的弹性蛋白降解可能由于弹性水解酶与自然发生的组织和血浆蛋白酶抑制剂之间的局部不平衡所导致。目前，AAT缺乏的受试者用由献血者的血浆制备的α-1-抗胰蛋白酶(血浆衍生的AAT)治疗浓缩物进行治疗。
[0037]在一个方面，本公开提供了给药包含重组产生的AAT的组合物至有此需要的受试者的方法。在一个方面，本公开提供了降低肺内弹性蛋白酶活性的方法，该方法包括给药足够量的包含重组产生的AAT的组合物至受试者以降低肺内弹性蛋白酶活性。
[0038]出乎意料地发现，重组产生的AAT(rhAAT)，例如产生于转基因动物中的AAT，给药后，相比于相应剂量的血浆衍生的AAT，其以更高的水平隔离在肺中。如本文所述，给予大鼠血浆衍生的AAT、rhAAT或唾液酸化的rhAAT，在这些大鼠中，发现在支气管肺泡灌洗(BAL)液中的rhAAT和唾液酸化的rhAAT比血浆衍生的AAT具有更高水平。其在肺中的隔离更加惊人，因为血液中rhAAT和唾液酸化的rhAAT的浓度更低。例如,如本文所述,给药两小时后，重组产生的AAT以高于血浆衍生的AAT的浓度的约三倍的浓度存在于BAL中。如果考虑到在同一时间,血液中重组产生的AAT的浓度约低于血浆衍生的AAT浓度的六倍，则上述实验结果将更为惊人。血液中重组产生的AAT的浓度更低，可能是由于相比于血浆衍生的AAT，重组产生的AAT在血液中具有更高的清除率。唾液酸化的重组体AAT相比于血浆衍生的AAT，其在肺内的隔离效果更加显著。唾液酸化的AAT相比于未唾液酸化的AAT具有较低清除率，并因此能在系统中保持较高水平的重组体AAT。
[0039]本文还发现，从BAL得到的重组体AAT能结合弹性蛋白酶，并因此保持治疗肺病的有效性。此外，隔离在肺中的重组体AAT相比于对照实验的结果，不能引起任何更多的炎症。因此，重组产生的AAT具有意想不到的性质，这可以使其较好地适于治疗肺部病症和/或炎性病症。
[0040]应当理解的是，给药至受试者的AAT通常应为与物种相适应的(species-appropriate)。换句话说,如果将AAT给药至人,则该AAT可能为人AAT。然而，可以给药从其他物种得到的AAT (例如，将猪AAT给药至人)，只要从不同物种得到的AAT仍然能实现其生物学作用(例如，结合人弹性蛋白酶)，且不引起不适当的免疫反应。
[0041]在一个方面，本公开提供了重组产生的AAT的组合物，其中所述重组产生的AAT相比于血浆衍生的AAT具有增强的脱氧己糖糖基化作用。在一个方面，本公开提供了重组产生的AAT的组合物，其中所述重组产生的AAT已经被修饰，以增加在AAT糖基序上的唾液酸化作用。
[0042]重组产生的AAT与血浆衍生的AAT具有相同的氨基酸序列。然而，重组产生的AAT与(人)血浆衍生的AAT具有不同的糖基化作用模式，如实验部分所示。在一些实施方案中，所述重组体AAT产生于非人乳腺上皮细胞。产生于非人乳腺上皮细胞的重组体AAT具有糖基化作用模式，该糖基化作用模式尤其是由存在于这些乳腺上皮细胞的糖基化作用酶的广泛性和相互作用所决定。
[0043]尽管不受限于特定的机理，人们认为重组产生的AAT被隔离在肺中，因为其相比于血楽■衍生的AAT对存在于肺内的糖受:体(结合AAT糖蛋白和/或AAT糖蛋白的糖基序的受体)具有更高的亲和力。而且，尽管不受限于特定的机理，少量的存在于重组体AAT上的暴露的N-乙酰葡萄糖胺(该AAT能够结合存在于肺中的甘露糖受体)可以导致肺内重组体AAT的聚集。或者，或此外，脱氧己糖(其存在于重组产生的AAT的糖基序的量比在血浆衍生的AAT的量更大)可以导致肺内隔离。
[0044]在一个方面，本公开提供了包含AAT的组合物，其中所述AAT具有高水平的脱氧己糖糖基化作用。在一个方面，本公开提供了包含在AAT糖基序上具有高水平的唾液酸化作用的AAT的组合物。在一个方面，本公开提供了包含AAT的组合物，其中所述AAT具有高水平的脱氧己糖糖基化作用和在AAT糖基序上的高水平的唾液酸化作用。
[0045]应进一步认识到，具有与重组产生的AAT糖基化作用模式相同的AAT也可以用于本文描述的方法。因此，在一些实施方案中，本公开提供了包含与重组产生的AAT糖基化作用模式相同的非重组产生的AAT的组合物和给药方法。因此，在一些实施方案中，本公开提供了包含暴露的N-乙酰葡萄糖胺的AAT的组合物和给药方法。在一些实施方案中，本公开提供了具有高水平的脱氧己糖糖基化作用的AAT的组合物和给药方法。在一些实施方案中，本文使用的高水平的脱氧己糖糖基化作用是指其为血浆衍生的AAT的脱氧己糖糖基化作用水平的1.1倍或更多、1.2倍或更多、1.3倍或更多、1.5倍或更多、2倍或更多、5倍或更多、10倍或更多、50倍或更多，或100倍或更多。在一些实施方案中，本文使用的高水平的脱氧己糖糖基化作用是指AAT的数目中的至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90%最多100%的糖基序含有脱氧己糖部分。在一些实施方案中，本公开提供了在AAT糖基序上具有高水平的唾液酸化作用的AAT的组合物和给药方法。在一些实施方案中，本文使用的在AAT糖基序上高水平的唾液酸化作用是指AAT的数目中，至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %最多100 %的糖基序为唾液酸化的。
[0046]修饰糖蛋白(例如AAT)的糖基化作用基序的方法是本领域已知的。例如，血浆衍生的或大肠杆菌产生的AAT可用一种或多种糖基化作用酶进行酶处理，以增加N-乙酰葡萄糖胺和/或脱氧己糖的量。例如，用神经氨酸酶，然后用β_半乳糖苷酶处理AAT，可以增加暴露的N-乙酰葡萄糖胺的量。
[0047]用于产生AAT的非人乳腺上皮细胞
[0048]在一个方面，本公开提供了产生AAT的乳腺上皮细胞。在一个方面，本公开提供了产生AAT的转基因非人类哺乳动物。在一个方面，本公开涉及产生AAT的哺乳动物乳腺上皮细胞。本文提供在哺乳动物乳腺上皮细胞中产生糖基化的AAT的方法。这可以通过培养乳腺上皮细胞(体外或离体)实现。这可以在转基因动物(体内)中实现。
[0049]在一些实施方案中，所述哺乳动物乳腺上皮细胞在转基因动物中。在一些实施方案中，对所述哺乳动物乳腺上皮细胞进行工程化，以在例如小鼠或山羊的转基因动物的奶中表达ΑΑΤ。为了实现这一目标，例如，编码重组体蛋白的基因的表达可以例如受控于山羊β_酪蛋白调控元件。在小鼠和山羊奶中表达重组体蛋白早有先例(参见，例如，美国专利申请US-2008-0118501-A1)。在一些实施方案中，优化表达以得到产生乳蛋白的单一乳腺管上皮细胞。
[0050]能够产生重组体AAT的转基因动物可根据本领域已知的方法产生(参见，例如，美国专利N0.5，945，577和美国专利申请US-2008-0118501-A1)。这些方法引入本文。适合于转基因表达的动物包括但不限于山羊、绵羊、野牛、骆驼、牛、猪、兔、水牛、马、大鼠、小鼠或美洲驼羊。合适的动物还包含牛属动物、山羊属动物、绵羊属动物和猪属动物，其分别涉及不同种类的牛、山羊、绵羊和猪。合适的动物还包括有蹄类动物。本文所用的“有蹄类动物”为或指的是有蹄的，通常是食草四足哺乳动物，包括但不限于，绵羊、猪、山羊、牛和马。合适的动物还包括乳用动物(dairy animal),例如山羊和牛,或小鼠。在一些实施方案中,适于转基因表达的动物为山羊。
[0051]在一个实施方案中，转基因动物是通过如下产生的:包含感兴趣的构建体的原代细胞的增殖，接着是将原代细胞细胞核核移植至去核卵母细胞中。通过用包含感兴趣的蛋白质(例如AAT)的编码序列的单一构建体注射或转染原代细胞，产生包含感兴趣的构建体的原代细胞。然后将这些细胞增殖和表征以评估转基因拷贝数、转基因的结构完整性和染色体整合位点。然后，将具有期望的转基因拷贝数、转基因的结构完整性和染色体整合位点的细胞用于核移植，以产生转基因动物。本文所用的“核移植”是指克隆的方法，其中来自于供体细胞的细胞核被移植进入去核卵母细胞。
[0052]表达在哺乳动物乳腺上皮细胞中的AAT编码序列可以通过基因组物质的筛选文库得到或反向翻译的信使RNA得到，该信使RNA源于选择的动物(例如，人、家畜或小鼠)、序列数据库(例如NCBI,Genbank)或通过使用本领域中已知的方法(例如肽谱法)得到的序列。该序列可以被克隆到适当的质粒载体并扩增到合适的宿主生物体,如大肠杆菌。本文所用的“载体”可以是任何数量的核酸，所需序列可以通过限制和连接插入至该核酸中，用于不同遗传环境之间转运或用于在宿主细胞中表达。载体通常由DNA组成，虽然RNA载体也是可用的。载体包括，但不限于，质粒和噬菌粒。克隆载体能够在宿主细胞中复制，并且其特征还在于通过一个或多个内切核酸酶限制性酶切位点，在该位点，载体可以确定的方式被切割且所需DNA序列可在此位点连接，使得新的重组体载体保留其在宿主细胞中的复制能力。可将所需的DNA序列通过限制和连接插入至表达载体，使得该表达载体可操作地连接至调节序列，并且可将该表达载体表示为RNA转录物。载体还可以含有一个或多个标记物序列，该标记物序列适用于识别已经或还没有用载体转化或转染了的细胞。标记物包括，例如，编码蛋白的基因，所述蛋白增加或降低对抗生素或其他化合物的抗性或敏感性的；编码酶的基因，其中所述酶的活动通过本领域已知的标准检测进行测定(例如，β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶)；以及明显地影响转化或转染的细胞、宿主、菌落或噬菌斑表型的基因。扩增该载体后，DNA构建体可以被切除，从载体的残余物中纯化，并被引入至可用于产生转基因动物的表达载体中。该转基因动物会产生整合到自己的基因组的预期的转基因蛋白。
[0053]适合指导产生转基因动物的奶的DNA序列可以携带天然来源于乳蛋白的5’-启动子区域。因此，该启动子受激素因素和组织特异性因素的控制，并且是最活跃的泌乳乳腺组织。在一些实施方案中，所使用的启动子是奶特异性启动子。本文所用的“奶特异性启动子”是自然地指导细胞中的基因表达的启动子，所述细胞分泌蛋白进入奶中(例如，乳腺上皮细胞)。该启动子包括，例如，酪蛋白启动子，如α-酪蛋白启动子(例如，a S-1酪蛋白启动子和aS2_酪蛋白启动子)、酪蛋白启动子(例如，山羊β酪蛋白基因启动子(DiTulI1，B1TECHNOLOGY 10:74-77,1992))、Y -酪蛋白启动子、κ-酪蛋白启动子、乳清酸性蛋白(WAP)启动子(Gorton 等人，B1TECHNOLOGY 5:1183-1187，1987)、β-乳球蛋白启动子(Clark 等人，B1TECHNOLOGY 7:487-492, 1989)和 α-乳清蛋白启动子(Soulier等人，FEBS LETTS.297:13, 1992)。在这个定义中还包括在乳腺组织中被特异性激活的启动子，例如，小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)的长末端重复序列(LTR)启动子。在一些实施方案中，该启动子为羊的β酪蛋白启动子。
[0054]该启动子可操作性地连接到DNA序列以指导蛋白前导序列的产生，该蛋白前导序列引导转基因蛋白的分泌，使其穿过乳腺上皮细胞进入奶中。如本文所用，当编码序列和调节序列(例如，启动子)以一种方式连接，在调解序列的影响或控制下表达或转录编码序列时，则该编码序列和调节序列被认为是“操作性地结合”或“操作性地连接”。本文所用的“前导序列”或“信号序列”是编码蛋白分泌信号的核酸序列，并且，当将其操作性地连接至编码转基因蛋白的下游核酸分子时，该核酸序列指导分泌。该前导序列可为天然的人前导序列、人工衍生的前导序列或可以从与用于指导转基因编码序列的转录的启动子相同的基因得到，或从通常由细胞(如哺乳动物乳腺上皮细胞)所分泌的另一种蛋白质中得到。在一些实施方案中，可以加入3’ -序列以提高mRNA的稳定性，该序列可衍生自天然分泌的乳蛋白。
[0055]在一些实施方案中，为了产生含有构建体(例如，编码AAT)的原代细胞系，该细胞系用于通过核移植产生转基因山羊，可将该构建体转染到原代山羊皮肤上皮细胞，该上皮细胞可以增殖并被充分表征以评估转基因拷贝数、基因结构的完整性和染色体整合位点。本文所用的“核移植”是指克隆的方法，其中将来自供体细胞的核移植到去核卵母细胞中。
[0056]克隆会导致转基因动物的多样性，每个均能够产生AAT或其他感兴趣的基因构建体。该制备方法包括使用克隆动物及其后代。克隆也包括胚胎核移植、核移植、组织和器官移植和创造嵌合体后代。克隆过程中的一个步骤包括转移细胞(如原代细胞，其包含进入去核卵母细胞的感兴趣的转基因)的基因组。本文所用的“转基因”是指任何的核酸分子片段，该核酸分子片段被人工插入细胞或其祖先中，并成为从该细胞发育的动物基因组的一部分。所述转基因可包括部分或完全外源性(即外来的)转基因动物的基因，或可以表示与动物的内源性基因具有同一性的基因。合适的卵母细胞的哺乳动物来源包括山羊、绵羊、牛、猪、兔、豚鼠、小鼠、仓鼠、大鼠、非人灵长类动物等。优选地，卵母细胞来源于有蹄类动物，最优选地为山羊或家畜。分离卵母细胞的方法是本领域熟知的。实质上，该方法包括将卵母细胞从哺乳动物(如山羊)的卵巢或生殖道中分离。易于得到的有蹄类动物卵母细胞的来源是激素诱导的雌性动物。为成功使用例如基因工程、核移植和克隆的技术，优选地，在卵母细胞可以被用作用于核移植的受体细胞之前且在其由精子细胞受精发展成胚胎之前，卵母细胞可在体内发育成熟。在体内发育成熟的分裂中期II期卵母细胞，已经被成功地应用于核移植技术。实质上，成熟的分裂中期II期卵母细胞通过手术在非超排卵或超排卵动物动情期开始后或被注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)或类似激素后几个小时，从该非超排卵或超排卵动物收集。
[0057]因此，在一个方面，本公开提供了产生本文公开的AAT的乳腺上皮细胞。在一些实施方案中，上述乳腺上皮细胞存在于转基因非人类哺乳动物。在一些实施方案中，所述转基因非人类哺乳动物为山羊。
[0058]转基因动物
[0059]在一个方面，本公开还提供了产生基因工程哺乳动物或转基因哺乳动物的方法，通过此方法，将所需基因插入到植入前胚胎的前核。遗传物质整合到基因组中，由此得到的动物在其基因组中携带遗传物质。在这种情况下，所述转基因为进入哺乳期雌性的奶中的重组体AAT的表达提供遗传信息。
[0060]在一个方面，本公开还提供了克隆基因工程哺乳动物或转基因哺乳动物的方法，通过此方法，在将分化的哺乳动物细胞或细胞核插入到去核卵母细胞之后，将所需基因在分化的哺乳动物细胞或细胞核中插入、删除或修改。
[0061]在一个方面，本公开还提供了根据本文提供的方法得到的哺乳动物及其后代。在一些实施方案中，本公开用于产生羊属动物或牛属动物，但该方法还可用于任何非人类哺乳动物物种。本公开进一步提供了胚胎核移植和核移植以及嵌合体后代在细胞、组织和器官移植领域的用途。
[0062]胚胎和卵母细胞合适的哺乳动物来源包括山羊、绵羊、牛、猪、兔、豚鼠、小鼠、仓鼠、大鼠、灵长类动物等。优选地，在一些实施方案中，该卵母细胞来源于有蹄类动物，最优选地，在一些实施方案中，来源于山羊或家畜。分离卵母细胞的方法是本领域熟知的。实质上，卵母细胞是从哺乳动物(如山羊)的卵巢或生殖道中分离的。易于得到的有蹄类动物的卵母细胞来源为激素诱导的雌性动物。
[0063]为了成功地使用例如基因工程、核移植和克隆的技术，优选地，在卵母细胞可被用作受体细胞进行核移植之前，且在其由精子细胞受精发展成胚胎之前，卵母细胞可在体内发育成熟。在体内发育成熟的分裂中期II期卵母细胞，已经被成功地应用于核移植技术。实质上，成熟的分裂中期II期卵母细胞通过手术在非超排卵或超排卵动物动情期或被注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)或类似激素后几个小时，从该非超排卵或超排卵动物以后收集。
[0064]此外，应注意的是，通过转基因技术修饰动物基因组的能力为制备根据聚糖性质用于治疗人的优化的重组蛋白质提供了新的替代方法。在转基因家畜的奶中制备人重组体药物制剂，解决了许多与微生物生物反应器相关的问题(例如，缺乏翻译后修饰、不正确的蛋白质折叠、高纯化成本)或与动物细胞生物反应器相关的问题(例如，高资金成本、昂贵的培养基、产量低)。本发明能够用于转基因制备生物药剂、转基因蛋白、血浆蛋白和转基因动物的奶或其他体液(例如，尿液或血液)中的其他感兴趣的分子，该转基因动物被转入优化分子的糖基化性质的所需基因。
[0065]适于指导产生转基因动物的奶的DNA序列，携带天然来源的乳蛋白的5’ -启动子区域，因此该启动子受激素因子和组织特异性因子的控制。因此，这样的启动子在哺乳期乳腺组织中应为最活跃的。根据本发明，使用的启动子接有指导蛋白质的前导序列产生的DNA序列，该蛋白质前导序列将指导转基因蛋白的分泌穿过乳腺上皮细胞进入奶中。在转基因蛋白构建体的另一端，可添加合适的3’ -序列(还优选地衍生自天然分泌的乳蛋白)，以提高mRNA的稳定性。合适的控制在转基因动物的奶中蛋白质的产生的序列的实例是那些来自山羊酪蛋白启动子的序列。
[0066]如今，产生转基因动物可通过使用包括微注射和核移植的各种技术完成。
[0067]制备AAT的方法
[0068]在一个方面，本公开提供了制备AAT的方法。在一个方面，本公开提供了制备AAT的方法，该方法包括在非人类哺乳动物的乳腺上皮细胞表达ΑΑΤ。在一些实施方案中，培养该乳腺上皮细胞，且用包含编码AAT的序列的核酸转染该乳腺上皮细胞。在一些实施方案中，该乳腺上皮细胞为非人类哺乳动物，将其工程化以在乳腺中表达包含编码AAT的序列的核酸。在一些实施方案中，该乳腺上皮细胞为山羊、绵羊、野牛、骆驼、牛、猪、兔、水牛、马、大鼠、小鼠或美洲驼羊的乳腺上皮细胞。在一些实施方案中，该乳腺上皮细胞为山羊乳腺上皮细胞。
[0069]在一个方面，本公开提供了表达本文公开的AAT的乳腺上皮细胞。
[0070]在一个方面，本公开提供了转基因非人类哺乳动物，其包含表达本文公开的AAT的乳腺上皮细胞。
[0071]在另一个方面，本公开提供了制备转基因AAT的方法，该方法包括在转基因非人类哺乳动物的奶中表达被核酸构建体编码的ΑΑΤ。在一些实施方案中，所述制备AAT的方法包括:
[0072](a)用编码AAT的转基因DNA构建体转染非人类哺乳动物细胞；
[0073](b)筛选细胞，其中所述AAT转基因DNA构建体已被插入到该细胞的基因组中；和
[0074](c)进行首次核移植过程以产生杂合有AAT的非人转基因哺乳动物且该AAT可以在其奶中表达。
[0075]在另一个方面，本公开提供了如下方法:
[0076](a)提供经工程化的非人转基因哺乳动物以表达AAT ；
[0077](b)在该非人转基因哺乳动物的奶中表达AAT ;和
[0078](c)从奶中分离AAT。
[0079]—种用于预测在乳腺中表达的重组体蛋白的数量和质量的工具是通过泌乳诱导的(Ebert KM, 1994)。诱导泌乳允许表达和分析从转基因产生的早期得到的蛋白，而不是从怀孕得到的首次天然泌乳得到的蛋白，其至少在一年以后。诱导泌乳可以通过激素或人工进行。
[0080]在一些实施方案中，本文所述的AAT的组合物还包含奶。在一些实施方案中，本文所述方法包括从转基因动物的奶中分离AAT的步骤。从转基因动物的奶中分离蛋白的方法是本领域已知的，并且描述在，例如Pollock等人，Journal of ImmunologicalMethods, Volume 231，Issues 1-2，1999 年 12 月 10 日，147-157 页。在一些实施方案中，本文提供的方法包括纯化所表达的AAT的步骤。
[0081]在一个方面，本公开提供了通过核酸构建体制备AAT的方法，该方法包括在转基因非人类哺乳动物的奶中表达AAT。在一个实施方案中，所述哺乳动物乳腺上皮细胞来自经工程化能在奶中表达AAT的非人类哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物乳腺上皮细胞为培养的哺乳动物乳腺上皮细胞。
[0082]在另一个实施方案中，所述方法包括:
[0083](a)提供经工程化可以表达AAT的非人转基因哺乳动物；
[0084](b)在该非人转基因哺乳动物的奶中表达AAT ;和
[0085](C)分离在奶中表达的AAT。
[0086]在另一个实施方案中，所述方法包括:在乳腺上皮细胞中产生AAT，该AAT具有高水平的脱氧己糖。在一些实施方案中，此方法在体外进行。在其他实施方案中，此方法在体内进行，例如，在转基因山羊的乳腺中。
[0087]在一些实施方案中，上述方法还包括诱导泌乳的步骤。在一些实施方案中，该方法还包括进一步的分离和/或纯化步骤。在一些实施方案中，该方法还包括比较重组产生的AAT和血浆衍生的AAT的不同的糖基化作用模式的步骤。在进一步的实施方案中，该方法还包括比较重组产生的AAT和血浆衍生的AAT的相似的糖基化作用模式的步骤。
[0088]在一些实施方案中，该方法还包括唾液酸化AAT的糖肽类的步骤。
[0089]在一些实施方案中，该方法还包括比较在重组产生的AAT中存在的脱氧己糖糖基化作用的百分数和血浆衍生的AAT中存在的脱氧己糖糖基化作用的百分数。用于评估AAT的糖基化作用模式的实验技术可以是本领域普通技术人员已知的或本文提供的，例如以下实施例中所述。这些方法包括，例如，液相色谱质谱、串联质谱和蛋白印迹分析。
[0090]在一些实施方案中，重组产生的AAT可通过从本文提供的转基因动物的奶中或从所述转基因动物的后代中收集的AAT得到。在一些实施方案中，转基因哺乳动物产生的AAT是以每升产奶中至少有IgAAT的水平产生的。在一些实施方案中，表达rhAAT的山羊用显微注射方法得到。
[0091]治疗方法、药物组合物、剂量和给药
[0092]在一个方面，本公开提供了给药AAT的组合物至有此治疗需要的受试者的方法。在一些实施方案中，AAT是重组产生的。在一些实施方案中，AAT产生于非人乳腺上皮细胞。在一些实施方案中，所述AAT具有高水平的脱氧己糖糖基化作用。在一些实施方案中，所述AAT在ATT-糖基序上具有高水平的唾液酸化作用。在一些实施方案中，所述AAT在ATT-糖基序上具有高水平的脱氧己糖糖基化作用和高水平的唾液酸化作用。
[0093]在一个方面，本公开提供了给药AAT的组合物至有此治疗需要的受试者的方法。在一些实施方案中，所述受试者患有ct-1-抗胰蛋白酶缺乏症。在一些实施方案中，所述受试者具有炎性病症或自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述炎性病症为气肿。在一些实施方案中，所述炎性病症或免疫性病症包括但不限于成人呼吸窘迫综合征、动脉硬化、哮喘、动脉粥样硬化、胆囊炎、肝硬变、克罗恩病、糖尿病、气肿、嗜伊红细胞增多症、炎症、过敏性肠综合征、多发性硬化、重症肌无力、心肌炎或心包炎、骨关节炎、骨质疏松症、胰腺炎、类风湿性关节炎、硬皮病、结肠炎、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、糖尿病、炎性肠病、腹腔疾病、自身免疫性甲状腺病、阿狄森氏病、舍格伦综合征(S1gren’ s syndrome)、西登哈姆舞蹈病、高安动脉炎、韦格纳氏肉芽肿病、自身免疫性胃炎、自身免疫性肝炎、皮肤的自身免疫性疾病、自身免疫性扩张型心肌病、多发性硬化、心肌炎、重症肌无力、恶性贫血、多肌痛、牛皮癣、急进性肾小球性肾炎、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、脉管炎、肌肉的自身免疫性疾病、睾丸的自身免疫性疾病、卵巢的自身免疫疾病、眼部的自身免疫性疾病、寻常性痤疮(acne vulgary)、哮喘、自身免疫性疾病、乳糜泻、慢性前列腺炎、肾小球肾炎、超敏反应、炎性肠疾病、盆腔炎、灌注损伤、类风湿关节炎、结节病、移植排斥、血管炎和间质性膀胱炎。
[0094]在一个方面，本公开提供了降低肺内弹性蛋白酶活性的方法，其包括给药足够量的AAT的组合物至受试者以降低肺内弹性蛋白酶活性。
[0095]在一个方面，本公开提供了药物组合物，其包含AAT和药学上可接受的媒介物、稀释剂或载体。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含奶。
[0096]在一个方面，本公开提供了一种治疗受试者的方法，其包括给药受试者有效量的组合物以治疗患有或存在患有该疾病风险的受试者。在一个实施方案中，所述受试者为人。在另一个实施方案中，所述受试者是非人的动物，例如，狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊或灵长类动物。
[0097]根据涉及给药治疗有效量的本文中提供的AAT至有此治疗需要的受试者的实施方式，“治疗上有效的”或“有效量治疗的量”表示抑制或逆转疾病病症所需的AAT或组合物的量，该量能缓解或预防其症状(例如，治疗炎性病症)。确定治疗上有效的量具体取决于例如药物的毒性和药效这样的因素。这些因素随着其他因素，例如效力、相对生物利用度、患者体重、不良副作用的严重性和优选的给药方式，而变得不同。毒性可使用本领域熟知的方法进行测定。效力可利用同样的指导进行测定。例如，效力可通过炎症或其症状的减少进行测定。因此，药学上有效量是指临床医师认定为毒理学可允许的，且有效的量。
[0098]依赖于给药方式，剂量可被适当调整以实现预期的局部的或全身的药物(例如，AAT)水平。受试者在一些剂量的反应是不足的，这种情况下，可以给予其甚至更高的剂量(或通过不同的更局部的递送途径得到有效的更高的剂量)，但是在其容忍程度允许的情况下。每日多剂量是为了实现AAT适当的全身水平。适当的全身水平可以通过例如，患者体内药物峰值或持续的药物血浆水平来确定。本文中的“剂量”和“用量”可互换。
[0099]在一些实施方案中，给药至受试者的AAT或药物组合物的量为每周50至500mg/kg、100至400mg/kg或200至300mg/kg。在一个实施方案中，给药至受试者的AAT或药物组合物的量为每周250mg/kg。在一些实施方案中，第一周给药受试者400mg/kg的初始剂量，在接下来的几周给药所述受试者250mg/kg的药量。在一些实施方案中，给药速率为小于10mg/min。在一些实施方案中，给药AAT或药物组合物至受试者至少在给予另一种治疗药物之前一个小时。在一些实施方案中，给药AAT之前应先预处理。
[0100]在一些实施方案中，所述AAT或其组合物以30mg/kg至约60mg/kg的剂量进行给药。
[0101]在一些实施方案中，所述组合物用于体内施用。取决于体内给药的预期模式，所使用的组合物可为固体、半固体或液体的剂型，例如，片剂、丸剂、粉末、胶囊、凝胶剂、软膏、液体、悬浮剂等。优选地，该组合物以适于单次给药精确剂量的单位剂型进行给药。根据所需的制剂，该组合物还可以包含药学上可接受载体或稀释剂，其为通常用于配制成给药人或动物的药物组合物的水性媒介物。选择的稀释剂不会影响感兴趣的人重组体蛋白的生物活性。这类稀释剂的实例是蒸馏水、生理盐水、林格氏溶液，葡萄糖溶液和Hank氏溶液。相同的稀释剂可用于重建低压冻干的感兴趣的重组体蛋白质。此外，所述药物组合物还可包含其它药剂、药物试剂、载体、佐剂和无毒的、非治疗性的、非免疫原性的稳定剂等。该稀释剂或载体的有效量是根据组分的溶解度、生物活性等有效地得到药学上可接受制剂的量。在一些实施方案中，本文提供的组合物为无菌的。
[0102]体内治疗的给药可以是由各种途径，包括口服、胃肠外、肌内、鼻内、舌下、气管内、吸入、眼内、阴道和直肠。也可使用囊内，静脉内，以及腹腔内的给药途径。本领域技术人员能够认识到给药途径取决于所治疗的病症。例如，本文所述的组合物或AAT均可以通过口月艮、胃肠外或局部给药至受试者。在一个实施方案中，本文所述的组合物或AAT以静脉输注给药。
[0103]当想要全身递送所述组合物，可将该组合物配制用于通过注射进行肠胃外给药，例如通过推注或连续输注。用于注射的制剂可以存在于单位剂型中，例如，在安瓿中或在多剂量容器中，并加入防腐剂。该组合物可采取这样的形式如悬浮剂、在油性或水性媒介物中的溶液或乳剂，并且该组合物可以包含配制试剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
[0104]用于肠胃外给药的药物制剂包括水溶性形式的活性组合物的水溶液。此外，可将活性组合物的悬浮剂制备成适当的油性注射悬浮剂。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油(例如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)，或脂质体。水性注射悬浮剂可含有增加悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，所述悬浮液也可含有合适的稳定剂或增加该组合物的溶解度以制备高浓度溶液的制剂。或者，所述活性组合物可以为粉末形式，使用前与合适的媒介物(例如灭菌无热原水)混合。
[0105]对于口服给药，所述药物组合物可以采用以下形式，例如，使用药学上可接受的赋形剂，通过常规方法制备成片剂或胶囊，所述药学上可接受的赋形剂例如粘合剂(例如，预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)、填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)、润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或硅石)、崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羧甲基淀粉钠)或润湿剂(例如，月桂基硫酸钠)。该片剂可以通过本领域熟知的方法进行包衣。用于口服给药的液体药剂可以采用以下形式，例如，溶液、糖浆剂或悬浮剂，或它们可以干燥产品存在，在使用前与水或其它合适的媒介物混合。所述液体制剂可以用药学上可接受的添加剂，通过常规方法制备，所述药学上可接受的添加剂例如，悬浮剂(例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)、乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)、非水媒介物(例如，杏仁油、油酯、乙醇或分馏植物油)和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲基酯或丙基酯或山梨酸)。该制剂也可含有适当的缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。可以将一种或多种组分进行化学修饰，使口服递送的AAT有效。通常，所考虑的化学修饰是将至少一个分子连接至AAT上，其中所述分子允许(a)抑制蛋白水解，和(b)从胃或肠摄取进入血流。还期望的是增加AAT的总体稳定性以及增加AAT在体内循环时间。此类分子的实例包括:聚乙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。参见 Abuchowski 和 Davis, 1981，"Soluble Polymer-Enzyme Adducts〃In:Enzymesas Drugs, Hocenberg 和 Roberts, eds., ffiley-1nterscience, New York, NY, pp.367-383 ；Newmark 等人,1982, J.App1.B1chem.4:185-189。其他可被使用的聚合物为聚-1, 3- 二氧戊环和聚-1，3，6-三氧辛环(t1xocane)。如上所示，聚乙二醇分子优选用于制药用途。对于口服组合物，释放的位置可以是胃、小肠(十二指肠、空肠或回肠)或大肠。本领域技术人员可以获得这样的制剂，其在胃中不溶，但在十二指肠或肠的其它地方释放物质。优选地，释放将避免胃环境的有害作用，要么通过保护AAT，要么通过在胃环境以外，例如在肠中释放生物活性物质。
[0106]对于口腔含服给药，该组合物可采用片剂或锭剂的形式，其通过常规方法制造。
[0107]对于吸入给药，根据本公开使用的组合物可方便地以从加压包装或喷雾器的气雾剂形式递送，其中使用合适的抛射剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)。在加压的气雾剂中，剂量单位可通过提供递送计算量的阀来确定。用于在吸入器或吹入器中的胶囊和例如明胶的药筒可配制或含有该组合物和合适的粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
[0108]本文还涉及经肺递送的给药方式。在吸入并穿过肺上皮衬层到血流中时，该组合物可以被递送到哺乳动物的肺。广泛范围的机械装置都可以用于实施本发明，所述装置设计用于经肺递送治疗产物，包括但不限于喷雾器、定量剂量吸入器和粉末吸入器，所有这些都是本领域技术人员熟悉的。
[0109]也可以采用鼻内递送本文公开的药物组合物。鼻内递送，使得在给药治疗产品到鼻内后，本公开的药物组合物能直接流通到血流中，而无需将产物沉积在肺中。用于鼻内递送的制剂包括那些用葡聚糖或环糊精的制剂。
[0110]该组合物还可以配制成直肠或阴道用的组合物，例如栓剂或保留灌肠剂，例如，含有常规栓剂基质(例如可可脂或其它甘油酯)。
[0111]该药物组合物还可以包括合适的固体或凝胶相载体或赋形剂。该载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物(例如聚乙二醇)。
[0112]合适的液体或固体药物制剂形式是，例如水溶液或盐水溶液，用于吸入、微囊化、螺旋包封(encochleated)、包被在显微金颗粒上、包含在脂质体中、喷雾剂、气雾剂、植入皮肤的丸剂或在尖锐物体上干燥以刮蹭入皮肤中。该药物组合物还包括颗粒、粉末、片剂、包衣片剂、(微)胶囊、栓剂、糖浆剂、乳剂、悬浮剂、霜剂、滴剂或延迟释放活性组合物的制剂，在这些制剂中，如上所述常规使用赋形剂和添加剂和/或辅料，例如崩解剂、粘合剂、包衣齐IJ、溶胀剂、润滑剂、调味剂、甜味剂或增溶剂。该药物组合物适用于多种药物递送系统。对于药物递送方法的简要综述，参见Langer，Science249:1527-1533, 1990，其引入本文作为参考。AAT和任选的其它治疗剂可给药药物本身(纯药)或以药学上可接受的盐的形式给药。在用于药物时，所述盐应为药学上可接受的盐，但非药学上可接受的盐可方便地用于制备其药学上可接受的盐。这样的盐包括，但不限于，由下列酸制备的盐:盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。另外，这些盐可以制备成碱金属或碱土金属盐，例如羧酸基团的钠盐、钾盐或钙盐。
[0113]合适的缓冲剂包括:乙酸和盐(1-2 % w/v);柠檬酸和盐(1-3 % w/v);硼酸和盐(0.5-2.5% w/v);和磷酸和盐(0.8-2% w/v)。合适的防腐剂包括苯扎氯铵(0.003-0.03% w/v);氯丁醇(0.3-0.9% w/v);对羟基苯甲酸酯(0.01-0.25% w/v)和硫柳汞(0.004-0.02% w/v)。
[0114]本公开的药物组合物包含有效量的AAT和任选地,包括在药学上可接受的载体中的其它治疗剂。术语药学上可接受的载体是指一种或多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或成胶囊物质，其适合于给药至人或其它脊椎动物。术语载体表示有机成分或无机成分，其是天然的或合成的，其与活性成分结合以便于应用。药物组合物的组分也能与本公开的组合物混合，并且以相互之间没有实质性阻碍所期望的药物功效的相互作用的方式混合。
[0115]具体包括但不限于AAT的治疗剂可以颗粒提供。本文使用的颗粒包括纳米或微米颗粒(或者在一些情况下更大的颗粒)，其可以全部或部分由本文所述的AAT或与AAT —同给药的其它治疗剂组成。除了治疗剂以外，该颗粒还可包括，任何药学和医学领域中常规使用的材料，包括但不限于，易蚀的、难蚀的、可生物降解或不可生物降解的材料或它们的组合。该颗粒可以是含有溶液或半固体状态的微胶囊的AAT。该颗粒几乎可以是任何形状。
[0116]除有另外说明，使用的与本发明相关的科学和技术术语应具有由本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。本公开的方法和技术通常可根据现有技术中公知的常规方法完成。通常，本文所描述的与生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学的技术以及杂交技术有关的术语是本领域中公知的和常用的。除非另有说明，本公开的方法和技术通常可根据现有技术中公知的常规方法完成，且在各种一般和具体的本说明书引用和讨论的参考文献中描述。
[0117]本发明进一步由以下实施例举例说明，其毫无疑问不应理解为进一步的限制。本申请中所提到的所有文献(包括参考文献、授权专利、公开专利申请和共同未决的专利申请)的全部内容都在此明确引入作为参考，特别是针对所引用上文的教导。然而，任何参考的引用并非意在承认该参考是现有技术。
实施例
[0118]大鼠α-1-抗胰蛋白酶(AAT)的药代动力学研究
[0119]将血浆衍生的(pdAAT)、重组产生的(rhAAT)和唾液酸化的重组产生的AAT(Neose) (AAT)用红外染料标记，并以3和30mg/kg的剂量对大鼠进行注射。在杀死动物和收集支气管肺泡灌洗(BAL)流体之后两个多小时，对样品进行斑点印迹法和红外扫描分析跟踪测量血药浓度。BAL样品在SDS-PAGE上运行，且AAT的浓度通过红外分析和比较也在SDS-PAGE上运行的起始材料的标准曲线进行定量。本文呈现的数据表明，虽然在血液中，重组体AAT的水平相比于在血浆衍生的AAT的水平降低了，但在肺中的浓度是可比较的(参见附图4、5和7)。此外，所述重组体AAT的唾液酸化作用(“neose”)大大提高了rhAAT的药代动力学分布(参见附图6)。唾液酸化作用提高了生物利用度，但似乎并没有干扰隔离在肺中的蛋白质的能力(参见例如，附图7)。在BAL中，观察到相对于pdAAT治疗的大鼠约两倍的唾液酸化的rhAAT(参见附图4、5和7)。通过向样品中加入人中性粒细胞弹性蛋白酶并且在SDS-PAGE上以络合(82KD)和切割(47kD)的形式观察AAT的分子量的变化，估计在BAL中的AAT的活性(参见附图3)。
[0120]BAL样品也进行ELISA以测定大鼠GR0/CINC-1，即人IL-8类似物，通过所述重组体AAT或唾液酸化的重组体AAT确定是否存在免疫系统的激活。样品用稀释的缓冲液稀释至1/10且与标准曲线对比。GR0/CINC-1测定是用来确定在肺部炎症的程度(参见附图2)。在所有样品中观察到低水平的IL-8，因此炎症也为低水平。
[0121]重组体AAT和唾液酸化的重组体AAT被隔离在肺中。进行两个剂量的AAT，即3和30毫克/公斤的血浆衍生的、重组产生的和唾液酸化的重组体AAT的研究。两只大鼠被列为模拟对照组，以测定在未经处理的动物的BAL中AAT活性。每组包括两只大鼠。尾静脉静脉内注射，在0、5、30、60和120分钟取血样，在第120分钟杀死大鼠，并用5ml的PBS洗肺以收集支气管肺泡灌洗液(参见附图6和7)。
[0122]在研究之前，唾液酸化的(Neose)重组体AAT是由透析重组体AAT到HBS并用在5mmCMP-Nan中的50mU唾液酸转移酶3 (ST3gal3)处理一小时产生的。末端半乳糖的唾液酸化作用通过IEF凝胶到很接近血浆衍生的AAT的位置的酸性转移评估的。所有样品均标有IR800DyeCff,即在800nm吸收的红外染料的NHS衍生物。产品通过SDS-PAGE和抗弹性蛋白酶活性测定法进行评估(参见附图3)。为了确定BAL液中的AAT是否活跃，将样品与I微克人中性粒细胞弹性蛋白酶或AAT活性缓冲剂进行混合，并在SDS-PAGE上运行。电泳泳道1-5描述了 rhAAT在体外结合弹性蛋白酶的能力，电泳泳道7-10显示了从BAL收集后，AAT结合弹性蛋白酶的能力。
[0123]将2微升血清稀释至200微升PBS中，并用96孔多头抽真空装置填充该样品于Protran 83硝酸纤维素膜上，以测定大鼠样品。然后用Odyssey红外扫描仪在800nm扫描滤膜。扫描和集成网格。通过SDS-PAGE评价BAL样品。通过集成约单体的尺寸及单体尺寸以上的谱带来定量肺中AAT的存在。较大的谱带是标记的AAT的不同形式，该标记的AAT包括与酶的络合(参见附图4和5)。
[0124]结果
[0125]药代动力学性质表明pdAAT具有最慢的清除率且重组体的AAT具有最快的清除率，而唾液酸化作用(Neose)大大降低rhAAT的清除率(参见附图6)。
[0126]在3mg/kg的剂量时，大鼠在其支气管肺泡灌洗液样品中有检测量的AAT。该样品的SDS-PAGE分析表明，相比于血浆衍生的AAT的大鼠样品，用Neose处理的AAT的大鼠样品中可进入肺中的所有形式在肺中具有更多的AAT。即使血液中的AAT水平低，也可在肺中检测到rhAAT(参见附图6和7)。
[0127]在30mg/kg的剂量时，BAL中重组体AAT的水平实际上比血浆衍生的AAT水平高出三倍,且唾液酸化的重组体的AAT的浓度是超过pdAAT浓度的10倍。
[0128]为了确定肺中样品(即，BAL)观察到的AAT是否具有活性，将I微克大鼠样品和人中性粒细胞弹性蛋白酶混合，并在SDS-PAGE上运行。所有单体消失并移动至三条谱带中的一条，此三条谱带为稍小于80KD，稍大于80KD和约为80KD，即为AAT:弹性蛋白酶复合体的预期尺寸。当原料用弹性蛋白酶混合时，也可观察到此现象。该实验的时间过程表明，一分钟内反应完全，且超过36分钟以后，三条谱带的每一条量未改变。
[0129]大鼠肺样品的免疫学状态通过测定GR0/CINC-1，即IL-8的鼠类似物进行测定。同样，有约2倍的变化，但在75至160pg/ml的范围内的水平很低。
[0130]实验也评价了重组体AAT和血浆AAT的糖基化作用模式。其主要区别是血浆AAT的脱氧己糖水平更低(结果显示于附图8和9)。
[0131]如本文所述的表达rhAAT的转基因动物根据描述于US7，045, 676中的方法进行制备，该方法引入本文作为参考。
[0132]等同形式
[0133]前述说明书旨在足以使本领域技术人员实现本发明。本发明不是限制本文提供的实施例的范围，因为这些实施例是为了说明本发明的实施方案和特定方面。其他功能上等同的实施方案也在本发明的范围内。除了在此描述和显示的那些以外，对于本领域普通技术人员来说，从前述说明书中对本发明进行多种修饰也是显而易见的，这些修饰也在所附的的权利要求范围内。本发明的好处和目的并不一定包含在本发明的每个实施方案中。
【权利要求】
1.组合物，其包含α-1-抗胰蛋白酶(AAT)，其中所述AAT是重组产生的。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述AAT产生于非人类哺乳动物的乳腺上皮细胞中。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述AAT产生于转基因非人类哺乳动物中。
4.如权利要求2或3所述的组合物，其中所述非人类哺乳动物为山羊、绵羊、野牛、骆驼、牛、猪、兔、水牛、马、大鼠、小鼠或美洲骑羊。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述非人类哺乳动物为山羊。
6.如权利要求1-5中任一项的组合物，其中所述重组产生的AAT相比于血浆衍生的AAT具有增强的脱氧己糖糖基化作用。
7.如权利要求1-6中任一项的组合物，其中已将所述重组产生的AAT修饰，以增强在AAT糖基序上的唾液酸化作用。
8.包含AAT的组合物，其中所述AAT具有高水平的脱氧己糖糖基化作用。
9.包含AAT的组合物，其中所述AAT在AAT糖基序上具有高水平的唾液酸化作用。
10.包含AAT的组合物，其中所述AAT具有高水平的脱氧己糖糖基化作用并且在AAT糖基序上具有高水平的唾液酸化作用。
11.如权利要求1-10中任一项的包含AAT的组合物，其还包含奶。
12.如权利要求1-11中任一项的包含AAT的组合物，其还包含药学上可接受的载体。
13.乳腺上皮细胞，其产生权利要求1-12中任一项的组合物中的ΑΑΤ。
14.转基因非人类哺乳动物，其包含权利要求13所述的乳腺上皮细胞。
15.方法，其包括给药至有此需要的受试者权利要求1-12中任一项的组合物。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述受试者患有α-1-抗胰蛋白酶缺乏症。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述受试者患有炎性病症。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述炎性病症为气肿。
19.如权利要求15-18中任一项的方法,其中所述组合物以从30mg/kg至约60mg/kg的AAT的剂量给药。
20.如权利要求15-19中任一项的方法，其中所述组合物通过静脉给药。
21.如权利要求15-19中任一项的方法，其中所述组合物通过吸入给药。
22.降低肺内弹性蛋白酶活性的方法，该方法包括给予受试者有效量的权利要求1-12中任一项的组合物以降低肺内弹性蛋白酶活性。
【文档编号】A61K38/57GK104302312SQ201280070084
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2012年12月19日 优先权日:2011年12月19日
【发明者】H.M.米德, P.R.波尔登 申请人:Lfb美国股份有限公司