纳米颗粒-肽组合物的利记博彩app
【专利摘要】本发明提供了纳米颗粒和包含这种纳米颗粒的组合物，以及肽的细胞内递送的方法，以及制备所述纳米颗粒和相关产品的方法。所述纳米颗粒包含包含金属和/或半导体原子的核；以及包含共价连接至核的多个配体的冠，其中所述多个中的至少第一配体包含经由第一接头共价连接至核的碳水化合物部分，并且其中所述多个中的至少第二配体包含经由第二接头共价连接至核的所选肽。第二接头包含肽部分和非肽部分，其中所述第二接头的所述肽部分包含序列X1X2Z1，其中：X1为选自A和G的氨基酸；X2为选自A和G的氨基酸；且Z1为选自Y和F的氨基酸。
【专利说明】纳米颗粒-肽组合物
发明领域
[0001]本发明涉及用于细胞内肽递送的物质和组合物，特别是肽的纳米颗粒-介导的递送。在特定情况下，本发明涉及表位肽的细胞内递送，例如，以诱导T细胞应答。可以采用细胞内肽递送用于治疗性和/或预防性处理，特别是肿瘤和/或病原体-介导的疾病，如细菌、病毒或寄生虫感染。
[0002]发明背景
[0003]基于肽的疗法如免疫疗法的设计与开发的显著挑战，是向细胞内隔室进行肽的细胞内递送。一个例子是需要将抗原肽递送至抗原加工机制，从而使得所述肽被呈递结合至MHC I类分子并且由此刺激CTL应答。其他例子包括将基于肽的药物递送至细胞内药物靶点。特别地，游离肽通常显示为被细胞弱摄取。
[0004]迄今为止已采用的一种方法是通过施用例如病毒载体的载体将肽递送至细胞内位置，所述载体包含编码所选肽的多聚核苷酸，从而使得所述细胞能由所述载体转染且所述肽由细胞翻 译机制制造。将肽递送至细胞内位置的策略的进一步例子在Muders etal.，2009，Clin Cancer Res1Vol.15 (12)，pp.4095-4103 中描述，其中 GIPC-PDZ靶向肽被递送至特定胰腺肿瘤细胞内。所述肽由N-末端豆蘧酰化(myristolation)修饰。
[0005]然而，仍然需要肽的细胞内递送的其他方法和组合物，例如，为了诱导免疫应答或对特定基于肽的药物的施用。本发明解决了这些和其它需要。
[0006]W02006/037979描述了包含抗原和佐剂的纳米颗粒，及包含所述纳米颗粒的免疫原性结构。
[0007]发明概述
[0008]广义而言，本发明涉及肽的基于纳米颗粒的细胞内递送。本发明人已经发现本文所描述的本发明的纳米颗粒能够被细胞摄取并由此将所选肽递送至细胞内靶点中，所述纳米颗粒具有包括经由特殊接头共价附着至纳米颗粒核的所选肽的冠。如本文所描述，所述所选肽可以随后从纳米颗粒中释放，例如通过特定的裂解过程，从而释放所述所选肽用于与细胞内靶点相互作用。这方面的一个例子是经由MHC I类分子将表位肽递送至APC用于加工和呈递，从而引起CTL应答。
[0009]相应地，在第一个方面本发明提供了一种纳米颗粒，其包含:
[0010](i)包含金属和/或半导体原子的核；
[0011](ii)包含共价连接至所述核的多个配体的冠，其中所述多个中的至少第一配体包含经由第一接头共价连接至所述核的碳水化合物部分或其中所述多个的所述第一配体包含谷胱甘肽，并且其中所述多个中的至少第二配体包含经由第二接头共价连接至所述核的所选肽，所述第二接头包含:
[0012]肽部分和非肽部分，其中所述第二接头的所述肽部分包含序列X1X2Z1，其中:
[0013]X1为选自A和G的氨基酸；
[0014]X2为选自A和G的氨基酸；和
[0015]Z1为选自Y和F的氨基酸。[0016]在依照本发明的在一些情况下，第二接头的非肽部分包含C2-C15烷基和/或C2-C15 二醇，例如乙硫酯基团或硫丙基团。
[0017]在依照本发明的在一些情况下，第一配体和/或所述第二配体经由含硫基团、含氨基的基团、含磷酸基团或含氧基团共价连接至核。
[0018]在依照本发明的在一些情况下，所述第二接头的所述肽部分包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成:
[0019](i)AAY;和
[0020](ii) FLAAY (SEQ ID NO:1)。
[0021]在特定优选的情况下，所述第二接头选自:
[0022](i) HS- (CH2) 2-C0NH-AAY ；
[0023](ii)HS-(CH2)2-C0NH-FLAAY ； [0024](iii)HS- (CH2) 3-CONH-AAY ；
[0025](iv) HS- (CH2) 3-CONH-FLAAY ；
[0026](V) HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH_AAY ；和
[0027](vi) HS- (CH2) 10- (CH2OCH2)「CONH-FLAAY，
[0028]其中所述第二接头经由所述接头的非肽部分的硫醇基团共价连接至所述核。
[0029]优选地，所述所选肽经由其N-末端连接至所述第二接头的所述肽部分。
[0030]在依照本发明的在一些情况下，所述第二配体选自:
[0031 ] (i) HS- (CH2) 2-C0NH-AAYZ2 ；
[0032](ii)HS-(CH2)2-C0NH-FLAAYZ2 ；
[0033](iii)HS- (CH2) 3-C0NH-AAYZ2 ；
[0034](iv) HS- (CH2) 3-C0NH-FLAAYZ2 ；
[0035](V) HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH_AAYZ2 ;和
[0036](vi) HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH_FLAAYZ2，
[0037]其中Z2代表所述所选肽。
[0038]在依照本发明的在一些情况下，所述所选肽是与主要组织相容性复合体(MHC) I类分子结合的表位肽，或者其能够经过加工与MHCI类分子结合。
[0039]在依照本发明的在一些情况下，所述所选肽由8至40个氨基酸残基的序列组成。特别地，所述所选肽可以由8至12个氨基酸残基的序列组成。
[0040]在依照本发明的在一些情况下，所述所选肽是能够被MHC I类分子呈递从而刺激细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的表位肽。
[0041]在依照本发明的在一些情况下，所述所选肽形成肿瘤相关抗原(TAA)或病毒_、细菌-或寄生虫相关抗原的至少一部分或者来自肿瘤相关抗原(TAA)或病毒_、细菌-或寄生虫相关抗原。特别地，所述TAA可以是肺癌抗原。所述肺癌在一些情况下可以选自:小细胞肺癌和任何非小细胞肺癌，任选地，其中所述非小细胞肺癌包含腺癌。病原体相关抗原在一些情况下可以是病毒、细菌或寄生虫抗原。
[0042]在依照本发明的在一些情况下，所述第一配体的碳水化合物部分包含单糖和/或二糖。特别地，所述碳水化合物部分可以包含葡萄糖、甘露糖、海藻糖和/或N-乙酰氨基葡萄糖。[0043]在依照本发明的在一些情况下，所述多个配体包含选自下述的一个或多个配体:葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖和谷胱甘肽，另外还包含所述所选肽的一个或多个配体。
[0044]在依照本发明的在一些情况下，所述多个配体包含:
[0045](a)葡萄糖；
[0046](b)N-乙酰氨基葡萄糖；
[0047](c)谷胱甘肽；
[0048](d)葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖；
[0049](e)葡萄糖和谷胱甘肽；
[0050](f) N-乙酰氨基葡萄糖和谷胱甘肽；或
[0051](g)葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖和谷胱甘肽，
[0052]除了所述配体包含所述所选肽。
[0053]在依照本发明的在一些情况下，所述第一接头包含C2-C15烷基和/或C2-C15 二醇。
[0054]在依照本发明的在一些情况下，所述第一配体包含经由硫醇硫原子共价附着至核的2’ -硫乙基_β-D-吡喃葡萄糖苷或2’ -硫乙基-a-D-吡喃葡萄糖苷。
[0055]在依照本发明的在一些情况下，所述纳米颗粒包含至少10、至少20、至少30、至少40或至少50个含碳水化合物的配体和/或谷胱甘肽配体。
[0056]在依照本发明的在一些情况下，所述纳米颗粒包含至少1、至少2、至少3、至少4或至少5个含肽的配体。
[0057]在依照本发明的在一些情况下，含碳水化合物的配体和/或谷胱甘肽配体与含肽的配体的摩尔比的范围为5:1至100:1，例如的范围为10:1至30:1。
[0058]在依照本发明的在一些情况下，所述纳米颗粒的核的直径的范围为Inm至5nm。
[0059]在依照本发明的在一些情况下，所述纳米颗粒包括其配体的直径的范围为5nm至20nm,任选地 5nm 至 15nm 或 8nm 至 10nm。
[0060]在依照本发明的在一些情况下，所述核包含选自下述的金属:Au、Ag、Cu、Pt、Pd、Fe、Co、Gd、Zn或其任何组合。
[0061]在依照本发明的在一些情况下，所述核是磁性的。
[0062]在依照本发明的在一些情况下，所述核包含半导体。特别地，所述半导体在一些情况下可以选自:硒化镉、硫化镉、碲化镉和硫化锌。
[0063]在依照本发明的在一些情况下，所述核能够作为量子点。
[0064]在依照本发明的在一些情况下，所述纳米颗粒包含至少两个含所选肽的配体，并且其中至少两个含所选肽的配体各自的所选肽不同。
[0065]在依照本发明的在一些情况下，所述至少两个含所选肽的配体的所选肽各自形成一种或多种抗原的至少一部分或各自来自一种或多种抗原，所述抗原例如TAA。在依照本发明的在一些情况下，所述至少两个含所选肽的配体的所选肽各自形成不同的肺癌TAA的至少一部分或者各自来自不同的肺癌TAA。
[0066]在进一步方面，本发明提供了包含依照本发明的第一方面的多个纳米颗粒的组合物。该组合物可以进一步包含至少一种药学可接受的载体、盐和/或稀释剂。
[0067]在依照本发明的在一些情况下，所述组合物包含具有第一含所选肽的配体的第一种类纳米颗粒和具有第二含所选肽的配体的第二种类纳米颗粒，其中所述第一和第二种类的所选肽不同。所述第一和第二种类纳米颗粒各自的所选肽在一些情况下可以形成一种或多种抗原的至少一部分或者各自来自一种或多种抗原，所述抗原例如TAA。
[0068]在依照本发明的在一些情况下，本发明的组合物可以包含至少3个、至少4个、至少5个或至少10个不同种类的纳米颗粒的库，各种类具有不同的所选肽。
[0069]所述组合物可以进一步包含至少一种佐剂，所述佐剂可任选地共价附着至至少一个纳米颗粒的核。备选地，本发明的组合物可以基本上不含佐剂或可以由纳米颗粒提供唯一的佐剂功效。
[0070]在进一步方面，本发明提供了包含本发明的组合物的疫苗。所述疫苗可以用于癌症包括肺癌的治疗性或预防性处理。
[0071]在进一步方面，本发明提供了在医学中使用的本发明的纳米颗粒、组合物或疫苗。
[0072]所述纳米颗粒、组合物或疫苗可以在处理哺乳动物受试者中的癌症或病原体感染的方法中使用。
[0073]在进一步方面，本发明提供了本发明的纳米颗粒、组合物或疫苗在制备用于处理哺乳动物受试者中的癌症或病原体感染的药物中的用途。
[0074]本发明的纳米颗粒、组合物或疫苗可以经由淋巴摄取的施用。
[0075]在进一步方面，本发明提供了癌症或病原体感染的预防性或治疗性处理的方法，其包含对此需要的哺乳动物受试者施用预防或治疗足够量的纳米颗粒、组合物或疫苗。在依照本发明的所述方法方面的一些情况下，所述纳米颗粒、组合物或疫苗经由选自下述的途径施用:
[0076]在淋巴摄取的位点或其附近向哺乳动物受试者的器官或组织中注射；
[0077]经由喷雾或凝胶的鼻腔递送；
[0078]经由喷雾或凝胶或口服可溶解薄膜的颊递送；
[0079] 经由可溶解薄膜的口腔递送；
[0080]经由掺入纳米颗粒的贴片的透皮递送；和
[0081]包含纳米颗粒的组合物的吸入递送。
[0082]在进一步方面，本发明提供了用于产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的体外或体内方法，其包含:
[0083](i)使至少一种抗原呈递细胞(APC)与本发明的至少一种纳米颗粒接触，从而使得所述所选肽被呈递到所述APC的MHC I类分子上；和
[0084](ii)使(i)中的所述至少一种APC与至少一种CTL细胞接触，从而使得所述CTL细胞由所述APC激活以产生对所述所选肽特异性的CTL应答，其中所述所选肽是表位肽。
[0085]在依照本发明的一些情况下，所述APC在所述纳米颗粒的存在下进行培养，并且同时或相继地，与所述CTL细胞共培养。任选地，所述APC在与纳米颗粒接触后、与所述CTL细胞共培养前接受洗涤步骤。在一些情况下，所述方法可以进一步包含对哺乳动物受试者施用所述CTL细胞。
[0086]在依照本发明的一些情况下，所述纳米颗粒可以通过选自下述的施用途径递送:
[0087]在淋巴摄取的位点或其附近向哺乳动物受试者的器官或组织中注射；
[0088]经由喷雾或凝胶的鼻腔递送；[0089]经由喷雾或凝胶或口服可溶解薄膜的颊递送；
[0090]经由 可溶解薄膜的口腔递送；
[0091]经由掺入纳米颗粒的贴片的透皮递送；和
[0092]包含纳米颗粒的组合物的吸入递送。
[0093]在一些情况下，所述至少一种纳米颗粒包含具有不同所选肽的纳米颗粒的库。
[0094]在进一步方面，本发明提供了制造依照本发明的纳米颗粒的方法，其包含:
[0095]衍生具有第一接头的碳水化合物；
[0096]衍生具有第二接头的所选肽；和
[0097]使第一接头-衍生的碳水化合物和第二接头-衍生的所选肽与反应物反应，以制造纳米颗粒的核，使得在纳米颗粒的自组装过程中，所述纳米颗粒核经由它们各自的接头附着碳水化合物和所选肽。在一些情况下，所述反应混合物包含衍生的碳水化合物、衍生的所选肽、金属和/或半导体原子的盐以及还原剂以制造纳米颗粒。另外地或备选地，所述碳水化合物可以由谷胱甘肽取代或补充。
[0098]在依照本发明的这个或其他方面的特定情况下，包括纳米颗粒的所述反应产物，接受纯化步骤以除去未反应的游离肽，任选地，其中所述纯化步骤包含使所述反应产物通过 G-50Sephadex? 柱。
[0099]在依照本发明的这个或其他方面的特定情况下，所述方法可以进一步包含以至少一种药学可接受的载体、盐或稀释剂将所述纳米颗粒配制成组合物的步骤。
[0100]在依照本发明的这个或其他方面的特定情况下，所述方法用于将所述所选肽经由所述第二接头附着至所述纳米颗粒，从而使得具有所附着的所选肽的纳米颗粒能够被细胞内化。
[0101]在依照本发明的这个或其他方面的特定情况下，所述方法用于将所述所选肽经由所述第二接头附着至所述纳米颗粒，从而使得具有所附着的所选肽的纳米颗粒能够被抗原呈递细胞(APC)内化。
[0102]在进一步方面，本发明提供了用于所选肽的细胞内递送的方法，其包含使细胞与本发明的纳米颗粒或组合物接触。
[0103]在进一步方面，本发明提供了本发明的纳米颗粒或组合物在用于所选肽的细胞内递送中的用途。
[0104]本发明包括所述方面和优选特征的组合，除了其中此类组合明显不允许或陈述为特别避免之外。本发明的这些和进一步方面和实施方案在下文且就伴随实施例和附图而言进一步详细描述。
[0105]附图简述
[0106]图1显示了来自GNP的SIINFEKL (SEQ ID NO:2)呈递:将LKb细胞接种到24孔板中，并使其附着过夜。接着，GNP被脉冲到lug/mL (绿色)、0.lug/mL (蓝色)或0.01ug/mL(红色)当量的肽。两小时后，洗涤细胞，并用25.Dl.16 (Angel)的抗体标签而进行(A-D)流式细胞仪，或(E)结合B3Z CTL过夜共培养。第二天，裂解细胞并测量半乳糖苷酶的活性。
[0107]图2 =GNP呈递对比游离肽呈递:(A_B)GNP8和9用S^hadex柱分离成15个级分，接着用UV吸收就蛋白质水平对其分析。图2A中的红线(用圆圈表示)仅代表游离肽。(C-H)以标注的GNP或相应的标注浓度的游离肽脉冲LKb细胞2小时(lug/mL肽(绿色)，0.1ug/mL(蓝色)，或0.01ug/mL(红色))。用(C-F)流式细胞仪或(G_H)B3Z测定法读数。(1-N)以标注的游离肽在冰上(1-K)或在37°C (L-N)脉冲LKb2小时。接着，用流式细胞仪就SIINFEKL(SEQ ID NO:2)的呈递分析细胞。直方图的红色部分代表对比非脉冲细胞的阳性染色。
[0108]图3:来自缺乏游离肽的制备物的GNP呈递:(A_B)GNP8和9的新制备物用Sephadex G_50柱分离成15个级分,接着用UV吸收就蛋白质水平对其分析。箭头表示哪些级分合并以供进一步使用。(C-E，F)以标注浓度(lug/mL肽(绿色)，或0.lug/mL(红色))的标注的GNP先前制备物(旧GNP)或来自(A和B)的较新制备物(新GNP)脉冲LKb细胞2小时。用(C-E)流式细胞仪或(F)B3Z测定法读数。
[0109]发明详述
[0110]在描述本发明中，将采用下述术语并且意在如下所示定义。
[0111]如本文使用的，“纳米颗粒”指具有纳米级别的颗粒，并且不意于表达任何特别形状限制。特别地，“纳米颗粒”包含纳米球、纳米管、纳米盒、纳米簇、纳米棒等。在特定实施方案中，本文考虑的纳米颗粒和/或纳米颗粒核一般具有多面体或球体几何学。
[0112]包含多个含碳水化合物的配体的纳米颗粒已在例如W02002/032404、W02004/108165, W 02005/116226, W02006/037979, W02007/015105, W02007/122388,W02005/091704 (其各自的完整内容特别通过引用合并入本文)中描述，并且此类纳米颗粒可以依照本发明使用。此外，包含由有机化合物官能化(例如经由硫醇-金键)的氧化铁铁氧体(具有式XFe2O4，其中X=Fe、Mn或Co)的磁核的金涂布纳米颗粒在EP2305310 (其完整内容特别通过引用合并入本文)中描述，并且特别考虑作为纳米颗粒/纳米颗粒核依照本发明使用。
[0113]如本文使用的，“冠”指层或涂层，其可以部分或完全覆盖纳米颗粒核的暴露表面。冠包括多个配体，其包括至少一个碳水化合物部分、一个表面活性剂部分和/或一个谷胱甘肽部分。因此，冠可以视为围绕或部分围绕金属性核的有机层。在特定实施方案中，冠提供和/或参与纳米颗粒的核的钝化。因此，在特定情况下，冠可以包括基本上稳定化含金属核的足够完全的涂布层。然而，本文特别考虑具有核的特定纳米颗粒，例如那些包括由贵金属涂布的含金属氧化物的内核的，其可以包括仅部分涂布核表面的冠。在特定情况下，冠促进本发明的纳米颗粒的溶解性，如水溶性。
[0114]纳米颗粒
[0115]纳米颗粒是例如金属或半导体原子的簇的小颗粒，其可以用作固定化配体的底物。
[0116]优选地，所述纳米颗粒具有的核具有0.5-50nm之间的平均直径，更优选0.5-10nm之间，更优选0.5-5nm之间，还更优选0.5_3nm之间且仍然更优选0.5-2.5nm之间。除核之外还考虑配体时，优选地所述颗粒的总平均直径在5.0-1OOnm之间，更优选5_50nm之间且最优选5-10nm之间。平均直径可以使用本领域中熟知的技术例如透射电子显微镜测量。
[0117]核材料可以是金属或半导体且可以由多于一种类型的原子形成。优选地，所述核材料是选自Au、Fe或Cu的金属。纳米颗粒核也可由包括Au/Fe、Au/Cu、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/Gd和Au/Fe/Cu/Gd的合金形成，并且可以在本发明中使用。优选的核材料是Au和Fe，而最优选的金属为Au。纳米颗粒的核优选地包含约100 - 500个的原子(例如金原子)以提供在纳米范围内的核直径。其他特别有用的核材料掺入一种或多种NMR活性的原子，其允许使用NMR在体外和体内检测所述纳米颗粒。NMR活性原子的例子包括Mn+2、Gd+3、Eu+2、Cu+2、V+2、Co+2、Ni+2、Fe+2、Fe+3和镧系元素+3，或本申请别处所描述的量子点。
[0118]包含半导体原子的纳米颗粒核可被检测为能够充当量子点的纳米级别的半导体晶体，即它们可以吸收光从而激发材料中的电子至更高的能量水平，随后在材料的频率特性释放光的光子。半导体核材料的一个例子是硒化镉、硫化镉和碲化镉。另外还包括锌化合物，如硫化锌。
[0119]在一些实施方案中，所述纳米颗粒核可以是磁性的和包含磁性金属原子，任选地与钝态金属原子组合。举例，所述钝态金属可以是金、钼、银或铜，所述磁性金属可以是铁或钆。在优选的实施方案中，钝态金属是金而磁性金属是铁。在这种情况下，方便起见核中钝态金属原子与磁性金属原子的比例在约5:0.1-约2:5之间。更优选地，该比例在约5:0.1-约5:1之间。如本文使用的，术语“钝态金属”指不显示磁性质并且对氧化化学稳定的金属。钝态金属可以是反磁性或超顺磁性。优选地，此类纳米颗粒是超顺磁性的。
[0120]具有包含顺磁性金属的核的纳米颗粒的例子包括包含Mn+2、Gd+3、Eu+2、Cu+2、V+2、Co+2、Ni+2、Fe+2、Fe+3和镧系元素+3的那些。
[0121]其他磁性纳米颗粒可由例如MnFe (尖晶石铁素体)的金属形成或者CoFe (钴铁素体)可以形成纳米颗粒(磁性流体，其加入或不加入以上定义的核材料)。用于制造此类纳米颗粒的自组装附着化学的例子在Biotechnol.Prog., 19:1095-100 (2003)、J.Am.Chem.Soc.125:9828-33(2003)和 J.Colloid Interface Sc1.255:293-8 (2002)中给出。
[0122]在一些实施方案中，所述纳米颗粒或其配体包含可检测标签。该标签可以是纳米颗粒或配体的核的元素。该标签可被检测，是因为纳米颗粒的那个元素的固有属性或可通过与其他可被检测的部分连接、缀合或关联。标签的优选例子包括的标签为:荧光基团、放射性核素、磁性标签或染料。荧光基团包括荧光素、若丹明或四甲基若丹明、德克萨斯-红、Cy3, Cy5等，并且可以使用Raman散射光谱法通过荧光标签的激发和发射光的检测来检测(Y.C.Cao, R.Jin, C.A.Mirkin, Science2002, 297:1536-1539)。
[0123]在一些实施方案中，纳米颗粒可以包含在检测纳米颗粒中使用的放射性核素，其使用由该放射性核素发射的放射性活度，例如通过使用PET、SPECT、或用于疗法，例如用于杀死靶细胞。可容易地适应在本发明中使用的本领域中常用的放射性核素例子包括"mTc，其存在多种氧化态，尽管最稳定的是TcO4- ；32P或33P ；57Co; 59Fe;通常用作Cu2+盐的67Cu ;常用作Ga3+盐的67Ga,例如柠檬酸镓；68Ge; 82Sr; "Mo; ltl3Pd; —般用作In3+盐的111In 般用作碘化钠的 125I 或 131I ；137Cs;153Gd;153Sm;158Au;186Re; 一般用作 Tl+盐例如氯化铊的 2tllTl ；39Y3+ ；71LU3+ ;和24&2+。放射性核素作为标签和示踪物的一般用途是本领域熟知的且技术人员可容易地使其适应在本发明的各方面中使用。所述放射性核素可以这样最容易地采用，即通过掺入所述纳米颗粒核或将它们包括在作为固定在纳米颗粒上的配体部分而存在的标签。
[0124]另外地或备选地，本发明的纳米颗粒，或它们与其他种类相互作用的结果可使用许多本领域公知的技术来检测，所述技术使用上述与纳米颗粒相关联的标签或通过采用它们的属性。检测纳 米颗粒的这些方法的范围可以从检测纳米颗粒结合到其他种类时导致的聚集，例如通过简单的目视检查或通过使用光散射(含纳米颗粒溶液的透射率)，到使用复杂的技术如透射电子显微镜(TEM)或原子力显微镜(AFM)以可视化所述纳米颗粒。检测金属颗粒的进一步方法是采用等离子共振，该等离子共振是在金属表面上电子的激发，其通常由光辐射引起。表面等离子共振(SPR)的现象存在于金属(例如Ag或Au)与介电材料例如空气或水的界面。与固定在纳米颗粒表面上的配体结合的分析物改变所述界面的折射率时，发生SPR中的变化。SPR的进一步优点是它可以用于监测实时相互作用。如上所述，如果纳米颗粒包括或掺入有NMR活性的原子，那么此项技术可以在体外或体内检测颗粒时使用，其中使用本领域熟知的技术。对纳米颗粒的检测也可以使用基于定量信号放大的系统，该系统使用纳米颗粒促进的对银的还原(I)。如果所述纳米颗粒包括作为荧光探针的配体，则可使用荧光光谱法。同样，对碳水化合物的同位素标签可以用来方便它们的检测。
[0125]所诜狀
[0126]本发明的纳米颗粒包含经由接头(“所述第二接头”)共价连接至纳米颗粒核的含肽的配体(“所述第二配体”)。所述第二配体包含适用于细胞内递送的肽。此“所选肽”可以是任何合适的肽。特别地，所述肽可以是能够在递送至细胞内位点时发挥作用的较大多肽的片段。在特定情况下，所述所选肽可以是基于肽的药物。在特定情况下，所述所选肽可包含在递送至例如APC的细胞内室时产生免疫应答的表位(“表位肽”)。在特定优选的情况下，所述所选肽可以是结合于主要组织相容性复合体(MHC) I类分子或能够被加工从而结合于MHCI类分子的肽。在依照本发明一些情况下，所述所选肽可以由8至40个氨基酸残基的序列组成，例如8至12个氨基酸残基的序列。在特定情况下，所述所选肽可以能够被MHC I类分子呈递从而刺激细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。此种表位肽可形成肿瘤相关抗原(TAA)或病原体相关抗原(例如病毒、细菌或寄生虫抗原)的至少一部分或者来自肿瘤相关抗原(TAA)或 病原体相关抗原(例如病毒、细菌或寄生虫抗原)。在一些情况下，所述所选肽可以是肽药物，例如靶向细胞内靶点的一种肽。此种细胞内靶向肽的一个例子是 GIPC-PDZ 域抑制剂，其描述于 Muders et al.，2009，Clin Cancer Res, Vol.15(12),PP.4095-4103(其完整内容特别通过引用合并入本).[0127]施用和处理
[0128]本发明的纳米颗粒和组合物可以通过任意数量的不同途径施用于患者，其包括肠内或肠胃外途径。肠胃外施用包括通过下述途径的施用:静脉内、皮肤或皮下、鼻、肌肉内、眼内、经上皮、腹膜内和局部(包括皮肤、眼、直肠、鼻、吸入和气雾剂)，以及直肠全身性途径。
[0129]施用的执行通过例如注射或冲击地使用递送枪以加速它们的透皮通道穿过表皮的外层。所述纳米颗粒接着可以被例如树突状细胞摄取，所述纳米颗粒当它们通过淋巴系统迁移时成熟，导致对免疫应答的调节和针对表位肽和/或表位肽来自其中或形成其一部分的抗原的免疫接种。纳米颗粒也可以以气雾剂递送。纳米颗粒的小尺寸使其成为可能。
[0130]本发明的纳米颗粒的超小尺寸对于递送至细胞和组织中是很大的优势，因为它们即使当连接至靶向或治疗性分子时仍可以被细胞摄取。因此，纳米颗粒可被细胞例如APC内化，肽被加工和释放，例如用于经由MHC I类的呈递或用于与细胞内组分的相互作用。
[0131]本发明的纳米颗粒可被配制成可能是固体或液体组合物形式的药物组合物。此种组合物将通常包含某种形式的载体，例如固体载体如明胶或佐剂或惰性稀释剂，或者液体载体如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、或二醇如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。此种组合物和制备物通常含有至少0.lwt%的化合物。
[0132]对于静脉内，皮肤或皮下注射，或者注射在痛苦部位，活性成分将以不经肠道的可接受的水溶液的形式，其是无热原的并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员完全能够使用例如所述化合物或其衍生物的溶液以制备合适的溶液，例如在生理盐水中，以甘油、液体聚乙二醇或油制备的分散物。
[0133]除了一种或多种化合物，任选地与其他活性成分组合，所述组合物可以包含一种或多种药学可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂，等渗剂、防腐剂或抗氧化剂或本领域技术人员熟知的其他材料。此种材料应该是无毒的，并且不应与活性成分的功效干涉。所述载体或其他材料的确切性质可取决于施用的途径，例如口服或不经肠道。
[0134]液体药学组合物通常配制成具有在约3.0-9.0之间的pH，更优选在约4.5-8.5之间并且仍然更优选在约5.0-8.0之间。组合物的pH可以通过使用缓冲液如醋酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、Tris或组氨酸来维持，通常采用的范围从约lmM-50mM。组合物的pH可以另外通过使用生理学可接受的酸或碱来调节。
[0135]防腐剂通常包括在药物组合物中以延缓微生物生长，延长组合物的保质期并且允许多次使用的包装。防腐剂的例子包括苯酚、间甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸及其酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲烃铵氯化物和苄索氯铵。防腐剂通常采用的范围为约
0.1-1.0% (w/v)。
[0136]优选地，所述药学组合物以预防有效量或治疗有效量(视情况而定，虽然预防可被视为治疗)给个体，这足以显示出对个体有利。通常，这将引起对个体有利的治疗上有用的活性。所施用的化合物的实际量，以及施用的速率和时间过程将取决于所处理的病症的性质和严重程度。处理的处方例如剂量决定等在全科医生和其它医生的责任范围内，并且通常考虑所处理的病症、个体患者的情况、递送位点、施用方法和医生已知的其他因素。上述技术和方案的例子可以在 Handbook of Pharmaceutical Additives, 2nd Edition(eds.M.Ash and 1.Ash),2001 (Synapse Information Resources, Inc., Endicott, NewYork,USA) ;Remington’ s Pharmaceutical Sciences,20th Edition,2000, pub.Lippincott, ffilliams&ffilkins;以及 Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2ndedition, 1994中找到。举例为证，组合物优选地施用于患者的剂量是每kg体重的活性化合物在约0.01-1OOmg之间，并且更优选地在体重的0.5-10mg/kg之间。
[0137]可以理解，就处理肿瘤而言，处理包括医师采取任何缓解肿瘤对患者的影响的措施。因此，尽管肿瘤的完全缓解是一个期望的目标，有效的处理将也包括能够实现肿瘤的部分缓解，以及减缓肿瘤包括癌转移的生长速率的任何措施。此种措施可有效延长和/或提高生活质量以及缓解疾病的症状。
[0138]免疫疗法
[0139]本发明的组合物，例根据权利要求中定义的疫苗，在一些情况下可以用于疾病如癌症的预防和处理，且更特殊地用于免疫疗法。
[0140] 在本发明中，术语“免疫接种”表示主动免疫，即因施用而产生的特异性免疫应答的诱导，该施用为例如经由皮下、皮内、肌肉内、口服或经鼻途径的少量的抗原，该抗原被所接种个体识别为外源的，因此在合适的配方中是免疫原性的。因此抗原被用作免疫系统的“触发”，以建立针对该抗原的特异性免疫应答。[0141]依照本发明，免疫接种可以是治疗性或预防性的。举例为证，也许能够通过对不患癌症的个体进行免疫接种而达到针对癌症疾病的出现的预防性保护。可能应用此种预防性接种疫苗的个体的例子是具有罹患癌症的风险增加的个体，尽管这种应用不限于此种个体。处于癌症风险的患者可以已经产生肿瘤，无论是作为原发肿瘤还是转移灶，或者显示出癌症的倾向。
[0142]对于依照本发明的癌症患者的主动免疫，纳米颗粒通常配制成疫苗。优选地，此种药学制备物含有药学可接受的载体，举例，其可进一步包含辅助物质、缓冲液、盐和/或防腐剂。所述药学制备物可以，例如用于癌症相关病况的预防和疗法，如癌症患者中的转移形成。这样，抗原呈递细胞在体内或也在离体被特别调制从而引起针对的TAA的免疫应答。
[0143]对于以特定抗原或抗原组合的主动免疫，通常使用含有免疫原的疫苗制剂-免疫原无论是天然的TAA或其表位，模拟物或新表位模拟物，-多半是在低浓度时，例如免疫原性量的范围从0.01 μ g-10mg，但是剂量范围可提高到范围为100-500mg。取决于例如由外来种类的序列或通过衍生化决定的免疫接种抗原的免疫原性，或也取决于分别使用的辅助物质或佐剂，所述合适的免疫原性剂量可选择在例如的范围为0.01 μ g-lmg，优选100yg-500ygo但是，将在一个长时期内被递送至生物体的储库疫苗也含有高得多的疫苗抗原量，例如至少Img-1OOmg以上。浓度将取决于施用的液体或悬浮疫苗的量。疫苗通常提供在即时可用的注射器或安瓿内，具有的体积范围从0.01-1ml，优选0.1-0.75ml。
[0144]疫苗的组分的免疫接种抗原优选是以药学可接受的载体存在，其适合于皮下、肌内以及还有皮内或透皮施用。施用的进一步模式经由粘膜通道例如经鼻或经口施用的免疫接种发挥作用。如果采用固体物质作为用于疫苗制剂的辅助剂，例如疫苗抗原的被吸附物或悬浮混合物将分别与辅助剂一起施用。在特定的实施方案中，疫苗作为水性溶剂中的溶液或液体疫苗存在。
[0145]优选地，肿瘤疫苗的免疫接种单元已在合适的即可使用的注射器或安瓿中提供。所述疫苗的稳定制剂可以有利地以即可使用的形式投放市场。尽管并不一定需要防腐剂如硫柳汞或具有改善的耐受性的其他防腐剂的组分，但为了从冷冻温度升至室温的储存温度下的较长的稳定性，它可提供于制剂中。但是依照本发明的疫苗也可以以冷冻或冻干形式提供，并且也可按要求分别被解冻或重构。
[0146]在依照本发明的特定情况下，本发明的疫苗的免疫原性可通过采用佐剂而增加。出于这个目的，使用固体物质或液体疫苗佐剂，例如氢氧化招(Alu-Gel)或磷酸招、生长因子、淋巴因子、细胞因子如IL-2、IL-12、GM-CSF、Y干扰素或补体因子如C3d，其他脂质体制备物，又或者针对其免疫系统已经引起强烈的免疫应答的带有额外抗原的制剂，如破伤风类毒素、细菌毒素如假单胞菌外毒素和脂质A及脂多糖的衍生物。
[0147]在特定情况下，不需要采用额外佐剂，特别地，本文所描述的例子显示了 CTL应答的有效产生通过使用无任何额外佐剂 的本发明的纳米颗粒来实现(参见通常与一种或多种佐剂施用的游离肽)。这在特定环境下是非常有利的，因为一些佐剂被认为是有毒的，或者不适合人类使用。
[0148]下文作为例子呈现且不应解释为对于权利要求的范围的限制。
实施例[0149]实施例1-纳米颗粒的合成与表征
[0150]测试配体和它们的识别号给出如下(分子wt)；
[0151]SIINFEKL (963) (SEQ ID NO:2)
[0152]SIINFEKL-N- (CH2)2-SH (1021)
[0153]FLSIINFEKL-N-(CH2)2-SH (1280) (SEQ ID NO:3)
[0154]FLAAYSIINFEKL-N-(CH2)2-SH (1587) (SEQ ID NO:4)
[0155]AAYSIINFEKL-N-(CH2)2-SH (1325) (SEQ ID NO:5)
[0156]HS(CH2)2-CONH-SIINFEKL (1051)
[0157]HS(CH2)2-CONH-FLSIINFEKL (1309)
[0158]HS (CH2) 2-C0NH-FLAAYSIINFEKL (1616)
[0159]HS(CH2)2-CONH-AAYSIINFEKL (1356)
[0160]HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH_SIINFEKL (1471)
[0161 ] HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH-FLSIINFEKL (1732)
[0162]HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH_FLAAYS IINFEKL (2034)
[0163]HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH-AAYSIINFEKL (1774)
[0164]使用IOymole氯化金(Aldrich484385)、30 μ mole具有硫代乙接头的葡萄糖(GlcC2)和1.5 μ mole肽配体(变量1.5_3mg)合成测试NP。
[0165]使用下述方法:将1.5 μ mole肽溶于2ml甲醇中，接着加入在200 μ I甲醇中的30 μ mole GlcC2和116 μ I含10 μ mole Au的水氯化金。将该样品涡旋30秒，振荡约5分钟，然后在快速涡旋共30秒时加入200 μ I的IM NaBH4,密封试管，然后轻柔振荡1.5小时。
[0166]将样品在工作台上旋转除去上清液并将黑色团块溶于2ml水中，然后将其转移至IOkDa vivaspin,并用2ml水洗漆4次,每次在5Krpm8分钟。将纳米颗粒(NP)从vivaspins移出，用水制成500 μ 1，它们接着接受15Krpm工作台旋转以除去任何大的聚集物。
[0167]内部分析显示旋转/生产后的金含量低于100%，产量将是1.97mg;
[0168]
【权利要求】
1.一种纳米颗粒，其包含: (i)包含金属和/或半导体原子的核； (ii)包含共价连接至所述核的多个配体的冠，其中所述多个中的至少第一配体包含经由第一接头共价连接至所述核的碳水化合物部分或包含谷胱甘肽，并且其中所述多个中的至少第二配体包含经由第二接头共价连接至所述核的所选肽，所述第二接头包含: 肽部分和非肽部分，其中所述第二接头的所述肽部分包含序列X1X2Z1，其中: X1为选自A和G的氨基酸； X2为选自A和G的氨基酸；和 Z1为选自Y和F的氨基酸。
2.根据权利要求1的纳米颗粒，其中第二接头的所述非肽部分包含C2-C15烷基和/或C2-C15 二醇。
3.根据权利要求1或权利要求2的纳米颗粒，其中所述第一配体和/或所述第二配体经由含硫基团、含氨基基团、含磷酸基团或含氧基团共价连接至核。
4.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其中所述第二接头的所述肽部分包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成:
(i)AAY;和
(ii)FLAAY (SEQ ID NO:1)。
5.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其中所述第二接头选自:
(i)HS-(CH2)2-CONH-AAy;
(ii)HS-(CH2) 2-C0NH-FLAAY;
(iii)HS-(CH2) 3-CONH-AAY;
(iv)HS- (CH2) 3-CONH-FLAAY;
(V) HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH_AAY;和
(vi) HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH_FLAAY， 其中所述第二接头经由所述接头的非肽部分的硫醇基团共价连接至所述核。
6.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其中所述所选肽经由其N-末端连接至所述第二接头的所述肽部分。
7.根据权利要求6的纳米颗粒，其中所述第二配体选自:
(i)HS- (CH2) 2-C0NH-AAYZ2;
(ii)HS-(CH2) 2-C0NH-FLAAYZ2;
(iii)HS-(CH2) 3-C0NH-AAYZ2;
(iv)HS- (CH2) 3-C0NH-FLAAYZ2;
(V) HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH_AAYZ2;和
(vi) HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH_FLAAYZ2， 其中Z2代表所述所选肽。
8.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其中所述所选肽是与主要组织相容性复合体(MHC)I类分子结合的表位肽，或者其能够经过加工从而结合于MHC I类分子。
9.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其中所述所选肽由8至40个氨基酸残基的序列组成。
10.根据权利要求9的纳米颗粒，其中所述所选肽由8至12个氨基酸残基的序列组成。
11.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其中所选肽是能够被MHCI类分子呈递从而刺激细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的表位肽。
12.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其中所选肽形成肿瘤相关抗原(TAA)或病毒_、细菌_、或寄生虫相关的抗原的至少一部分或者来自肿瘤相关抗原(TAA)或病毒_、细菌_、或寄生虫相关的抗原。
13.根据权利要求12的纳米颗粒，其中所述TAA是肺癌抗原。
14.根据权利要求13的纳米颗粒，其中所述肺癌选自:小细胞肺癌和任何非小细胞肺癌,任选地,其中所述非小细胞肺癌包括腺癌。
15.根据权利要求12的纳米颗粒，其中所述病原体相关的抗原是病毒、细菌或寄生虫抗原。
16.根据权利要求1至11中任一项的纳米颗粒，其中所述的所选肽来自卵白蛋白(OVA)0
17.根据权利要求16的纳米颗粒，其中所选肽包含氨基酸序列SIINFEKL(SEQID NO:2)或由氨基酸序列SIINFEKL (SEQ ID NO:2)组成。
18.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其中: (i)所述第一配体的碳水化合物部分包含单糖和/或二糖；和/或 (ii)所述多个配体包含经由谷胱甘肽硫原子共价连接至所述纳米颗粒的核的至少一个谷胱甘肽配体；和/或 (iii)所述多个配体包含: (a)葡萄糖； (b)N-乙酰氨基葡萄糖； (C)谷胱甘肽； Cd)葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖； (e)葡萄糖和谷胱甘肽； (f)N-乙酰氨基葡 萄糖和谷胱甘肽；或 (g)葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖和谷胱甘肽。
19.根据权利要求18(i)的纳米颗粒，其中所述碳水化合物部分包含葡萄糖、甘露糖、海藻糖和/或N-乙酰氨基葡萄糖。
20.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其中所述第一接头包含C2-C15烷基和/或 C2-C15 二醇。
21.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其中所述第一配体包含经由硫醇硫原子共价附着至核的2’ -硫乙基-β -D-吡喃葡萄糖苷或2’ -硫乙基-a -D-吡喃葡萄糖苷。
22.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含至少10、至少20、至少30、至少40或至少50个含碳水化合物的配体和/或谷胱甘肽配体。
23.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含至少1、至少2、至少3、至少4、或至少5个的含目的肽的配体。
24.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其中含碳水化合物的配体和/或谷胱甘肽配体与含目的肽的配体的摩尔比的范围为5:1至100:1。
25.根据权利要求24的纳米颗粒，其中含碳水化合物的配体和/或谷胱甘肽配体与含目的肽的配体的摩尔比的范围为10:1至30:1。
26.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的核的直径的范围为Inm 至 5nm。
27.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包括其配体的直径的范围为5nm至20nm,任选地5nm至15nm,或8nm至10nm。
28.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其中所述核包含选自下述的金属:Au、Ag、Cu、Pt、Pd、Fe、Co、Gd、Zn 或其任何组合。
29.根据权利要求28的纳米颗粒,其中所述核包含选自下述的钝态金属:Au、Ag、Pt、Pd、Cu或其任何组合。
30.根据权利要求29的纳米颗粒,其中所述核包含选自下述的金属的组合:Au/Fe、Au/Ag、Au/Cu、Au/Ag/Cu、Au/Pt、Au/Pd、Au/Ag/Cu/Pd、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/Gd 和 Au/Fe/Cu/Gd。
31.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其中所述核是磁性的。
32.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其中所述核进一步包含选自下述的NMR活性原子:Mn2+、Gd3+、Eu2+、Cu2+、V2+、Co2+、Ni2+、Fe2+、Fe3+ 和镧系元素 3+。
33.根据前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其中所述核包含半导体。
34.根据权利要求33的纳米颗粒，其中所述半导体选自:硒化镉、硫化镉、碲化镉和硫化锌。
35.根据权利要求33或权利要求34的纳米颗粒，其中所述核能够作为量子点。
36.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含至少两个含所选肽的配体，并且其中至少两个含所选肽的配体各自的所述所选肽不同。
37.根据权利要求36的纳米颗粒，其中所述至少两个含所选肽的配体的所选肽各自形成一种或多种TAA的至少一部分或各自来自一种或多种TAA。
38.根据权利要求37的纳米颗粒，其中所述至少两个含所选肽的配体的所选肽各自形成不同的肺癌TAA的至少一部分或各自来自不同的肺癌TAA。
39.一种组合物，其包含如前述权利要求中任一项所定义的多个纳米颗粒。
40.根据权利要求39的组合物，其进一步包含至少一种药学可接受的载体、盐和/或稀释剂。
41.根据权利要求39或权利要求40的组合物，其中所述组合物包含具有第一含所选肽的配体的第一种类纳米颗粒和具有第二含所选肽的配体的第二种类纳米颗粒，其中所述第一和第二种类的所选肽不同。
42.根据权利要求41的组合物，其中所述第一和第二种类纳米颗粒各自的所选肽形成一种或多种TAA的至少一部分或者各自来自一种或多种TAA。
43.根据权利要求42的组合物，其中所述第一和第二种类纳米颗粒各自的所选肽各自形成不同的肺癌TAA的至少一部分或者各自来自不同的肺癌TAA。
44.根据权利要求41至43中任一项的组合物，其包含至少3、至少4、至少5或至少10个不同种类的纳米颗粒 的库，各个种类具有不同的所选肽。
45.根据权利要求39至44中任一项的组合物，其进一步包含至少一种佐剂。
46.根据权利要求45的组合物，其中所述佐剂共价附着至至少一个纳米颗粒的核。
47.根据权利要求45或权利要求46的组合物，其中所述佐剂包含(S)-(2，3-双(棕榈酰氧基)_(2RS)_丙基)-N-棕榈酰基-(R)-半胱氨酸-(S)-丝氨酸(S)-赖氨酸4-OH( “Pam3Cys”)。
48.根据权利要求39至44中任一项的组合物，其中所述组合物基本上不含佐剂或由纳米颗粒提供唯一的佐剂功效。
49.一种疫苗，其包含权利要求39至48中任一项所定义的组合物。
50.根据权利要求49的疫苗，其中所述疫苗用于癌症的治疗性或预防性处理。
51.根据权利要求50的疫苗，其中所述癌症是肺癌。
52.根据权利要求51的疫苗，其中所述肺癌选自:小细胞肺癌和任何非小细胞肺癌，任选地，其中所述非小细胞肺癌包含腺癌。
53.根据I至38中任一项所定义的纳米颗粒，根据39至48中任一项所定义的组合物或者根据49至52中任一项所定义的疫苗，用于在药物中使用。
54.根据I至38中任一项所定义的纳米颗粒，根据39至48中任一项所定义的组合物或者根据49至52中任一项所定义的疫苗，用于在处理哺乳动物受试者中的癌症或病原体感染的方法中使用。
55.根据I至38中任一项所定义的纳米颗粒，根据39至48中任一项所定义的组合物或者根据49至52中任一项所定义的疫苗，用于在处理哺乳动物受试者中的肺癌的方法中使用。
56.在根据权利要求55的方法中使用的纳米颗粒、组合物或疫苗，其中所述肺癌选自:小细胞肺癌和任何非小细胞肺癌，任选地，其中所述非小细胞肺癌包含腺癌。
57.根据I至38中任一项所定义的纳米颗粒、根据39至48中任一项所定义的组合物或者根据49至52中任一项所定义的疫苗在制备用于在处理哺乳动物受试者中的癌症或病原体感染的药物中的用途。
58.根据I至38中任一项所定义的纳米颗粒、根据39至48中任一项所定义的组合物或者根据49至52中任一项所定义的疫苗在制备用于处理哺乳动物受试者中的肺癌的药物中的用途。
59.根据权利要求58的用途,其中所述肺癌选自:小细胞肺癌和任何非小细胞肺癌,任选地，其中所述非小细胞肺癌包含腺癌。
60.根据权利要求53至56中任一项的纳米颗粒、组合物或疫苗，或者根据权利要求57至59中任一项的用途，其中所述纳米颗粒、组合物、疫苗或药物用于经由淋巴摄取的施用。
61.癌症或病原体感染的预防性或治疗性处理的方法，其包含对有此需要的哺乳动物受试者施用预防或治疗足够量的根据I至38中任一项所定义的纳米颗粒、根据39至48中任一项所定义的组合物、根据49至52中任一项所定义的疫苗。
62.根据权利要求61的方法，其中所述癌症是肺癌。
63.根据权利要求61或权利要求62的方法，其中所述肺癌选自:小细胞肺癌和任何非小细胞肺癌，任选地，其中所述非小细胞肺癌包括腺癌。
64.根据权利要求61至63中任一项的方法，其中所述纳米颗粒、组合物或疫苗施用于用于淋巴摄取的位点。
65.一种产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的体外或体内方法，其包含: (i)使至少一种抗原呈递细胞(APC)与权利要求1至38中任一项所定义的至少一种纳米颗粒接触，从而使得所述所选肽被呈递到所述APC的MHC I类分子上；和 (ii)使所述至少一个(i)中的APC与至少一个CTL细胞接触，从而使得所述CTL细胞由所述APC激活以产生对所述所选肽特异性的CTL应答，其中所述所选肽是表位肽。
66.根据权利要求65的体外方法，其中所述APC是在所述纳米颗粒存在下进行培养，并且同时或相继地，与所述CTL细胞共培养。
67.根据权利要求66的方法，其中所述APC在与纳米颗粒接触后、与所述CTL细胞共培养前接受洗涤步骤。
68.根据权利要求67的方法，其进一步包含对哺乳动物受试者施用CTL细胞。
69.根据权利要求65的体内方法，其中所述纳米颗粒由选自下述的施用途径递送: 在淋巴摄取的位点或其附近向哺乳动物受试者的器官或组织中注射； 经由喷雾或凝胶的鼻腔递送； 经由喷雾或凝胶或口服可溶解薄膜的颊递送； 经由可溶解薄膜的口腔递送； 经由掺入纳米颗粒的贴片的透皮递送；和 包含纳米颗粒的组合物的吸入递送。
70.根据权利要求65至69中任一项的方法，其中所述至少一个纳米颗粒包含具有不同所选肽的纳米颗粒的库。
71.根据权利要求65至66中任一项的方法,其中所述CTL应答包含一种或多种细胞因子的生产。
72.根据权利要求71的方法，其中所述一种或多种细胞因子包含干扰素Y(IFN-Y)0
73.制造根据权利要求1至38中任一项的纳米颗粒的方法，其包含: 衍生具有第一接头的所述碳水化合物； 衍生具有第二接头的所述所选肽；和 使第一接头-衍生的碳水化合物和第二接头-衍生的所选肽与反应物反应，用于制造纳米颗粒的核，使得在纳米颗粒的自组装过程中，所述纳米颗粒核经由它们各自的接头附着碳水化合物和所选肽。
74.根据权利要求73的方法，其中所述反应混合物包含衍生的碳水化合物、衍生的所选肽、金属和/或半导体原子的盐以及还原剂以制造纳米颗粒。
75.根据权利要求74的方法，其中包括纳米颗粒的所述反应产物，接受纯化步骤以除去未反应的游离肽，任选地，其中所述纯化步骤包含使所述反应产物通过G-50Sephadex?柱。
76.根据权利要求73至75中任一项的方法，其进一步包含以至少一种药学可接受的载体、盐或稀释剂将所述纳米颗粒配制成组合物的步骤。
77.根据权利要求73至76中任一项的方法，其中所述方法是用于将所述所选肽经由所述第二接头附着至所述纳米颗粒，从而使得具有所附着的所选肽的纳米颗粒能够被细胞内化。
78.根据权利要求77的方法，其中所述方法是用于将所述所选肽经由所述第二接头附着至所述纳米颗粒，从而使得具有所附着的所选肽的纳米颗粒能够被抗原呈递细胞(APC)内化。
79.一种用于所选肽的 细胞内递送的方法，其包含使细胞与权利要求1至38中任一项所定义的纳米颗粒或权利要求39至48中任一项所定义的组合物接触。
80.权利要求1至38中任一项所定义的纳米颗粒或权利要求39至48中任一项所定义的组合物用于所选肽的细胞内递送中的用途。
【文档编号】A61K47/48GK103917249SQ201280049979
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2012年9月7日 优先权日:2011年9月7日
【发明者】T·雷德梅彻尔, P·威廉姆斯 申请人:Mida科技有限公司