对t细胞活化性抗原和肿瘤抗原特异性的双特异性抗体及使用方法
【专利摘要】本发明涉及特异性结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体，其包含第一Fab片段和第二Fab片段，其中第二Fab重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的；且其中该双特异性抗体不包含Fc域；用于生成它们的方法，包含所述抗体的药物组合物，和它们的用途。
【专利说明】对T细胞活化性抗原和肿瘤抗原特异性的双特异性抗体及
使用方法
发明领域
[0001]本发明涉及特异性结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体，其包含第一 Fab片段和第二 Fab片段，其中第二 Fab重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的；且其中该双特异性抗体不包含Fe域；用于生成它们的方法，包含所述抗体的药物组合物，和它们的用途。
[0002]发明背景
[0003]在多种临床背景中常常想要选择性破坏个别细胞或特定细胞类型。例如，特异性破坏肿瘤细胞而使健康细胞和组织不受损害是癌症疗法的首要目标。一种办法是选择性诱导针对肿瘤的免疫应答，其触发免疫效应细胞(诸如天然杀伤(NK)细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL))攻击及随后破坏肿瘤细胞。CTL构成免疫系统最有力的效应细胞，然而它们不能通过由常规治疗性抗体的Fe域介导的效应器机制来激活。在此方面，能够结合癌细胞上的表面抗原及活化T细胞受体(TCR)复合物中的不变组分的双特异性抗体在最近几年已变得感兴趣。双特异性抗体对其靶物二者的同时结合迫使癌细胞和T细胞之间的暂时相互作用，引起细胞毒性T细胞活化和随后肿瘤细胞裂解。
[0004]已开发出数种双特异性抗体型式并调查了它们对T细胞介导的癌症免疫疗法的适宜性。其中，所谓的BiTE (双特异性T细胞衔接物(engager))分子已进行非常好地表征，而且早就在临床中显示出一些有希望的结果(综述见Nagorsen and BauerIe,Exp Cell Res317, 125 5-1260(2011) )。BiTE 是串联 scFv 分子，其中两个 scFv 分子通过柔性接头融合。针对T细胞衔接评估的其它双特异性型式包括双抗体(Holligeret al., Prot Eng9, 299-305 (1996))及其衍生物，诸如串联双抗体(Kipriyanov etal., J Mol Biol293，41-66 (1999))。一项最近的进展是所谓的DART (双重亲和力重新革El向)分子，其基于双抗体型式但特征在于实现额外稳定化的C端二硫桥(Moore etal.，Bloodll7, 4542-51 (2011))。所谓的triomab (其为完整杂合小鼠/大鼠IgG分子且目前亦在临床试验中评估)代表尺寸更大的型式(综述见Seimetz et al., Cancer TreatRev36, 458-467(2010))。
[0005]然而，至今已知的为T细胞介导的癌症免疫疗法开发的双特异性抗体具有涉及它们功效、毒性和适用性的重大缺点。小构建物(诸如例如BiTE分子)，虽然能够有效交联效应器和靶细胞，但是具有非常短的血清半衰期，从而要求通过连续输注对患者施用它们。另一方面，IgG样形式，虽然具有长半衰期的极大好处，但是受制于与IgG分子固有的天然效应器功能有关的毒性。这种免疫原性潜力构成IgG样双特异性抗体对于成功治疗剂开发的另一个不利特征。最后，双特异性抗体的一般开发中的一项主要挑战仍然是以临床充足的数量和纯度生产双特异性抗体构建物。具有不同特异性的抗体重和轻链在共表达时的错配降低正确装配的构建物的产率且导致许多无功能的副产物。
[0006]鉴于与目前可获得的用于T细胞介导的癌症免疫疗法的双特异性抗体有关的难点和缺点，仍然存在对此类分子的新颖的改进型式的需要。现在已经用本发明的新双特异性抗体克服了这些缺点。由于错配副产物的量减少(这显示聚集比本领域已知的双特异性抗体片段少)，能容易地以升高的产率生成新双特异性抗体。使用交换办法，能在不需要生成常规(common)轻链的情况下迫使正确的LC联合。另外，新双特异性抗体具有与许多常规双特异性抗体片段相比更高的分子量，如此防止过度肾清除且导致改进体内半衰期。新双特异性抗体是完全功能性的且具有与相应常规双特异性抗体相当或改进的结合和活性。
[0007]本发明提供设计用于T细胞活化和重新定向的双特异性抗原结合分子，其组合了良好的功效和生产能力与较低毒性和有利的药动学特性。
[0008]发明概述
[0009]本发明涉及特异性结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体，其包含第一 Fab片段和第二 Fab片段，其中第二 Fab重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的；且其中该双特异性抗体不包含Fe域。
[0010]本发明的抗体特异性结合肿瘤细胞的表面上的肿瘤抗原且同时结合T细胞活化性抗原。由此，所述双特异性抗体能够在肿瘤部位特异性引发免疫应答，随后导致靶细胞凋亡。
[0011]一方面，提供特异性结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体，其包含至少两个Fab片段，其中第一 Fab片段包含至少一个对肿瘤抗原(TA)特异性的抗原结合位点；且第二Fab片段包含至少一个对T细胞活化性抗原特异性的抗原结合位点，其中第
二Fab重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的；且其中该双特异性抗体不含Fe域。
[0012]特别地，本发明涉及如下的双特异性抗体，其中T细胞活化性抗原为CD3T细胞共同受体(CD3)靶抗原。
[0013]一方面，提供特异性结合⑶3T细胞共同受体(⑶3)抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体，其包含至少两个Fab片段，其中第一 Fab片段包含至少一个对肿瘤抗原(TA)特异性的抗原结合位点；且第二 Fab片段包含至少一个对⑶3T细胞共同受体(⑶3)特异性的抗原结合位点，其中第二 Fab重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的；且其中该双特异性抗体不含Fe域。在一个实施方案中，所述第一和第二 Fab片段经由肽接头连接。优选地，所述肽接头为(G4S)2接头。
[0014]在一个实施方案中，所述抗体另外包含第三Fab片段。在另一个实施方案中，所述第三Fab片段包含至少一个对肿瘤抗原特异性的抗原结合位点。在一个实施方案中，所述第三Fab片段连接所述第一 Fab片段的轻链或重链的N或C端。在另一个实施方案中，所述第三Fab片段连接所述第二 Fab片段的轻链或重链的N或C端。在一个实施方案中，所述第三Fab片段经由肽接头连接所述第一或第二 Fab片段。优选地，所述肽接头为(G4S) 2接头。
[0015]依照本发明的双特异性抗体至少是二价的，而且可以是三价的或多价的，例如四价的或六价的。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是二价的(1+1型式)，分别有一个结合位点各自靶向肿瘤抗原(TA)和T细胞活化性抗原。在另一个实施方案中，所述双特异性抗体是三价的(2+1型式)，有两个结合位点各自靶向肿瘤抗原(TA)且有一个结合位点靶向T细胞活化性抗原，如下节详述的。在一个优选的实施方案中，所述T细胞活化性抗原为CD3。
[0016]在第二个目标中，本发明涉及一种药物组合物，其包含本发明的双特异性抗体。[0017]在第三个目标中，本发明涉及本发明的双特异性抗体，其用于治疗癌症。在另一个实施方案中，提供所述双特异性抗体作为药物的用途。优选地，所述用途为用于治疗癌症。
[0018]在别的目标中，本发明涉及包含的序列编码本发明的双特异性抗体的重链的核酸序列，包含的序列编码本发明的双特异性抗体的轻链的核酸序列，包含本发明的核酸序列的表达载体和包含本发明的载体的原核或真核宿主细胞。另外，提供生成抗体的方法，其包括培养所述宿主细胞，使得所述抗体生成。
[0019]附图简述
[0020]图1:本发明的例示性双特异性抗体型式的示意图。a)Fab-Crossfab分子C端,b)Fab-Crossfab 分子 N 端,c) (Fab) 2-Crossfab 分子 C 端,d) (Fab) 2-Crossfab 分子 N 端,e)Fab-Crossfab-Fab 分子。
[0021]图2:hu Fab (MCSP)-Crossfab (CD3)生成和纯化的分析:SDS-Page:4_12%Bis/Tris (NuPage [invitrogen];考马斯染色):a) 1-标志物 12 (invitrogen), 2 -非还原的 hu Fab (MCSP) -Crossfab (CD3) ；b) 1-标志物 12 (invitrogen), 2 -还原的 huFab(MCSP)-Crossfab (CD3)。
[0022]图3:Fab (MCSP)-Crossfab (CD3)生成和纯化的分析。分析型大小排阻层析，层析图 A280 (Superdex20010/300GL[GE Healthcare] ；2mM MOPS pH7.3,150mM NaCl,0.02%(w/v) NaCl ;注入 50 μ g 样品)。
[0023]图4:hu Fab (MCSP) -Fab (MCSP) -Crossfab (CD3)生成和纯化的分析:SDS_Page:4-12%Bis/Tris (NuPage [invitrogen];考马斯染色):a) 1-标志物 12 (invitrogen), 2 -非还原的 hu Fab (MCSP) -Fab (MCSP) -Crossfab (CD3) ;b) 1-标志物 12 (invitrogen), 2 -还原的 hu Fab (MCSP) -Fab (MCSP) -Crossfab (CD3)。
[0024]图5:hu Fab (MCSP)-Fab (MCSP)-Crossfab (CD3)生成和纯化的分析。分析型大小排阻层析，层析图 A280 (Superdex20010/300GL[GE Healthcare] ；2mM MOPS pH7.3,150mMNaCl，0.02%(w/v) NaCl ;注入 50μ g 样品)。
[0025]图6:hu Fab (MCSP)-Crossfab (CD3)-Fab (MCSP)生成和纯化的分析。SDS-Page:4-12%Bis/Tris (NuPage [invitrogen];考马斯染色):a) 1-标志物 12 (invitrogen), 2 -非还原的 hu Fab (MCSP) -Crossfab (CD3) -Fab (MCSP) ;b) 1-标志物 12 (invitrogen), 2 -还原的 hu Fab (MCSP) -Crossfab (CD3) -Fab (MCSP)。
[0026]图7:hu Fab (MCSP)-Crossfab (CD3)-Fab (MCSP)生成和纯化的分析。分析型大小排阻层析，层析图 A280 (Superdex20010/300GL[GE Healthcare] ；2mM MOPS pH7.3,150mMNaCl，0.02%(w/v) NaCl ;注入 50μ g 样品)。
[0027]图8:鼠 Crossfab (CD3)-Fab (MCSP)-Fab (MCSP)生成和纯化的分析。SDS-Page:4-12%Bis/Tris (NuPage [invitrogen];考马斯染色):a) 1-标志物 12 (invitrogen), 2 -非还原的鼠 Crossfab (CD3)-Fab (MCSP)-Fab (MCSP) ；b) 1-标志物 12 (invitrogen)，2 -还原的鼠 Crossfab (CD3) -Fab (MCSP) -Fab (MCSP)。
[0028]图9:鼠Crossfab (CD3) -Fab (MCSP) -Fab (MCSP)生成和纯化的分析。分析型大小排阻层析，层析图 A280 (Superdex20010/300GL[GE Healthcare] ；2mM MOPS pH7.3,150mMNaCl，0.02%(w/v) NaCl ;注入 50μ g 样品)。
[0029]图10:在与人泛T细胞共培养(E:T比例=5:1)并通过不同浓度的huFab(MCSP)-Crossfab (CD3) (= “Fab-Crossfab”)、hu Fab(MCSP)-Crossfab (CD3)-Fab (MCSP) (= “Fab-Crossfab-Fab”)、hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab (CD3)(=“ (Fab) 2-Crossfab”)以及(scFv) 2 (抗 MCSP/ 抗 huCD3e) (= “ (scFv) 2”)双特异性分子活化20小时时MDA-MB-435肿瘤细胞的杀死(如通过LDH释放所测量的)。具有二价MCSP靶向的构建体显示了与“(scFv)2”构建体相比相当的细胞毒活性，而具有单价MCSP结合的“Fab-Crossfab ”构建体则明显的效力较低。
[0030]图11:hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) (= “(Fab)2-Crossfab”)和(scFv) 2 (抗MCSP/抗huCD3e) (= “(scFv) 2”)构建体的比较。所描绘的是在与人泛T细胞共培养(E:T比例=5:1)并通过不同浓度的双特异性构建体及相应IgG活化21小时时来自MDA-MB-435肿瘤细胞的LDH释放。“(Fab) 2-Crossfab”在靶细胞中至少像(scFv)2分子同等好的诱导凋亡。
[0031]图12:hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) (= “(Fab)2-Crossfab”)和(scFv) 2 (抗MCSP/抗huCD3e) (= “(scFv) 2”)构建体的比较。所描绘的是在与人PBMC共培养(E:T比例=10:1)并通过不同浓度的双特异性构建体及相应IgG活化26小时时来自MV-3人黑素瘤肿瘤细胞的LDH释放。“(Fab) 2-Crossfab”在靶细胞中至少像(scFv) 2分子同等好的诱导凋亡。
[0032]图13:由用靶向人MCSP 以及鼠 CD3 的鼠 Crossfab (CD3)-Fab (MCSP)-Fab (MCSP)构建体( = (Fab)2-CrossFab)活化的原代鼠T细胞所诱导的，来自B16/F10_huMCSP Fluc2克隆48肿瘤细胞的LDH释放。效应器对靶细胞的比例为5:1。在37°C，5%C02温育23.5小时后对该测定法进行分析。所述构建体诱导表达人MCSP之靶细胞的浓度依赖性的、T细胞介导的凋亡。
[0033]图14:由用 50nM 靶向人 MCSP 以及鼠 CD3 的鼠 Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)构建体( = (Fab)2-CrossFab)活化的原代鼠T细胞所诱导的，来自B16/F10-huMCSP Fluc2克隆48肿瘤细胞的LDH释放。效应器与靶细胞的比例是5:1。在37°C，5%C02温育23.5小时后对该测定法进行分析。所述构建体诱导表达人MCSP之靶细胞的T细胞介导之凋亡。在此构建体浓度下只有微弱的T细胞超活化。
[0034]图15:在存在(A，B)或缺失(C，D)Colo-38肿瘤细胞的情况下用InM不同CD3-MCSP双特异性构建体(hu Fab (MCSP)-Fab (MCSP)-Crossfab (CD3) (= “(Fab) 2-Crossfab”)和(scFv) 2 (抗MCSP/抗huCD3e) (= “(scFv) 2”))处理24小时后全血上清液中测量的不同细胞因子水平。将280 μ 1全血加到96孔板的每个孔中并加入30，000个Colo-38细胞，如所指示的。在存在Colo-38肿瘤细胞的情况下在T细胞活化时分泌的主要细胞因子是IL-6，随后是IFN Y。此外，在存在靶细胞的情况下在T细胞活化时粒酶B水平也有很大的升高。总的来说，在存在靶细胞的情况下(A和B)，“(scFv) 2”构建体与其它双特异性构建体相比稍微更多的提高了 TNF和IFN Y以及粒酶B的水平。
[0035]在存在(或缺失)靶细胞的情况下在双特异性构建体活化T细胞时没有显著的Th2细胞因子(IL-10和IL-4)分泌。在此测定法中在缺失靶细胞的情况下还有微弱的由“ (Fab) 2-Crossfab构建体诱导的IFN Y分泌。
[0036]图16:在自脾细胞分离的鼠泛T细胞上晚期活化标志物CD25的表面表达水平。如所指出的(E:T比例为10:1)，在存在或缺失B16/F10-huMCSP Fluc2克隆48肿瘤靶细胞的情况下将鼠泛T细胞与50nM鼠Crossfab (CD3) -Fab (MCSP) -Fab (MCSP)构建体( = (Fab) 2-CrossFab)双特异性构建体(靶向鼠CD3，以及人MCSP) —起温育。所描绘的是70小时后⑶8+T细胞上晚期活化标志物⑶25的表达水平。⑶8+T细胞上经由(Fab) 2-CrossFab构建体的⑶25上调仅发生在存在靶细胞的情况下。调整至相同摩尔浓度使用的参照IgG不能上调⑶25。
[0037]图17:Fab (CD33) -CrossFab (CD3)生成和纯化的分析。SDS-Page:a) 3_8%Tris/乙酸盐(NuPage [invitrogen];考马斯染色):a) 1- HiMark (invitrogen), 2 -非还原的 Fab(CD33)-CrossFab(CD3) ；b)4-12%Bis/Tris (NuPage[invitrogen]):1 -标志物 12(invitrogen), 2 -还原的 Fab (CD33) -CrossFab (CD3)。
[0038]图18:Fab (CD33) -CrossFab (CD3)生成和纯化的分析。分析型大小排阻层析，层析图 A280 (Superdex20010/300GL[GE Healthcare] ；2mM MOPS pH7.3,150mM NaCl,0.02%(w/v) NaCl ;注入 50 μ g 样品)。
[0039]图19:在与人PBMC(E:T比例=10:1)共培养并通过不同浓度⑶3-MCSP双特异性构建体(hu Fab (MCSP) -Crossfab (CD3)，命名为“ 1+1 无 Fe”;和(scFv) 2 (抗 MCSP/ 抗 huCD3e)
(scFv)2”)参照分子)活化24小时时MV-3肿瘤细胞的杀死(如通过LDH释放所测量的)。该“ 1+1无Fe”构建体在MV-3靶细胞中以25.4pM的计算EC50诱导凋亡，而“(scFv) 2”参照分子的计算EC50则为57pM，显示了 “1+1无Fe”分子在EC50方面稍好的效力。
[0040]图20:在存在huMCSP阳性MV-3肿瘤细胞的情况下，在与人PBMC(E:T比例=10:1)共培养，用CD3-MCSP双特异性构建体(分别是hu Fab (MCSP) -Crossfab (CD3)，命名为“ 1+1无 Fe”;和(scFv) 2 (抗 MCSP/ 抗 huCD3e) (= “(scFv) 2”)参照分子)处理约 24 小时时，CD4+或⑶8+T细胞的活化，如通过⑶69上调(A)、⑶69阳性细胞各自增加(B)所测定的。总的来说，与⑶4+T细胞相比，在⑶8+T细胞上⑶69中值更高。对两种构建体而言，⑶69中值以及CD69阳性细胞百分数均有明显的浓度依赖性增加。
[0041]图21: (scFv)2参照分子的图解。
[0042]图22: (scFv) 2 (抗 MCSP/ 抗 huCD3e)生成和纯化的分析。SDS-Page:4_12%Bis/Tris (NuPage [invitrogen];考马斯染色):1 -标志物 12 (invitrogen), 2 -还原的(scFv) 2 (抗 MCSP/ 抗 huCD3e)，3 -非还原的(scFv) 2 (抗 MCSP/ 抗 huCD3e)。
[0043]图23: (scFv)2(抗MCSP/抗huCD3e)生成和纯化的分析。分析型大小排阻层析，层析图A280(Superdex7510/300GL[GE Healthcare] ；2mM MOPS pH7.3,150mM NaCl,0.02%(w/v)NaCl ;注入 50μ g 样品((scFv)2(抗 MCSP/抗 huCD3e)))。
[0044]发明详述
[0045]1.定义
[0046]“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。一般地，可变域的FR由4个？1?域组成疋1?1、？1?2、？1?3、和？1?4。因而，HVR和FR序列在VH (或VL)中一般以如下的顺序出现:FR1-H1 (LI) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4。
[0047]出于本文中的目的，“受体人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定义的人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。
[0048]“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如 Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，NIHPublication91-3242, Bethesda MD (1991),第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组κ I。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组III。
[0049]在用于本文时，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的每个区。一般地，天然的4链抗体包含6个HVR;三个在VH中(Hl、Η2、Η3)，且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR —般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后一种是最高序列变异性的和/或牵涉抗原识别。例示性高变环存在于氨基酸残基 26-32 (LI) ,50-52 (L2) ,91-96 (L3) ,26-32 (Hl) ,53-55 (Η2)、和96-101 (Η3) (Chothia and Lesk, J.Mol.Biol.196:901-917 (1987))。例示性 CDR (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-Hl、CDR-H2 和 CDR-H3)存在于氨基酸残基 24-34 (LI)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31_35B(HI)、50_65(H2)、和95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteinsof Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda，MD(1991))。术语高变区(HVR)和互补决定区(CDR)在述及形成抗原结合区的可变区部分时在本文中可交换使用。此特定区域已由Kabat等，U.S.Dept, of Healthand Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983)及由Chothia等，J Mol Bioll96:901-917(1987)描述，其中定义包括在彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一种定义来指抗体或其变体的CDR意图在如本文中定义和使用的术语的范围内。涵盖如由上文引用的每篇参考文献定义的CDR的适宜的氨基酸残基在下表1中列出作为比较。 涵盖特定CDR的确切残基编号将随着CDR的序列和大小而变化。鉴于抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规确定哪些残基构成特定CDR。
[0050]表1:CDR 定义1
[0051]
【权利要求】
1.一种特异性结合T细胞活化性抗原和肿瘤抗原(TA)的双特异性抗体，其包含第一Fab片段和第二 Fab片段，其中第二 Fab重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的；且其中该双特异性抗体不包含Fe域。
2.权利要求1的双特异性抗体，其中所述第一Fab片段包含至少一个对肿瘤抗原特异性的抗原结合位点；且所述第二 Fab片段包含至少一个对T细胞活化性抗原特异性的抗原结合位点。
3.权利要求1或2的双特异性抗体，其中所述T细胞活化性抗原为CD3T细胞共同受体(CD3)抗原。
4.权利要求1至3任一项的双特异性抗体，其中所述第二Fab片段的N端连接所述第一Fab片段的C端。
5.权利要求1至4任一项的双特异性抗体，其另外包含第三Fab片段。
6.权利要求1至5任一项的双特异性抗体，其中所述第三Fab片段包含至少一个对肿瘤抗原特异性的抗原结合位点。
7.权利要求5或6的双特异性抗体，其中所述第三Fab片段连接所述第一Fab片段。
8.权利要求7的双特异性抗体，其中所述第三Fab片段的C端连接所述第一Fab片段的N端。
9.权利要求5或6的双特异性抗体，其中所述第三Fab片段连接所述第二Fab片段。
10.权利要求9的双特异性抗体，其中所述第三Fab片段的N端连接所述第一Fab片段的C端。
11.权利要求1至10任一项的双特异性抗体，其中所述Fab片段是经由肽接头连接的。
12.权利要求11的双特异性抗体，其中所述肽接头为(G4S)2接头。
13.权利要求1至12任一项的双特异性抗体，其中所述肿瘤抗原选自下组:黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，表皮生长因子受体(EGFR)，癌胚抗原(CEA)，成纤维细胞活化蛋白(FAP)和CD33。
14.权利要求13的双特异性抗体，其中所述肿瘤抗原为MCSP。
15.一种药物组合物，其包含权利要求1至14任一项的双特异性抗体。
16.权利要求1至14任一项的双特异性抗体，其用于治疗癌症。
17.权利要求1至14任一项的双特异性抗体，其用作药物。
18.权利要求1至14任一项的双特异性抗体在制备药物中的用途。
19.权利要求18的用途，其中所述药物用于治疗癌症。
20.一种原核或真核宿主细胞，其包含载体，该载体包含编码权利要求1至14任一项的双特异性抗体的轻链和重链的核酸分子。
21.一种生成抗体的方法,其包括培养权利要求20的宿主细胞，使得该抗体生成。
22.本文中描述的发明，尤其参见实施例。
【文档编号】A61P35/00GK103889452SQ201280050795
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年8月21日 优先权日:2011年8月23日
【发明者】P.布鲁恩克, T.福蒂, C.杰格, C.克莱恩, P.尤马纳 申请人:罗切格利卡特公司