轻链桥连的双特异性抗体的利记博彩app
【专利摘要】本发明描述了用于临床治疗的具有免疫激活性质的新形式单体双特异性融合蛋白。双特异性融合蛋白包括对感兴趣的第一靶标具有特异性的第一靶向结构域；衍生自免疫球蛋白的轻链或重链的恒定区的桥连结构域，该免疫球蛋白可以是人免疫球蛋白；和对感兴趣的第二靶标具有特异性的第二靶向结构域。双特异性融合蛋白还可以包括融合到桥连结构域的N-端或C-端的接头。第一靶向结构域融合到桥连结构域并且第二靶向结构域融合到桥连结构域或接头上。接头可以包括GGGGS序列。感兴趣的第一靶标可以是CD20、Her2/neu或EpCAM，并且第二靶向结构域是T-淋巴细胞激活结构域。
【专利说明】轻链桥连的双特异性抗体
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年12月27日提交的临时申请系列号61/580，491的优先权，其公开通过引用全文纳入本文。
【技术领域】
[0003]本发明涉及双特异性或多重特异性生物分子，诸如双特异性抗体的制备方法及其产物。
[0004]发明背景
[0005]结合具有不同功能的生物分子可能产生具有需要或改良性质的新分子。例如，在多特异性抗体，包括双特异性抗体和双特异性肿瘤祀向T-淋巴细胞衔接子(engager)中的最新进展已经证明与单克隆抗肿瘤治疗相比，具有免疫激活性质的多重特异性分子经常在肿瘤治疗中递送增强的功效。
[0006]例如，双特异性抗体(BsAb)可以由来自不同抗体的两种不同结合结构域(即，可变区)的片段组成。两种不同的结合结构域可以结合两种不同类型的抗原。这些分子可以在临床治疗中有所应用，诸如肿瘤免疫治疗。对于这类应用，BsAbs可以被设计成同时结合细胞毒性细胞(使用受体如0)3 (Kurby immunology (Kurby免疫学).San Francisco:ff.H.Freeman.1SBN1-492-0211-4))和靶标如癌细胞(例如，癌细胞上的抗原)。
[0007]双特异性和多重特异性蛋白的构建包括多个蛋白结构域的融合。然而，这样的融合可能由于融合伙伴不同的生物和/或生理性质而造成融合伙伴之间的不相容。另外，生理限制，包括肾过滤或循环途径的渗透性，也可能挑战医学上可用的多重特异性肿瘤靶向分子的设计。
【发明内容】
[0008]本发明的实施方式涉及用于生物医学应用如临床治疗的具有免疫激活性质的新形式双特异性或多重特异性融合蛋白。这些蛋白包括通过桥连结构域连接的两个特异性结合结构域(靶向结构域)，桥连结构域可以包括一个或两个任选的接头。桥连结构域可以衍生自抗体的免疫球蛋白结构域，使得融合蛋白中的不同伙伴是相容的并且可以保留需要的生物性质。可以用作桥的免疫球蛋白结构域可包括轻链恒定区或重链恒定区。这样的融合蛋白可以被称为轻链桥连的抗体或重链桥连的抗体。
[0009]例如，本发明的实施方式所述的双特异性融合蛋白可以包括抗肿瘤生物标记，诸如CD20(Hybridoma.19832 ;17)、Her2/neu(Am J Clin Pathol 2003 120(suppl I) ;S53)或EpCAM(J.1mmunol.1992 148⑵；590)，作为细胞靶向或生物分子靶向结构域的单链连接的Fv片段(ScFv)，作为桥的轻链恒定结构域，任选的接头(其可以省去)，和作为T-淋巴细胞激活结构域的抗-CD3 ScFv0这样的轻链桥连的双特异性免疫激活剂同时显示出对肿瘤表达的细胞靶标和T-淋巴细胞的结合特异性。结合两个靶标特异性地诱导对肿瘤靶标的T-淋巴细胞-介导的细胞毒作用。
[0010]除了上述的抗肿瘤ScFv示例以外，也可使用其他细胞-靶向结构域。这类其他分子可以具有对其他细胞靶标的特异性结合能力。除了 T-淋巴细胞激活结构域以外，其他细胞靶向结构域的示例可以包括具有所需特异性的ScFv或毒素多肽、酶、激素、细胞因子、信号分子。此外，本发明的实施方式所述的融合蛋白可以在原核或真核细胞中表达。另外，ScFv的取向可以是轻链可变区连接到重链可变区上，或反之。这样的双特异性分子的应用包括药物应用，诸如载特定生物标记细胞的消耗治疗，诸如肿瘤治疗。另外，这样的分子可以在诊断应用中使用。
[0011]本发明的一个方面涉及双特异性融合蛋白。本发明的一个实施方式所述的双特异性融合蛋白可以包括对感兴趣的第一靶标具有特异性的第一靶向结构域；衍生自免疫球蛋白的轻链或重链的恒定区的桥连结构域，该免疫球蛋白可以是人免疫球蛋白；和对感兴趣的第二靶标具有特异性的第二靶向结构域。靶向结构域可以对靶标生物分子或细胞有特异性。
[0012]按照本发明的一些实施方式，双特异性融合蛋白还可以包括与桥连结构域的N-端或C-端融合的接头。第一靶向结构域融合到桥连结构域或接头上而第二靶向结构域融合到桥连结构域或接头上。接头可以包括GGGGS序列。感兴趣的第一靶标可以是⑶20、Her2/neu、EpCAM等,并且第二祀向结构域可以是T-淋巴细胞激活结构域,诸如抗-⑶3。
[0013]按照本发明的一些实施方式，双特异性融合蛋白可以省去上述的接头结构域，例如，其中对感兴趣的第一靶标具有特异性的第一靶向结构域和对感兴趣的第二靶标具有特异性的第二靶向结构域各直接融合到桥连结构域的两个末端。
[0014]按照本发明的一些实施方式，双特异性融合蛋白可以包括间插在第一靶向结构域和桥连结构域之间，以及桥连结构域和第二靶向结构域之间的一个或多个上述的接头。即，第一靶向结构域和第二靶向结构域都与接头单独融合，这些接头与桥连结构域的两个末端融合。
[0015]在任意的上述实施方式中，第一靶向结构域可以包括对感兴趣的第一靶标具有特异性的第一 ScFv，并且第二靶向结构域可以包括对感兴趣的第二靶标具有特异性的第二ScFv0
[0016]在任意的上述实施方式中，第一 ScFv和第二 ScFv各自可以包括人免疫球蛋白序列。在上述实施方式中，第一 ScFv可以包括对第一抗原具有结合特异性的VH-接头-VL或VL-接头-VH，并且第二 ScFv可以包括对第二抗原具有结合特异性的VH-接头-VL或VL-接头-VH。
[0017]在任意上述实施方式中，接头可以包括一个或多个GGGGS(G4S)序列。例如，接头可以包括I个G4S序列、2个G4S序列(重复)、3个G4S序列等。另外，接头可以包括与G4S序列结合的其他氨基酸序列。例如，这类其他氨基酸序列可以包括铰链序列(例如，CPPCP)。
[0018]从下面的详述和所附权利要求书很容易了解本发明的其他方面和优点。
[0019]附图简要说明
[0020]图1A和图1B显示了说明本发明的实施方式所述的各种双特异性T-淋巴细胞激活剂的构建体的示意图。
[0021 ] 图2A和图2B显示了本发明的实施方式所述来自真核和原核表达系统的轻链桥连双特异性T-淋巴细胞激活剂的表达和纯化。图2B显示了考马斯亮蓝染色(组图A)和由BL-21 (DE3)pLysS表达的可溶蛋白上针对带His-标签的LCBTA的Western印迹(组图B)。两个组图中的泳道I和3是IPTG诱导前的提取物。两个组图中的泳道2和4是用IPTG诱导的提取物。泳道I和2表示Ka LCBTA-1的EpCAM靶向。泳道3和4表示Ka LCBTA-1的Her2/neu革巴向。
[0022]图3A显示选择的肿瘤靶向单克隆抗体和轻链桥连的双特异性T-淋巴细胞激活剂的尺寸排阻-高效液相色谱(SEC-HPLC)分析。图3B显示SEC-HPLC分析轻链桥连的双特异性T-淋巴细胞激活剂的均匀性和它们的抗原结合活性以及产率的改善。
[0023]图4A和4B显示了本发明的实施方式所述的结合⑶20+拉吉(Raji)淋巴瘤细胞、Her2/neu+BT474乳腺癌细胞、EpCAM+HT29结直肠癌细胞(图4A)和Jurkat淋巴瘤细胞的CD3(图4B)的不同肿瘤靶向轻链桥连的双特异性抗体的示例。
[0024]图5显示了本发明的实施方式所述的几个双特异性抗体的Ig轻链桥连的双特异性T-淋巴激活剂的瞬时表达的比较。
[0025]图6证明了 La LCBTA和Ka LCBTA的体外血清稳定性分析。
[0026]图7显示在单克隆抗体和本发明的实施方式所述肿瘤靶向双特异性抗体(同时靶向EpCAM和Her2)的刺激之后外周血单核细胞(PBMC)的细胞因子分泌概况的示例。
[0027]图8A显示了本发明的实施方式所述Ig轻链桥连的双特异性T-淋巴细胞激活剂对⑶20+B-淋巴瘤(拉吉)的细胞毒性。图SB显示了本发明的实施方式所述Ig轻链桥连的双特异性T-淋巴细胞激活剂对Her2/neu7EpCAM+结直肠癌(HT29)的细胞毒性。图8C显示了本发明的实施方式所述Ig轻链桥连的双特异性T-淋巴细胞激活剂对Herf/neu+/EpCAM+胰腺癌(Capan-1)的细胞毒性。
[0028]图9A显示由本发明的实施方式所述靶向⑶20的Ig轻链桥连的双特异性T-淋巴细胞激活剂根除肿瘤的移植研究。图9B显示由本发明的实施方式所述靶向Her2/neU的Ig轻链桥连的双特异性T-淋巴细胞激活剂根除肿瘤的移植研究。图9C显示由本发明的实施方式所述靶向EpCAM的Ig轻链桥连的双特异性T-淋巴细胞激活剂根除肿瘤的移植研究。
[0029]发明详述
[0030]本发明的实施方式涉及用于生物医学应用如临床治疗的具有免疫激活性质的新形式双特异性或多重特异性融合蛋白。本发明的实施方式所述的单体双特异性或多重特异性免疫激活分子可以指轻链桥连的双特异性免疫激活剂(LCBTA)，或更具体地指免疫球蛋白桥连的双特异性或多重特异性生物分子。本发明的实施方式所述的生物分子可以是双特异性的或多重特异性的。然而，为清楚起见，下面的说明书将这些分子称为“双特异性”分子。应理解这样提及“双特异性”旨在包括“双特异性”和“多重特异性”。
[0031]本发明的实施方式所述的双特异性分子可以包括连接两个靶向结构域的桥连结构域。本发明的实施方式所述的桥连结构域可以包括蛋白或肽，并且这两个靶向结构域可以分别连接桥连结构域的N-端和C-端。本发明的实施方式所述的这两个靶向结构域可以衍生自抗体的特异性结合结构域(即，可变区)。这两个靶向结构域之一可以是T-淋巴细胞-激活结构域，而另一个靶向结构域可以对靶标分子或细胞，诸如肿瘤细胞、肿瘤抗原、病毒、细菌等有特异性。
[0032] 本发明的双特异性分子的示例可以包括下式⑴和(VI)中所示的那些，其中TgD是靶向结构域，BD是桥连结构域，TAD是T-淋巴细胞激活结构域，并且LNK是接头:
[0033]TgD -BD-TAD式(I)
[0034]TAD -BD- TgD式(II)
[0035]TgD - LNK -BD- TAD 式(III)
[0036]TAD -BD- LNK - TgD 式(IV)
[0037]TgD - LNK -BD- LNK - TAD 式(V)
[0038]TAD - LNK -BD- LNK - TgD 式(VI)
[0039]一些示例可以包括靶向结构域和桥连结构域之间的接头。一些示例可以包括T-淋巴细胞-激活结构域和桥连结构域之间的接头。一些示例可以包括靶向结构域和桥连结构域之间的接头和T-淋巴细胞-激活结构域和桥连结构域之间的另一个接头。
[0040]按照本发明的实施方式，靶向结构域(TD)(例如，肿瘤靶向结构域、抗原靶向结构域、生物分子靶向结构域等)可以衍生自抗体的可变区。抗体衍生的靶向结构域可以包括轻链可变区和重链可变区，其可以两种构型(取向)存在:(1)轻链可变区在N-端而重链可变区在C-端，或(2)重链可变区在N-端而轻链可变区在C-端。
[0041]在靶向结构域(例如，肿瘤靶向结构域)中，重链可变区和轻链可变区可以与接头连接，其可以包括任意合适的接头，诸如短肽片段。例如，本发明的实施方式所述的接头可以包括短肽，其通常包括小氨基酸残基或亲水氨基酸残基(例如，甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺等)。这样的肽的一个示例是Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (G4S)。其他示例可以在序列中包含这些氨基酸的变换，诸如GGGSG、GGSGG, GSGGG或SGGGG。其他示例可以包括含有G或S以外的氨基酸残基的肽，诸如GGTGS、GTSPGG, GNGGGS等。本领域技术人员会理解许多常用的肽接头可以用于本发明的实施方式中。
[0042]按照本发明的实施方式，这样的短肽接头可以包括重复单元以增加接头长度。例如，一些接头可以包括2个G4S-重复的接头、3个G4S-重复的接头、或4个G4S-重复的接头。此外，一些“重复-样”接头可以包括不同肽序列的混合物，诸如G4S-GGSGG-G4S-SGGGG。
[0043]按照本发明的实施方式，桥连接头可以包括肽片段，优选衍生自抗体的片段。在优选的实施方式中，桥连结构域可以衍生自重链、轻链，具体地重链或轻链中的恒定区。例如，本发明的实施方式所述的桥可以衍生自轻链，诸如kappa(K)链、lambda-2 ( λ -2)链、或lambda-5 ( λ-5)链(或替代轻链)。在一些实施方式中，桥可以包括衍生自轻链的区域或结构域，诸如kappa O )链、lambda-2(A _2)链,或lambda-5 ( λ -5)链的恒定区。相似地，桥连结构域可以衍生自重链或重链的区域(例如，恒定区)。本文使用的术语“衍生自”是指桥连结构域与轻链或重链的结构域(例如，恒定区)的全长序列具有基本的同源性(例如，≥50%，优选≥70%，更优选≥80%，最优选≥90% )。
[0044]另外，按照本发明的实施方式，桥连结构域可以是模拟轻链恒定区的K链、λ链、或λ-5 (或替代轻链)的突变体，或K链、λ链、或λ-5替代轻链的衍生物。本文使用的“突变体”是指保守性突变体或非保守性突变体。如本文所述，本发明的实施方式所述的突变体保留了用作桥连结构域的功能。本领域技术人员会理解保守性突变体包括用相似的氨基酸取代氨基酸并且通常会具有保持的生物活性或结构。保守性突变体可以包括1-50个氨基酸取代，优选1-30个氨基酸，更优选1-20个氨基酸，并且最优选1-10个氨基酸。非保守性突变体可能具有一个或多个氨基酸残基，例如1-50个氨基酸，优选1-30个氨基酸，更优选1-20个氨基酸，并且最优选1-10个氨基酸的删除、取代或插入。
[0045]按照本发明的一些实施方式，桥(或桥连结构域)可以与靶向结构域和T-淋巴细胞激活结构域直接连接。按照本发明的其他实施方式，可以在桥和靶向结构域或T-淋巴细胞激活结构域之间提供接头。按照本发明的其他实施方式，可以在桥和靶向结构域之间提供一个接头，并且在桥和T-淋巴细胞激活结构域之间提供第二个接头。
[0046]桥连结构域和靶向结构域或T-淋巴细胞激活结构域之间的接头可与上述的那些结构域内接头相似。例如，桥连结构域和靶向结构域或T-淋巴细胞激活结构域之间的接头可以包括G4S接头或G4S-重复接头(其可以是双重复、三重复等)。另外，如上述，接头可以包括其他氨基酸序列。
[0047]按照本发明的实施方式，T-淋巴细胞激活结构域可以用或不用间插结构域与桥连结构域的一个末端相连用于T-淋巴细胞激活。各种T-淋巴细胞激活分子为本领域已知，包括抗-CD3抗体(单克隆或多克隆)，或此类抗体的CD3-结合片段或配体或对4-1BB分子的抗体。例如，按照本发明的实施方式，T-淋巴细胞激活结构域可以包括针对CD3的单克隆抗体的可变区。在这样的实施方式中，可以在两个取向上使用可变区的重链和轻链:(I)轻链可变区位于N-端并且重链可变区位于C-端，或(2)重链可变区位于N-端并且轻链可变区位于C-端。
[0048]与靶向结构域的描述相似，接头可连接T-淋巴细胞结合结构域的重链可变区和轻链可变区。例如，这样的接头可以包括任意合适的氨基酸序列，诸如G4S或双、三或四G4S-重复的接头。另外，接头可以包括其他氨基酸序列。
[0049]本发明的双特异性分子可以用于靶向细胞或分子，同时激活T-淋巴细胞应答。用下面的工作实施例来说明这些分子的一些生物用途。
[0050] 免疫球蛋白轻链桥连的双特异性T-淋巴细胞激活剂的产生
[0051]在第一组示例中，抗-CD20、抗-Her2/neu或抗-EpCAM ScFv (可变区的单链片段)用作细胞靶向结构域(CtD)，并且选择抗-⑶3 ScFv作为T-淋巴细胞激活结构域(TAD)。所选的CtD和TAD通过桥连接，例如其可能包括衍生自抗体轻链或重链的免疫球蛋白结构域。这类桥的示例可以包括选自人免疫球蛋白恒定区的那些。这类选自人免疫球蛋白恒定区的免疫球蛋白链桥的具体示例可能包括，但不限于以下所示的SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQID N0.3 和 SEQ ID N0.4:
[0052]?SEQIDN0.1:VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[0053]-人免疫球蛋白κ恒定区
[0054]?SEQIDN0.2:GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEK TV APTECS
[0055]-人免疫球蛋白λ2恒定区
[0056]?SEQIDN0.3:VTHVFGSGTQLTVLSQPKATPSVTLFPPS SE ELQANKATLVCL Met NDFYPGILTVTffKADGTPIT QG VEMetTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWRSRRSYSCQVMetHEGSTVEKTVAPTECS
[0057]-人免疫球蛋白λ5恒定区
[0058]?SEQIDN0.4:TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSC
[0059]-人免疫球蛋白重链恒定区I(CHl)
[0060]按照本发明的一些实施方式，CtD的C-端可以与所选桥(例如，衍生自人免疫球蛋白恒定区的桥)的N-端融合。按照本发明的其他实施方式，CtD的C-端可以与所选的接头序列的N-端融合，并且该接头随后与所选桥(例如，衍生自人免疫球蛋白恒定区的桥)的N-端融合。
[0061]在轻链桥的C-端，接头可以任选地与该桥的C-端融合。按照本发明的实施方式，接头可以包括任意合适的上述肽序列。例如，接头可以包括一个或多个GGGGS序列(G4S)，含有或不含其他序列(例如，铰链序列，CPPCP)。然后该构建体可以与TAD连接形成图1所示的双特异性分子。
[0062]如上述，本发明的一些实施方式可以在桥的N-端具有TAD，含有或不含间插接头，并且在桥的C-端具有CtD，含有或不含间插接头。此外，本领域技术人员会理解可以用针对其他靶标分子的其他特异性结合结构域取代CtD。
[0063]图1所示的LCBTA是二价(双特异性)分子，具有针对细胞靶标的一价特异性和针对T-淋巴细胞上的CD3分子的另一价特异性。该LCBTA可以在哺乳动物、真核或原核细胞中表达并纯化，例如通过轻链特异性亲和柱纯化至均一(图2)。SEC-HPLC(尺寸排阻HPLC)分析显示大多数的经纯化双特异性分子是单体形式(图3)。然而，ScFv的取向、结构域间接头的长度、ScFv结构域与桥连结构域的相容性、和/或翻译的效率可能影响双特异性分子的翻译和翻译后加工，其可能导致多聚体形成的增加和/或改变的生物功能(I和J，图 3,表 I)。
[0064]表1
[0065]
【权利要求】
1.一种双特异性融合蛋白，所述蛋白包含: 对感兴趣的第一靶标具有特异性的第一靶向结构域； 衍生自免疫球蛋白的轻链或重链的恒定区的桥连结构域；和 对感兴趣的第二靶标具有特异性的第二靶向结构域。
2.如权利要求1所述的双特异性融合蛋白，其特征在于，还包含融合到所述桥连结构域的N-端或C-端的接头。
3.如权利要求1或2所述的双特异性融合蛋白，其特征在于，所述第一靶向结构域融合到所述桥连结构域或所述接头上并且所述第二靶向结构域融合到所述桥连结构域或所述接头上。
4.如权利要求1-3中任一项所述的双特异性融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白是人免疫球蛋白。
5.如权利要求4所述的双特异性融合蛋白，其特征在于，所述桥连结构域是K链，λ链，λ-5替代轻链，或模拟轻链恒定区的所述K链、所述λ链、所述λ-5替代轻链的突变体，或所述K链、所述λ链、所述λ-5替代轻链的衍生物。
6.如权利要求2-5中任一项所述的双特异性融合蛋白，其特征在于，所述接头包含GGGGS序列。
7.如权利要求1-6中任一项所述的双特异性融合蛋白，其特征在于，所述第二靶向结构域是T-淋巴细胞激活结构域。
8.如权利要求1-7中任一项所述的双特异性融合蛋白，其特征在于，所述感兴趣的第一靶标是 CD20、Her2/neu 或 EpCAM。
9.如权利要求1-8中任一项所述的双特异性融合蛋白，其特征在于，所述第一靶向结构域包含对所述感兴趣的第一靶标具有特异性的第一 ScFv，并且所述第二靶向结构域包含对所述感兴趣的第二靶标具有特异性的第二 ScFv。
10.如权利要求9所述的双特异性融合蛋白，其特征在于，所述第一ScFv和所述第二ScFv各包含人序列。
11.如权利要求9或10所述的双特异性融合蛋白，其特征在于，所述第一ScFv包含对第一抗原具有结合特异性的VH-接头-VL或VL-接头-VH，并且所述第二 ScFv包含对第二抗原具有结合特异性的VH-接头-VL或VL-接头-VH。
12.如权利要求11所述的双特异性融合蛋白，其特征在于，所述接头包含GGGGS序列。
【文档编号】A61K39/395GK104185642SQ201280064787
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2012年12月27日 优先权日:2011年12月27日
【发明者】徐悠深, 许寿山, 张铭一, 骆正凯 申请人:财团法人生物技术开发中心, Dcb-美国有限责任公司